本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地涉及能夠識別衍生自RHAMM抗原多肽的T細胞受體(Tcellreceptor,TCR)。本發(fā)明還涉及所述受體的制備和用途。
背景技術(shù)：
：僅僅有兩種類型的分子能夠以特異性的方式識別抗原。其中一種是免疫球蛋白或抗體；另一種是T細胞受體(TCR)，它是由α鏈/β鏈或者γ鏈/δ鏈以異二聚體形式存在的細胞膜表面的糖蛋白。免疫系統(tǒng)的TCR總譜的組成是在胸腺中通過V(D)J重組，然后進行陽性和陰性選擇而產(chǎn)生的。在外周環(huán)境中，TCR介導(dǎo)了T細胞對主組織相容性復(fù)合體-肽復(fù)合物(pMHC)的特異性識別，因此其對免疫系統(tǒng)的細胞免疫功能是至關(guān)重要的。TCR是呈遞在主組織相容性復(fù)合體(MHC)上的特異性抗原肽的唯一受體，這種外源肽或內(nèi)源肽可能會是細胞出現(xiàn)異常的唯一跡象。在免疫系統(tǒng)中，通過抗原特異性的TCR與pMHC復(fù)合物的結(jié)合引發(fā)T細胞與抗原呈遞細胞(APC)直接的物理接觸，然后T細胞及APC兩者的其他細胞膜表面分子就發(fā)生相互作用，這就引起了一系列后續(xù)的細胞信號傳遞和其他生理反應(yīng)，從而使得不同抗原特異性的T細胞對其靶細胞發(fā)揮免疫效應(yīng)。與TCR相對應(yīng)的MHCI類和II類分子配體也是免疫球蛋白超家族的蛋白質(zhì)但對于抗原的呈遞具有特異性，不同的個體有不同的MHC，從而能呈遞一種蛋白抗原中不同的短肽到各自的APC細胞表面。人類的MHC通常稱為HLA基因或HLA復(fù)合體。RHAMM是一種內(nèi)源性抗原，在細胞內(nèi)生成后被降解成小分子多肽，并與MHC(主組織相容性復(fù)合體)分子結(jié)合形成復(fù)合物，被呈遞到細胞表面。ILSLELMKL(165-173)是衍生自RHAMM的短肽(GreinerJ,etal.,Blood2005,106(3):938-945)。研究顯示，RHAMM在多種腫瘤組織中均有表達，以白血病(GreinerJ,etal.,Experimentalhematology2002,30(9):1029-1035)、結(jié)腸癌(YamadaY,etal.,Japanesejournalofcancerresearch:Gann1999,90(9):987-992)、乳腺癌(WangC,etal.,Clinicalcancerresearch:anofficialjournaloftheAmericanAssociationforCancerResearch1998,4(3):567-576)較為突出，在其他的癌癥，如胃癌(LiH,etal.,Internationaljournalofoncology2000,17(5):927-932)、腎癌(GreinerJ,etal.,Experimentalhematology2002,30(9):1029-1035)、口腔鱗狀細胞癌(YamanoY,etal.,Internationaljournalofoncology2008,32(5):1001-1009)、頭頸部鱗狀細胞癌(SchmittA,etal.,Internationaljournalofoncology2009,34(3):629-639)等腫瘤細胞中也均有表達。腫瘤細胞的HLA分子呈遞包括ILSLELMKL在內(nèi)的源自于RHAMM的短肽。因此，ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物提供了一種TCR可靶向腫瘤細胞的標記。能夠結(jié)合ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的TCR對腫瘤的治療具有很高的應(yīng)用價值。例如，能夠靶向該腫瘤細胞標記的TCR可用于將細胞毒性劑或免疫刺激劑遞送到靶細胞，或被轉(zhuǎn)化入T細胞，使表達該TCR的T細胞能夠破壞腫瘤細胞，以便在被稱為過繼免疫治療的治療過程中給予患者。對于前一目的，理想的TCR是具有較高的親和力的，從而使該TCR能夠長期駐留在所靶向的細胞上面。對于后一目的，則優(yōu)選使用中等親和力的TCR。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于開發(fā)可用于滿足不同目的的靶向腫瘤細胞標記的TCR。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物具有較高親和力的TCR。本發(fā)明的再一目的是提供一種上述類型TCR的制備方法及上述類型TCR的用途。本發(fā)明的第一方面，提供了一種T細胞受體(TCR)，其具有結(jié)合ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的活性。在另一優(yōu)選例中，所述T細胞受體，具有結(jié)合ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的特性。在另一優(yōu)選例中，所述TCR包含α鏈可變域和β鏈可變域，TCRα鏈可變域包含3個CDR區(qū)，所述TCRα鏈可變域的3個CDR區(qū)的基準序列如下，CDR1α：DRVSQSCDR2α：IYSNGDCDR3α：AATNSGYALN，并且含有至少一個下列突變：突變前的殘基突變后的殘基CDR1α的第2位RI、K或MCDR1α的第3位VY或LCDR1α的第4位SNCDR1α的第6位SACDR2α的第1位ILCDR2α的第3位SRCDR2α的第4位NGCDR2α的第6位DS或TCDR3α的第5位SDCDR3α的第7位YICDR3α的第8位AH、I、V或LCDR3α的第9位LF、M或I在另一優(yōu)選例中，TCRβ鏈可變域包含3個CDR區(qū)，所述TCRβ鏈可變域的3個CDR區(qū)的基準序列如下，CDR1β：GTSNPNCDR2β：SVGIGCDR3β：AWSVDGAEQY，并且含有至少一個下列突變：在另一優(yōu)選例中，所述TCRα鏈可變域CDR區(qū)的突變個數(shù)為3個或4個或6個或7個或8個或9個或11個。在另一優(yōu)選例中，所述TCRβ鏈可變域CDR區(qū)的突變個數(shù)為2個或3個或5個或6個或7個或8個或9個。在另一優(yōu)選例中，所述TCR包含TCRα鏈可變域和TCRβ鏈可變域，所述TCRβ鏈可變域包括CDR1β、CDR2β、和CDR3β，其中,所述CDR3β包含序列:DGAEQY，并且長度為10個氨基酸殘基。在另一優(yōu)選例中，所述DGAEQY,位于所述CDR3β的第5-10位。在另一優(yōu)選例中，所述CDR3β包含序列：[3βX1][3βX2]S[3βX3]DGAEQY,其中，[3βX1]、[3βX2]、[3βX3]獨立地選自任意的天然氨基酸殘基。在另一優(yōu)選例中，所述[3βX1]為A或S。在另一優(yōu)選例中，所述[3βX2]為W或Y。在另一優(yōu)選例中，所述[3βX3]為V或L。在另一優(yōu)選例中，所述CDR3β包含選自下組的序列：AWSVDGAEQY、SYSLDGAEQY和AWSLDGAEQY。在另一優(yōu)選例中，所述CDR2β包含序列:SVG。在另一優(yōu)選例中，所述CDR2β包含序列：SVG[2βX1][2βX2],其中，[2βX1]、[2βX2]獨立地選自任意的天然氨基酸殘基。在另一優(yōu)選例中，所述[2βX1]為I或V。在另一優(yōu)選例中，所述[2βX2]為G或R。在另一優(yōu)選例中，所述CDR2β包含選自下組的序列：SVGIG和SVGVR。在另一優(yōu)選例中，所述CDR1β包含選自下組的序列：PHSPRL(較佳地)、LDDLRI(較佳地)、LRYIRA(較佳地)、LSNTRA和GTSNPN。在另一優(yōu)選例中，所述TCRα鏈可變域包括CDR1α、CDR2α、和CDR3α。在另一優(yōu)選例中，所述CDR3α包含序列:AATN，并且所述CDR3α長度為8-13個氨基酸，優(yōu)選為10個氨基酸。在另一優(yōu)選例中，所述CDR3α包含序列：AATN[3αX1]G[3αX2]S[3αX3][3αX4]N,其中，[3αX1]、[3αX2]、[3αX3]獨立地選自任意的天然氨基酸殘基。在另一優(yōu)選例中，所述[3αX1]為S或D。在另一優(yōu)選例中，所述[3αX2]為Y或I。在另一優(yōu)選例中，所述[3αX3]為A、I、H或V。在另一優(yōu)選例中，所述CDR3α包含選自下組的序列：AATNDGIIIN(較佳地)、AATNDGILIN(較佳地)、AATNDGYHMN(較佳地)、AATNDGYVMN(較佳地)、AATNSGYALNAATNDGIHIN、和AATNDGIIFN。在另一優(yōu)選例中，所述CDR2α包含序列：[2αX1]Y[2αX2][2αX3]G[2αX4],其中，[2αX1]、[2αX2]、[2αX3]、[2αX4]獨立地選自任意的天然氨基酸殘基。在另一優(yōu)選例中，所述[2αX1]為I或L。在另一優(yōu)選例中，所述[2αX2]為S或R。在另一優(yōu)選例中，所述[2αX3]為N或G。在另一優(yōu)選例中，所述[2αX4]為D、S或T。在另一優(yōu)選例中，所述CDR2α包含選自下組的序列：IYRNGT(較佳地)、LYRGGS(較佳地)、和IYSNGD。在另一優(yōu)選例中，所述CDR1α包含序列：D[1αX1][1αX2][1αX3]Q[1αX4],其中，[1αX1]、[1αX2]、[1αX3]、[1αX4]獨立地選自任意的天然氨基酸殘基。在另一優(yōu)選例中，所述[1αX1]為I、M、K、或R。在另一優(yōu)選例中，所述[1αX2]為Y、L或V。在另一優(yōu)選例中，所述[1αX3]為N、或S。在另一優(yōu)選例中，所述[1αX4]為S或A。在另一優(yōu)選例中，所述CDR1α包含選自下組的序列：DIYNQS(最佳地)、DIYNQA(較佳地)、DKLNQS、DMLNQS(較佳地)、和DRVSQS。在另一優(yōu)選例中，所述TCR的TCRα鏈可變域不同時包含如下CDR：CDR1α：DRVSQS；CDR2α：IYSNGD；和CDR3α：AATNSGYALN。在另一優(yōu)選例中，所述TCR的TCRβ鏈可變域不同時包含如下CDR：CDR1β：GTSNPN；CDR2β：SVGIG；和CDR3β：AWSVDGAEQY。在另一優(yōu)選例中，所述TCR具有選自下組的CDR：在另一優(yōu)選例中，所述TCR在SEQIDNO：36所示的α鏈可變域中發(fā)生突變，所述突變的氨基酸殘基位點包括28R、29V、30S、32S、50I、52S、53N、55D、94S、96Y、97A或98L中的一個或多個，其中，氨基酸殘基編號采用SEQIDNO:36所示的編號；在另一優(yōu)選例中，所述TCR在SEQIDNO：37所示的β鏈可變域中發(fā)生突變，所述突變的氨基酸殘基位點包括27G、28T、29S、30N、31P、32N、53I、54G、92A、93W或95V中的一個或多個，其中，氨基酸殘基編號采用SEQIDNO:37所示的編號。在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明突變后的所述TCRα鏈可變域包括選自下組的一個或多個氨基酸殘基：28I、28K、或28M；29Y或29L；30N；32A；50L；52R；53G；55S或55T；94D；96I；97H、97I、97V或97L；98M、98I或98F；其中，氨基酸殘基編號采用SEQIDNO:36所示的編號；在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明突變后的所述TCRβ鏈可變域包括選自下組的一個或多個氨基酸殘基：27P或27L；28H、28S、28R或28D；29N、29Y或29D；30P、30T、30I或30L；31R；32L、32A或32I；53V；54R；92S；93Y；95L；其中，氨基酸殘基編號采用SEQIDNO:37所示的編號。在另一優(yōu)選例中，所述TCR是αβ異質(zhì)二聚TCR，所述TCR的α鏈可變域包含與SEQIDNO:36所示的氨基酸序列有至少90％(優(yōu)選地，至少92％；更優(yōu)選地，至少94％；最優(yōu)選地，至少96％)的序列同源性的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述TCR是αβ異質(zhì)二聚TCR，所述TCR的β鏈可變域包含與SEQIDNO:37所示的氨基酸序列有至少90％(優(yōu)選地，至少92％；更優(yōu)選地，至少94％；最優(yōu)選地，至少97％)的序列同源性的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述TCR包含(ⅰ)除其跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRα鏈，和(ⅱ)除其跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRβ鏈，其中(ⅰ)和(ⅱ)均包含TCR鏈的可變域和至少一部分恒定域。在另一優(yōu)選例中，所述TCR的α鏈可變域氨基酸序列選自：SEQIDNO:40-56；在另一優(yōu)選例中，所述TCR的β鏈可變域氨基酸序列選自：SEQIDNO:57-69。在另一優(yōu)選例中，所述TCR是αβ異質(zhì)二聚TCR，所述TCR的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間含有人工鏈間二硫鍵。在另一優(yōu)選例中，在所述TCR的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間形成人工鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基取代了選自下列的一組或多組位點：TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸；TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的61位氨基酸；TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位氨基酸；或TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸。在另一優(yōu)選例中，α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間含有人工鏈間二硫鍵的TCR包含α鏈可變域和β鏈可變域以及除跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分β鏈恒定域，但其不包含α鏈恒定域，所述TCR的α鏈可變域與β鏈形成異質(zhì)二聚體。在另一優(yōu)選例中，所述TCR為αβ異質(zhì)二聚TCR，其包含(ⅰ)除其跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRα鏈，和(ⅱ)除其跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRβ鏈，其中(ⅰ)和(ⅱ)均包含TCR鏈的可變域和至少一部分恒定域，α鏈恒定區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間含有人工鏈間二硫鍵。在另一優(yōu)選例中，在所述TCRα與β鏈的恒定區(qū)之間形成人工鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基取代了選自下列的一組或多組位點：TRAC*01外顯子1的Thr48和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57；TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser77；TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser17；TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Asp59；TRAC*01外顯子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu15；TRAC*01外顯子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser54；TRAC*01外顯子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ala19；和TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu20。在另一優(yōu)選例中，所述TCR是單鏈TCR。在另一優(yōu)選例中，所述TCR是由α鏈可變域和β鏈可變域組成的單鏈TCR，所述α鏈可變域和β鏈可變域由一柔性短肽序列(linker)連接。在另一優(yōu)選例中，所述TCR的疏水芯發(fā)生突變。在另一優(yōu)選例中，所述TCR的α鏈可變域包含與SEQIDNO：3所示的氨基酸序列有至少90％(優(yōu)選地，至少92％；更優(yōu)選地，至少94％；最優(yōu)選地，至少96％；如，可以是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同源性)同源性的氨基酸序列；在另一優(yōu)選例中，所述TCR的β鏈可變域包含與SEQIDNO：4所示的氨基酸序列有至少90％(優(yōu)選地，至少92％；更優(yōu)選地，至少94％；最優(yōu)選地，至少97％；如，可以是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同源性)同源性的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述TCR的疏水芯突變發(fā)生在SEQIDNO:36所示α鏈可變域選自下組的一個或多個氨基酸殘基位點：19A、21L和79S；其中，氨基酸殘基編號采用SEQIDNO:36所示的編號。在另一優(yōu)選例中，所述TCR的疏水芯突變發(fā)生在SEQIDNO:37所示β鏈可變域選自下組的一個或多個氨基酸殘基位點：13Q、19L、64L、78S和81L，其中，氨基酸殘基編號采用SEQIDNO:37所示的編號。在另一優(yōu)選例中，疏水芯突變后的所述TCR的α鏈可變域包括選自下組的一個或多個氨基酸殘基：19V、21I和79I；其中，氨基酸殘基編號采用SEQIDNO:36所示的編號；在另一優(yōu)選例中，疏水芯突變后的所述TCR的β鏈可變域包括選自下組的一個或多個氨基酸殘基：13V、19V、64Y、78I和81V；其中，氨基酸殘基編號采用SEQIDNO:37所示的編號。在另一優(yōu)選例中，所述TCR的α鏈可變域氨基酸序列選自：SEQIDNO:6-22；在另一優(yōu)選例中，所述TCR的β鏈可變域氨基酸序列選自：SEQIDNO:23-35。在另一優(yōu)選例中，所述TCR是可溶的。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述TCR對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的結(jié)合親和力是野生型TCR對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的結(jié)合親和力的至少2倍；優(yōu)選地至少5倍；更優(yōu)選地，至少10倍。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述TCR對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的結(jié)合親和力是野生型TCR對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的結(jié)合親和力的至少100倍；優(yōu)選地至少103倍；更優(yōu)選地，至少104倍；最優(yōu)選地，本發(fā)明TCR對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的結(jié)合親和力是野生型TCR對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的結(jié)合親和力的105-106倍。在另一優(yōu)選例中，所述TCR對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的解離平衡常數(shù)KD≤100μM；優(yōu)選地，10μM≤KD≤100μM；更優(yōu)選地，1μM≤KD≤10μM。在另一優(yōu)選例中，所述TCR對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的解離平衡常數(shù)KD≤1μM；優(yōu)選地，10nM≤KD≤1μM；更優(yōu)選地，100pM≤KD≤10nM。在另一優(yōu)選例中，所述TCR的α鏈和/或β鏈的C-或N-末端結(jié)合有偶聯(lián)物。在另一優(yōu)選例中，與所述TCR結(jié)合的偶聯(lián)物為可檢測標記物、治療劑、PK修飾部分或任何這些物質(zhì)的組合。在另一優(yōu)選例中，與所述TCR結(jié)合的治療劑為連接于所述TCR的α或β鏈的C-或N-末端的抗-CD3抗體。在另一優(yōu)選例中，所述與抗-CD3抗體結(jié)合的TCR的α鏈可變域氨基酸序列選自：SEQIDNO:6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55和56；和/或所述與抗-CD3抗體結(jié)合的TCR的β鏈可變域氨基酸序列選自：SEQIDNO:23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69。在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明具有高親和力的TCR與抗-CD3抗體融合分子的氨基酸序列優(yōu)選自：SEQIDNO:70-82。本發(fā)明的第二方面，提供了一種多價TCR復(fù)合物，包含至少兩個TCR分子，并且其中的至少一個TCR分子為本發(fā)明第一方面所述的TCR。本發(fā)明的第三方面，提供了一種核酸分子，所述核酸分子包含編碼本發(fā)明第一方面所述的TCR分子或者本發(fā)明第二方面所述的多價TCR復(fù)合物的核酸序列或其互補序列；本發(fā)明的第四方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發(fā)明第三方面所述的所述的核酸分子。本發(fā)明的第五方面，提供了一種宿主細胞，所述的宿主細胞中含有本發(fā)明第四方面所述的載體或染色體中整合有外源的本發(fā)明第三方面所述的核酸分子。本發(fā)明的第六方面，提供了一種分離的細胞，所述細胞表達本發(fā)明第一方面所述的TCR。本發(fā)明的第七方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物含有藥學(xué)上可接受的載體以及本發(fā)明第一方面所述的TCR、或本發(fā)明第二方面所述的TCR復(fù)合物、或本發(fā)明第六方面所述的細胞。本發(fā)明的第八方面，提供了一種治療疾病的方法，包括給需要治療的對象施用適量的本發(fā)明第一方面所述的TCR、或本發(fā)明第二方面所述的TCR復(fù)合物、或本發(fā)明第六方面所述的細胞、或本發(fā)明第七方面所述的藥物組合物。本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的TCR、或本發(fā)明第二方面所述的TCR復(fù)合物、或本發(fā)明第六方面所述的細胞的用途，用于制備治療腫瘤的藥物。本發(fā)明的第十方面，提供了一種制備本發(fā)明第一方面所述的T細胞受體的方法，包括步驟：(i)培養(yǎng)本發(fā)明第五方面所述的宿主細胞，從而表達本發(fā)明第一方面所述的T細胞受體；(ii)分離或純化出所述的T細胞受體。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1a和圖1b分別為本發(fā)明構(gòu)建的單鏈模板TCR的氨基酸序列和DNA序列。圖2a和圖2b分別為本發(fā)明構(gòu)建的單鏈模板TCR的α可變域的氨基酸序列和β鏈可變域的氨基酸序列。圖3為本發(fā)明構(gòu)建的單鏈模板TCR的連接短肽(linker)的氨基酸序列。圖4a-q分別顯示了對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物具有高親和力的單鏈TCR的α鏈可變域氨基酸序列，突變的殘基以加下劃線表示。圖5a-m分別顯示了對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物具有高親和力的單鏈TCR的β鏈可變域氨基酸序列，突變的殘基以加下劃線表示。圖6a和圖6b分別顯示了對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物能夠特異性結(jié)合的野生型TCRα與β鏈可變域氨基酸序列。圖7a和圖7b分別顯示了本發(fā)明中參比TCRα與β鏈的氨基酸序列。圖8a-q分別顯示了對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物具有高親和力的異質(zhì)二聚TCR的α鏈可變域氨基酸序列，突變的殘基以加下劃線表示。圖9a-m分別顯示了對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物具有高親和力的異質(zhì)二聚TCR的β鏈可變域氨基酸序列，突變的殘基以加下劃線表示。圖10a-m為高親和性單鏈TCR與抗-CD3抗體的融合分子的氨基酸序列。圖11為野生型TCR(即參比TCR)與對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的親和力曲線。圖12a和圖12b分別顯示了本發(fā)明中野生型TCRα與β鏈的氨基酸序列。圖13抗-CD3抗體與高親和性單鏈TCR的融合體介導(dǎo)的效應(yīng)細胞對抗原(RHAMM)的特異性反應(yīng)。圖14抗-CD3抗體與高親和性αβ異質(zhì)二聚TCR的融合體介導(dǎo)的效應(yīng)細胞對抗原(RHAMM)的特異性反應(yīng)。具體實施方式本發(fā)明通過廣泛而深入的研究，獲得一種識別ILSLELMKL短肽(衍生自RHAMM抗原)的高親和性T細胞受體(TCR)，所述ILSLELMKL短肽以肽-HLAA0201復(fù)合物的形式被呈遞。所述高親和性TCR在其α鏈可變域的3個CDR區(qū)CDR1α：DRVSQSCDR2α：IYSNGDCDR3α：AATNSGYALN中發(fā)生突變；和/或在其β鏈可變域的3個CDR區(qū)CDR1β：GTSNPNCDR2β：SVGIGCDR3β：AWSVDGAEQY中發(fā)生突變；并且，突變后本發(fā)明TCR對上述ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的親和力和/或結(jié)合半衰期是野生型TCR的至少2倍。在描述本發(fā)明之前，應(yīng)當理解本發(fā)明不限于所述的具體方法和實驗條件，因為這類方法和條件可以變動。還應(yīng)當理解本文所用的術(shù)語其目的僅在于描述具體實施方案，并且其意圖不是限制性的，本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求書限制。除非另外定義，否則本文中所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語均具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然在本發(fā)明的實施或測試中可以使用與本發(fā)明中所述相似或等價的任何方法和材料，本文在此處例舉優(yōu)選的方法和材料。術(shù)語T細胞受體(Tcellreceptor,TCR)可以采用國際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)(IMGT)來描述TCR。天然αβ異質(zhì)二聚TCR具有α鏈和β鏈。廣義上講，各鏈包含可變區(qū)、連接區(qū)和恒定區(qū)，β鏈通常還在可變區(qū)和連接區(qū)之間含有短的多變區(qū)，但該多變區(qū)常視作連接區(qū)的一部分。通過獨特的IMGT的TRAJ和TRBJ確定TCR的連接區(qū)，通過IMGT的TRAC和TRBC確定TCR的恒定區(qū)。各可變區(qū)包含嵌合在框架序列中的3個CDR(互補決定區(qū))，CDR1、CDR2和CDR3。在IMGT命名法中，TRAV和TRBV的不同編號分別指代不同Vα類型和Vβ的類型。在IMGT系統(tǒng)中，α鏈恒定結(jié)構(gòu)域具有以下的符號：TRAC*01，其中“TR”表示T細胞受體基因；“A”表示α鏈基因；C表示恒定區(qū)；“*01”表示等位基因1。β鏈恒定結(jié)構(gòu)域具有以下的符號：TRBC1*01或TRBC2*01，其中“TR”表示T細胞受體基因；“B”表示β鏈基因；C表示恒定區(qū)；“*01”表示等位基因1。α鏈的恒定區(qū)是唯一確定的，在β鏈的形式中，存在兩個可能的恒定區(qū)基因“C1”和“C2”。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過公開的IMGT數(shù)據(jù)庫可以獲得TCRα與β鏈的恒定區(qū)基因序列。本發(fā)明的TCR可變域(可變區(qū))的框架序列可以為鼠源的或人源的，優(yōu)選為人源的。TCR的α和β鏈一般看作各有兩個“結(jié)構(gòu)域”即可變域和恒定結(jié)構(gòu)域?？勺冇蛴蛇B接的可變區(qū)和連接區(qū)構(gòu)成。因此，在本申請的說明書和權(quán)利要求書中，“TCRα鏈可變域”指連接的TRAV和TRAJ區(qū)，同樣地，“TCRβ鏈可變域”指連接的TRBV和TRBD/TRBJ區(qū)。TCRα鏈可變域的3個CDR分別為CDR1α、CDR2α和CDR3α；TCRβ鏈可變域的3個CDR分別為CDR1β、CDR2β和CDR3β。TCR的恒定結(jié)構(gòu)域包含胞內(nèi)部分、跨膜區(qū)和胞外部分。為獲得可溶性TCR，以便測定TCR與ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物之間的親和力，本發(fā)明TCR優(yōu)選地不包含跨膜區(qū)。更優(yōu)選地，本發(fā)明TCR的氨基酸序列是指TCR的胞外氨基酸序列。本發(fā)明中所述“野生型TCR”的α鏈氨基酸序列及β鏈氨基酸序列分別為SEQIDNO:83和SEQIDNO：84，如圖12a和12b所示。本發(fā)明中所述“參比TCR”的α鏈氨基酸序列及β鏈氨基酸序列分別為SEQIDNO:38和SEQIDNO：39，如圖7a和7b所示。本發(fā)明中，能夠結(jié)合ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的野生型TCR的α與β鏈可變域氨基酸序列分別為SEQIDNO:36和SEQIDNO：37，如圖6a和6b所示。在本發(fā)明中，術(shù)語“本發(fā)明多肽”、“本發(fā)明的TCR”、“本發(fā)明的T細胞受體”可互換使用。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述TCR為非天然發(fā)生的TCR。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述TCR為重組的或分離的。本發(fā)明提供了一種T細胞受體(TCR)，所述TCR包含TCRα鏈可變域和TCRβ鏈可變域。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述TCRα鏈可變域包括：CDR1α:DRVSQS,CDR2α:IYSNGD,CDR3α:AATNSGYALN,所述TCRβ鏈可變域包括：CDR1β:GTSNPN，CDR2β:SVGIG，CDR3β:AWSVDGAEQY。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述TCR特異性結(jié)合ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述TCR在選自下組的一個或多個氨基酸殘基位點發(fā)生突變：CDR1α的第2位R殘基、第3位V殘基、第4位S殘基、第6位S殘基；CDR2α的第1位I殘基、第3位S殘基、第4位N殘基、第6位D殘基；CDR3α的第5位S殘基、第7位Y殘基、第8位A殘基、第9位L殘基；CDR1β的第1位G殘基、第2位T殘基、第3位S殘基、第4位N殘基、第5位P殘基、第6位N殘基；CDR2β的第4位I殘基、第5位G殘基；CDR3β的第1位A殘基、第2位W殘基、第3位V殘基；并且，所述TCR對所述ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的結(jié)合親和力是野生型TCR對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的結(jié)合親和力的至少2倍(優(yōu)選地，所述野生型是相對于突變后的所述TCR而言的，即突變之前的TCR)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述TCR包含選自下組的一個或多個突變：CDR1α的第2位R殘基突變?yōu)镮、K或M，第3位V殘基突變?yōu)閅、或L，第4位S殘基突變?yōu)镹，第6位S殘基突變?yōu)锳；CDR2α的第1位I殘基突變?yōu)長，第3位S殘基突變?yōu)镽，第4位N殘基突變?yōu)镚，第6位D殘基突變?yōu)镾、或T；CDR3α的第5位S殘基突變?yōu)镈，第7位Y殘基突變?yōu)镮，第8位A殘基突變?yōu)镠、I、V、或L，第9位L殘基突變?yōu)镸、I、或F；CDR1β的第1位G殘基突變?yōu)镻、或L，第2位T殘基突變?yōu)镠、S、R、或D，第3位S殘基突變?yōu)镹、Y、或D，第4位N殘基突變?yōu)镻、T、I、或L，第5位P殘基突變?yōu)镽，第6位N殘基突變?yōu)長、A、或I；CDR2β的第4位I殘基突變?yōu)閂、第5位G殘基突變?yōu)镽；CDR3β的第1位A殘基突變?yōu)镾、第2位W殘基突變?yōu)閅、第3位V殘基突變?yōu)長。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的T細胞受體(TCR)，包含TCRα鏈可變域和TCRβ鏈可變域，所述TCRβ鏈可變域包括CDR1β、CDR2β、和CDR3β，其中,所述CDR3β包含序列:DGAEQY，并且長度為10個氨基酸殘基。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述DGAEQY位于所述CDR3β的第5-10位。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述CDR3β包含序列：[3βX1][3βX2]S[3βX3]DGAEQY,其中，[3βX1]、[3βX2]、[3βX3]獨立地選自任意的天然氨基酸殘基。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述[3βX1]為A或S。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述[3βX2]為W或Y。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述[3βX3]為V或L。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述CDR3β包含選自下組的序列：AWSVDGAEQY、SYSLDGAEQY、和AWSLDGAEQY。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述CDR2β包含序列:SVG。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述CDR2β包含序列：SVG[2βX1][2βX2],其中，[2βX1]、[2βX2]獨立地選自任意的天然氨基酸殘基。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述[2βX1]為I或V。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述[2βX2]為G或R。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述CDR2β包含選自下組的序列：SVGIG、和SVGVR。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述CDR1β包含選自下組的序列：GTSNPN、LDDLRI(較佳地)、LRYIRA(較佳地)、LSNTRA和PHSPRL(較佳地)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的T細胞受體(TCR)，包含TCRα鏈可變域和TCRβ鏈可變域，所述TCRα鏈可變域包括CDR1α、CDR2α、和CDR3α。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述CDR3α包含序列:AATN，并且所述CDR3α長度為8-13個氨基酸，優(yōu)選為11個氨基酸。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述CDR3α包含序列：AATN[3αX1]G[3αX2]S[3αX3][3αX4]N,其中，[3αX1]、[3αX2]、[3αX3]獨立地選自任意的天然氨基酸殘基。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述[3αX1]為S或D。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述[3αX2]為Y或I。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述[3αX3]為A、I、H或V。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述CDR3α包含選自下組的序列：AATNDGIHIN、AATNDGIIFN、AATNDGIIIN(較佳地)、AATNDGILIN(較佳地)、AATNDGYHMN(較佳地)、AATNDGYVMN(較佳地)和AATNSGYALN。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述CDR2α包含序列：[2αX1]Y[2αX2][2αX3]G[2αX4],其中，[2αX1]、[2αX2]、[2αX3]、[2αX4]獨立地選自任意的天然氨基酸殘基。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述[2αX1]為I或L。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述[2αX2]為S或R。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述[2αX3]為N或G。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述[2αX4]為D、S或T。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述CDR2α包含選自下組的序列：IYRNGT(較佳地)、LYRGGS(較佳地)、和IYSNGD。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述CDR1α包含序列：D[1αX1][1αX2][1αX3]Q[1αX4],其中，[1αX1]、[1αX2]、[1αX3]、[1αX4]獨立地選自任意的天然氨基酸殘基。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述[1αX1]為I、M、K、或R。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述[1αX2]為Y、L或V。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述[1αX3]為N、或S。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述[1αX4]為S或A。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述CDR1α包含選自下組的序列：DIYNQS(最佳地，具有最高的親和力)、DIYNQA(較佳地)、DKLNQS、DMLNQS(較佳地)、和DRVSQS。本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的TCR，在TCRα鏈可變域的CDR1α位置氨基酸序列為DIYNQS時，其具有特別高的親和力。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的T細胞受體(TCR)，包含TCRα鏈可變域和TCRβ鏈可變域，并且TCRα鏈可變域的CDR1α包含序列：DIYNQS。在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述TCR的TCRα鏈可變域不同時包含如下CDR：CDR1α：DRVSQS；CDR2α：IYSNGD；和CDR3α：AATNSGYALN。在另一優(yōu)選例中，所述TCR的TCRβ鏈可變域不同時包含如下CDR：CDR1β：GTSNPN；CDR2β：SVGIG；和CDR3β：AWSVDGAEQY。天然鏈間二硫鍵與人工鏈間二硫鍵在天然TCR的近膜區(qū)Cα與Cβ鏈間存在一組二硫鍵，本發(fā)明中稱為“天然鏈間二硫鍵”。在本發(fā)明中，將人工引入的，位置與天然鏈間二硫鍵的位置不同的鏈間共價二硫鍵稱為“人工鏈間二硫鍵”。為方便描述，本發(fā)明中TRAC*01與TRBC1*01或TRBC2*01氨基酸序列的位置編號按從N端到C端依次的順序進行位置編號，如TRBC1*01或TRBC2*01中，按從N端到C端依次的順序第60個氨基酸為P(脯氨酸)，則本發(fā)明中可將其描述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Pro60，也可將其表述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸，又如TRBC1*01或TRBC2*01中，按從N端到C端依次的順序第61個氨基酸為Q(谷氨酰胺)，則本發(fā)明中可將其描述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Gln61，也可將其表述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位氨基酸，其他以此類推。本發(fā)明中，可變區(qū)TRAV與TRBV的氨基酸序列的位置編號，按照IMGT中列出的位置編號。如TRAV中的某個氨基酸，IMGT中列出的位置編號為46，則本發(fā)明中將其描述為TRAV第46位氨基酸，其他以此類推。本發(fā)明中，其他氨基酸的序列位置編號有特殊說明的，則按特殊說明。腫瘤術(shù)語“腫瘤”指包括所有類型的癌細胞生長或致癌過程，轉(zhuǎn)移性組織或惡性轉(zhuǎn)化細胞、組織或器官，不管病理類型或侵染的階段。腫瘤的實施例非限制性地包括：實體瘤，軟組織瘤，和轉(zhuǎn)移性病灶。實體瘤的實施例包括：不同器官系統(tǒng)的惡性腫瘤，例如肉瘤，肺鱗癌和癌癥。例如：感染的前列腺，肺，乳房，淋巴，腸胃(例如：結(jié)腸)，和生殖泌尿道(例如：腎臟，上皮細胞)，咽頭。肺鱗癌包括惡性腫瘤，例如，多數(shù)的結(jié)腸癌，直腸癌，腎細胞癌，肝癌，肺部的非小細胞癌，小腸癌和食道癌。上述癌癥的轉(zhuǎn)移性病變可同樣用本發(fā)明的方法和組合物來治療和預(yù)防。發(fā)明詳述眾所周知，TCR的α鏈可變域與β鏈可變域各含有3個CDR，類似于抗體的互補決定區(qū)。CDR3與抗原短肽相互作用，CDR1和CDR2與HLA相互作用。因此，TCR分子的CDR決定了其與抗原短肽-HLA復(fù)合物的相互作用。本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)能夠結(jié)合抗原短肽ILSLELMKL與HLAA0201復(fù)合物(即，ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物)的野生型TCR的α鏈可變域氨基酸序列與β鏈可變域氨基酸序列分別為SEQIDNO:36和SEQIDNO：37。其具有下列CDR區(qū)：α鏈可變域CDRCDR1α：DRVSQSCDR2α：IYSNGDCDR3α：AATNSGYALN和β鏈可變域CDRCDR1β：GTSNPNCDR2β：SVGIGCDR3β：AWSVDGAEQY。本發(fā)明通過對上述CDR區(qū)進行突變篩選，獲得了與ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的親和力是野生型TCR與ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物親和力至少2倍的高親和力TCR。本發(fā)明提供了一種T細胞受體(TCR)，其具有結(jié)合ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的活性。本發(fā)明的TCR包含α鏈可變域和β鏈可變域，TCRα鏈可變域包含3個CDR區(qū)和TCRβ鏈可變域包含3個CDR區(qū)，并且所述TCR在α鏈可變域的3個CDR區(qū)CDR1α：DRVSQSCDR2α：IYSNGDCDR3α：AATNSGYALN中含有至少一個下列突變：和/或所述TCR在β鏈可變域的3個CDR區(qū)CDR1β：GTSNPNCDR2β：SVGIGCDR3β：AWSVDGAEQY中含有至少一個下列突變：突變前的殘基突變后的殘基CDR1β的第1位GL或PCDR1β的第2位TS、H、R或DCDR1β的第3位SN、Y或DCDR1β的第4位NP、T、I或LCDR1β的第5位PRCDR1β的第6位NL、A或ICDR2β的第4位IVCDR2β的第5位GRCDR3β的第1位ASCDR3β的第2位WYCDR3β的第4位VL更詳細地，所述TCRα鏈CDR區(qū)的突變個數(shù)為3個或4個或6個或7個或8個或9個或11個；和/或所述TCRβ鏈CDR區(qū)的突變個數(shù)為2個或3個或5個或6個或7個或8個或9個。進一步，本發(fā)明所述TCR是αβ異質(zhì)二聚TCR，所述TCR的α鏈可變域包含與SEQIDNO:36所示的氨基酸序列有至少90％(如，可以是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同源性)的序列同源性的氨基酸序列；和/或所述TCR的β鏈可變域包含與SEQIDNO:37所示的氨基酸序列有至少90％(如，可以是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同源性)的序列同源性的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述TCR包含(ⅰ)除其跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRα鏈，和(ⅱ)除其跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRβ鏈，其中(ⅰ)和(ⅱ)均包含TCR鏈的可變域和至少一部分恒定域。本發(fā)明中野生型TCRα鏈可變域SEQIDNO：36的3個CDR即CDR1、CDR2和CDR3分別位于SEQIDNO：36的第27-32位、第50-55位和第90-99位。據(jù)此，氨基酸殘基編號采用SEQIDNO:36所示的編號，28R即為CDR1α的第2位R，29V即為CDR1α的第3位V，30S即為CDR1α的第4位S，32S即為CDR1α的第6位S，50I即為CDR2α的第1位I，52S即為CDR2α的第3位S，53N即為CDR2α的第4位N，55D即為CDR2α的第6位D，94S即為CDR3α的第5位S，96Y即為CDR3α的第7位Y，97A即為CDR3α的第8位A，98L即為CDR3α的第9位L。同理，本發(fā)明中野生型TCRβ鏈可變域SEQIDNO：37的3個CDR即CDR1、CDR2和CDR3分別位于SEQIDNO：37的第27-32位、第50-54位和第92-101位。因此，氨基酸殘基編號采用SEQIDNO:37所示的編號，27G即為CDR1β的第1位G，28T即為CDR1β的第2位T，29S即為CDR1β的第3位S，30N即為CDR1β的第4位N，31P即為CDR1β的第5位P，32N即為CDR1β的第6位N，53I即為CDR2β的第4位I，54G即為CDR2β的第5位G，92A即為CDR3β的第1位A，93W即為CDR3β的第2位W，95V即為CDR3β的第4位V。本發(fā)明提供具有結(jié)合ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的特性，并包含TCRα鏈可變域和TCRβ鏈可變域的TCR，其特征在于，所述TCR在SEQIDNO：36所示的α鏈可變域中發(fā)生突變，所述突變的氨基酸殘基位點包括28R、29V、30S、32S、50I、52S、53N、55D、94S、96Y、97A或98L中的一個或多個，其中，氨基酸殘基編號采用SEQIDNO:36所示的編號；和/或所述TCR在SEQIDNO：37所示的β鏈可變域中發(fā)生突變，所述突變的氨基酸殘基位點包括27G、28T、29S、30N、31P、32N、53I、54G、92A、93W或95V中的一個或多個，其中，氨基酸殘基編號采用SEQIDNO:37所示的編號。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，突變后的所述TCRα鏈可變域包括選自下組的一個或多個氨基酸殘基：28I、28K、或28M；29Y或29L；30N；32A；50L；52R；53G；55S或55T；94D；96I；97H、97I、97V或97L；98M、98I或98F；和/或突變后的所述TCRβ鏈可變域包括選自下組的一個或多個氨基酸殘基：27P或27L；28H、28S、28R或28D；29N、29Y或29D；30P、30T、30I或30L；31R；32L、32A或32I；53V；54R；92S；93Y；95L。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的定點突變的方法，將野生型TCRα鏈恒定區(qū)TRAC*01外顯子1的Thr48突變?yōu)榘腚装彼幔骆満愣▍^(qū)TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57突變?yōu)榘腚装彼?，即得到參比TCR，其氨基酸序列分別如圖7a和7b所示，突變后的半胱氨酸殘基以加粗字母表示。上述半胱氨酸取代能使參比TCR的α與β鏈的恒定區(qū)之間形成人工鏈間二硫鍵，以形成更加穩(wěn)定的可溶性TCR，從而能夠更加方便地評估TCR與ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物之間的結(jié)合親和力和/或結(jié)合半衰期。應(yīng)理解，TCR可變區(qū)的CDR區(qū)決定了其與pMHC復(fù)合物之間的親和力，因此，上述TCR恒定區(qū)的半胱氨酸取代并不會對TCR的結(jié)合親和力和/或結(jié)合半衰期產(chǎn)生影響。所以，在本發(fā)明中，測得的參比TCR與ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物之間的結(jié)合親和力即認為是野生型TCR與ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物之間的結(jié)合親和力，即本發(fā)明中所述的野生型TCR與ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物之間的結(jié)合親和力等同于參比TCR與ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物之間的結(jié)合親和力。同樣地，如果測得本發(fā)明TCR與ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物之間的結(jié)合親和力是參比TCR與ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物之間的結(jié)合親和力的至少10倍，即等同于本發(fā)明TCR與ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物之間的結(jié)合親和力是野生型TCR與ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物之間的結(jié)合親和力的至少10倍?？赏ㄟ^任何合適的方法測定結(jié)合親和力(與解離平衡常數(shù)KD成反比)和結(jié)合半衰期(表示為T1/2)。應(yīng)了解，TCR的親和力翻倍將導(dǎo)致KD減半。T1/2計算為In2除以解離速率(Koff)。因此，T1/2翻倍會導(dǎo)致Koff減半。優(yōu)選采用相同的試驗方案檢測給定TCR的結(jié)合親和力或結(jié)合半衰期數(shù)次，例如3次或更多，取結(jié)果的平均值。在優(yōu)選的實施方式中，采用本發(fā)明實施例中的表面等離振子共振(BIAcore)方法進行這些檢測。該方法檢測到參比TCR對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的解離平衡常數(shù)KD為270μM，本發(fā)明中即認為野生型TCR對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的解離平衡常數(shù)KD也為270μM。由于TCR的親和力翻倍將導(dǎo)致KD減半，所以若檢測到高親和力TCR對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的解離平衡常數(shù)KD為27μM，則說明該高親和力TCR對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的親和力是野生型TCR對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的親和力的10倍。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知KD值單位間的換算關(guān)系，即1μM＝1000nM，1nM＝1000pM。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，采用本發(fā)明優(yōu)選的檢測方式，所述TCR對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的結(jié)合親和力是野生型TCR對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的結(jié)合親和力的至少2倍；優(yōu)選地至少5倍；更優(yōu)選地，至少10倍。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，采用本發(fā)明優(yōu)選的檢測方式，所述TCR對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的結(jié)合親和力是野生型TCR對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的結(jié)合親和力的至少100倍；優(yōu)選地至少103倍；更優(yōu)選地，至少104倍；最優(yōu)選地，本發(fā)明TCR對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的結(jié)合親和力是野生型TCR對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的結(jié)合親和力的105-106倍。在另一優(yōu)選例中，采用本發(fā)明優(yōu)選的檢測方式，所述TCR對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的解離平衡常數(shù)KD≤100μM；優(yōu)選地，10μM≤KD≤100μM；更優(yōu)選地，1μM≤KD≤10μM。在另一優(yōu)選例中，采用本發(fā)明優(yōu)選的檢測方式，所述TCR對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的解離平衡常數(shù)KD≤1μM；優(yōu)選地，10nM≤KD≤1μM；更優(yōu)選地，100pM≤KD≤10nM?？刹捎萌魏魏线m的方法進行突變，包括但不限于依據(jù)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的那些、依據(jù)限制性酶的克隆或不依賴連接的克隆(LIC)方法。許多標準分子生物學(xué)教材詳述了這些方法。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)誘變和依據(jù)限制性酶的克隆的更多細節(jié)可參見Sambrook和Russell,(2001)分子克隆-實驗室手冊(MolecularCloning-ALaboratoryManual)(第三版)CSHL出版社。LIC方法的更多信息可見(Rashtchian,(1995)CurrOpinBiotechnol6(1):30-6)。產(chǎn)生本發(fā)明的TCR的方法可以是但不限于從展示此類TCR的噬菌體顆粒的多樣性文庫中篩選出對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物具有高親和性的TCR，如文獻(Li,etal(2005)NatureBiotech23(3):349-354)中所述。應(yīng)理解，表達野生型TCRα和β鏈可變域氨基酸的基因或者表達略作修飾的野生型TCR的α和β鏈可變域氨基酸的基因都可用來制備模板TCR。然后在編碼該模板TCR的可變域的DNA中引入產(chǎn)生本發(fā)明的高親和力TCR所需的改變。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明TCR在SEQIDNO：36所示的α鏈可變域中發(fā)生突變，所述突變的氨基酸殘基位點包括28R、29V、30S、32S、50I、52S、53N、55D、94S、96Y、97A或98L中的一個或多個，其中，氨基酸殘基編號采用SEQIDNO:36所示的編號；和/或所述TCR在SEQIDNO：37所示的β鏈可變域中發(fā)生突變，所述突變的氨基酸殘基位點包括27G、28T、29S、30N、31P、32N、53I、54G、92A、93W或95V中的一個或多個，其中，氨基酸殘基編號采用SEQIDNO:37所示的編號。例如，突變后的所述TCRα鏈可變域包括選自下組的一個或多個氨基酸殘基：28I、28K、或28M；29Y或29L；30N；32A；50L；52R；53G；55S或55T；94D；96I；97H、97I、97V或97L；98M、98I或98F；和/或突變后的所述TCRβ鏈可變域包括選自下組的一個或多個氨基酸殘基：27P或27L；28H、28S、28R或28D；29N、29Y或29D；30P、30T、30I或30L；31R；32L、32A或32I；53V；54R；92S；93Y；95L。更具體地，α鏈可變域中所述突變的具體形式包括R28I/K/M、V29Y/L、S30N、S32A、I50L、S52R、N53G、D55S/T、S94D、Y96I、A97H/I/V/L或L98M/I/F中的一組或幾組；β鏈可變域中所述突變的具體形式包括G27P/L、T28H/S/R/D、S29N/Y/D、N30P/T/I/L、P31R、N32L/A/I、I53V、G54R、A92S、W93Y或V95L中的一組或幾組。本發(fā)明的高親和性TCR包含α鏈可變域氨基酸序列SEQIDNO:40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55和56之一和/或β鏈可變域氨基酸序列SEQIDNO:57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68和69之一。因此，含有野生型TCR的α鏈可變域氨基酸序列(SEQIDNO:36)的TCRα鏈可與包含SEQIDNO:57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68和69之一的TCRβ鏈組合形成異質(zhì)二聚TCR或單鏈TCR分子?；蛘?，含有野生型TCR的β可變域氨基酸序列(SEQIDNO:37)的TCRβ鏈可與包含SEQIDNO:40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55和56之一的TCRα鏈組合形成異質(zhì)二聚TCR或單鏈TCR分子。又或者，包含TCRα鏈可變域氨基酸序列SEQIDNO:40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55和56之一的TCRα鏈可與包含TCRβ鏈可變域氨基酸序列SEQIDNO:57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68和69之一的TCRβ鏈組合形成異質(zhì)二聚TCR或單鏈TCR分子?；诒景l(fā)明的目的，本發(fā)明TCR是具有至少一個TCRα和/或TCRβ鏈可變域的部分。它們通常同時包含TCRα鏈可變域和TCRβ鏈可變域。它們可以是αβ異源二聚體或是單鏈形式或是其他任何能夠穩(wěn)定存在的形式。在過繼性免疫治療中，可將αβ異源二聚TCR的全長鏈(包含胞質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)域)進行轉(zhuǎn)染。本發(fā)明TCR可用作將治療劑遞送至抗原呈遞細胞的靶向劑或與其他分子結(jié)合制備雙功能多肽來定向效應(yīng)細胞，此時TCR優(yōu)選為可溶形式。對于穩(wěn)定性而言，現(xiàn)有技術(shù)中公開了在TCR的α與β鏈恒定域之間引入人工鏈間二硫鍵能夠獲得可溶且穩(wěn)定的TCR分子，如專利文獻201410629321.8中所述。因此，本發(fā)明TCR可以是在其α和β鏈恒定域的殘基之間引入人工鏈間二硫鍵的TCR。半胱氨酸殘基在所述TCR的α和β鏈恒定域間形成人工鏈間二硫鍵。半胱氨酸殘基可以取代在天然TCR中合適位點的其他氨基酸殘基以形成人工鏈間二硫鍵。例如，取代TRAC*01外顯子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57來形成二硫鍵。引入半胱氨酸殘基以形成二硫鍵的其他位點還可以是：TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser77；TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser17；TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Asp59；TRAC*01外顯子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu15；TRAC*01外顯子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser54；TRAC*01外顯子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ala19；或TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu20。即半胱氨酸殘基取代了上述α與β鏈恒定域中任一組位點。可在本發(fā)明TCR恒定域的一個或多個C末端截短最多15個、或最多10個、或最多8個或更少的氨基酸，以使其不包括半胱氨酸殘基來達到缺失天然鏈間二硫鍵的目的，也可通過將形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基突變?yōu)榱硪话被醽磉_到上述目的。如上所述，本發(fā)明的TCR可以包含在其α和β鏈恒定域的殘基間引入的人工鏈間二硫鍵。應(yīng)注意，恒定域間含或不含上文所述的引入的人工二硫鍵，本發(fā)明的TCR均可含有α和β鏈恒定域序列。TCR的α和β鏈恒定域序列可通過存在于TCR中的天然鏈間二硫鍵連接。另外，對于穩(wěn)定性而言，專利文獻201510260322.4還公開了在TCR的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間引入人工鏈間二硫鍵能夠使TCR的穩(wěn)定性顯著提高。因此，本發(fā)明的高親和力TCR的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間還可以含有人工鏈間二硫鍵。具體地，在所述TCR的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間形成人工鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基取代了：TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸；TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的61位氨基酸；TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位氨基酸；或TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸。優(yōu)選地，這樣的TCR可以包含(ⅰ)除其跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRα鏈，和(ⅱ)除其跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRβ鏈，其中(ⅰ)和(ⅱ)均包含TCR鏈的可變域和至少一部分恒定域，α鏈與β鏈形成異質(zhì)二聚體。更優(yōu)選地，這樣的TCR可以包含α鏈可變域和β鏈可變域以及除跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分β鏈恒定域，但其不包含α鏈恒定域，所述TCR的α鏈可變域與β鏈形成異質(zhì)二聚體。對于穩(wěn)定性而言，另一方面，本發(fā)明TCR還包括在其疏水芯區(qū)域發(fā)生突變的TCR，這些疏水芯區(qū)域的突變優(yōu)選為能夠使本發(fā)明TCR的穩(wěn)定性提高的突變，如在公開號為WO2014/206304的專利文獻中所述。這樣的TCR可在其下列可變域疏水芯位置發(fā)生突變：(α和/或β鏈)可變區(qū)氨基酸第11，13，19，21，53，76，89，91，94位，和/或α鏈J基因(TRAJ)短肽氨基酸位置倒數(shù)第3,5,7位,和/或β鏈J基因(TRBJ)短肽氨基酸位置倒數(shù)第2,4,6位，其中氨基酸序列的位置編號按國際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)(IMGT)中列出的位置編號。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉上述國際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)，并可根據(jù)該數(shù)據(jù)庫得到不同TCR的氨基酸殘基在IMGT中的位置編號。更具體地，本發(fā)明中疏水芯區(qū)域發(fā)生突變的TCR可以是由一柔性肽鏈連接TCR的α與β鏈的可變域而構(gòu)成的高穩(wěn)定性單鏈TCR。TCR可變區(qū)的CDR區(qū)決定了其與短肽-HLA復(fù)合物之間的親和力，疏水芯的突變能夠使TCR更加穩(wěn)定，但并不會影響其與短肽-HLA復(fù)合物之間的親和力。應(yīng)注意，本發(fā)明中柔性肽鏈可以是任何適合連接TCRα與β鏈可變域的肽鏈。本發(fā)明實施例1中構(gòu)建的用于篩選高親和性TCR的模板鏈即為上述含有疏水芯突變的高穩(wěn)定性單鏈TCR。采用穩(wěn)定性較高的TCR，能夠更方便的評估TCR與ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物之間的親和力。該單鏈模板TCR的α鏈可變域及β鏈可變域的CDR區(qū)與野生型TCR的CDR區(qū)完全相同。即α鏈可變域的3個CDR分別為CDR1α：DRVSQS，CDR2α：IYSNGD，CDR3α：AATNSGYALN；β鏈可變域的3個CDR分別為CDR1β：GTSNPN，CDR2β：SVGIG，CDR3β：AWSVDGAEQY。該單鏈模板TCR的氨基酸序列(SEQIDNO:1)及核苷酸序列(SEQIDNO:2)分別如圖1a和1b所示。以此篩選出對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物具有高親和性的由α鏈可變域和β鏈可變域構(gòu)成的單鏈TCR。本發(fā)明中單鏈模板TCRα鏈可變域SEQIDNO：3的3個CDR即CDR1、CDR2和CDR3分別位于SEQIDNO：3的第27-32位、第50-55位和第90-99位。據(jù)此，氨基酸殘基編號采用SEQIDNO:3所示的編號，28R即為CDR1α的第2位R，29V即為CDR1α的第3位V，30S即為CDR1α的第4位S，32S即為CDR1α的第6位S，50I即為CDR2α的第1位I，52S即為CDR2α的第3位S，53N即為CDR2α的第4位N，55D即為CDR2α的第6位D，94S即為CDR3α的第5位S，96Y即為CDR3α的第7位Y，97A即為CDR3α的第8位A，98L即為CDR3α的第9位L。同理，本發(fā)明中單鏈模板TCRβ鏈可變域SEQIDNO：4的3個CDR即CDR1、CDR2和CDR3分別位于SEQIDNO：4的第27-32位、第50-54位和第92-101位。因此，氨基酸殘基編號采用SEQIDNO:4所示的編號，27G即為CDR1β的第1位G，28T即為CDR1β的第2位T，29S即為CDR1β的第3位S，30N即為CDR1β的第4位N，31P即為CDR1β的第5位P，32N即為CDR1β的第6位N，53I即為CDR2β的第4位I，54G即為CDR2β的第5位G，92A即為CDR3β的第1位A，93W即為CDR3β的第2位W，95V即為CDR3β的第4位V。本發(fā)明的對ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物具有高親和性的αβ異質(zhì)二聚體的獲得是通過將篩選出的高親和性單鏈TCR的CDR區(qū)通過定點突變的方法轉(zhuǎn)移到到野生型TCRα鏈可變域(SEQIDNO:36)與β鏈可變域(SEQIDNO:37)的相應(yīng)位置而得到。在本發(fā)明的一些實施例中，采用SEQIDNO:36所示的編號，本發(fā)明TCR的α鏈可變域疏水芯氨基酸殘基19A(即IMGT中列出的α鏈可變區(qū)第19位)、21L(即IMGT中列出的α鏈可變區(qū)第21位)和79S(即IMGT中列出的α鏈可變區(qū)第94位)中有一個或多個發(fā)生突變和/或采用SEQIDNO:37所示的編號，所述TCRβ鏈可變域疏水芯氨基酸殘基13Q(即IMGT中列出的β鏈可變區(qū)第13位)、19L(即IMGT中列出的β鏈可變區(qū)第19位)、64L(即IMGT中列出的β鏈可變區(qū)第76位)、78S(即IMGT中列出的β鏈可變區(qū)第91位)和81L(即IMGT中列出的β鏈可變區(qū)第94位)中有一個或多個發(fā)生突變。更具體地，在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施例中，采用SEQIDNO:36所示的編號，本發(fā)明α鏈可變域疏水芯包含氨基酸殘基119V、21I和79I中的一個或多個和/或采用SEQIDNO:37所示的編號，所述TCRβ可變域疏水芯包含氨基酸殘基13V、19V、64Y、78I和81V中的一個或多個。更具體地，所述TCRα可變域疏水芯的突變形式包括A19V、L21I和S79I中的一組或幾組；所述TCRβ可變域疏水芯的突變形式包括Q13V、L19V、L64Y、S78I和L81V中的一組或幾組。本發(fā)明的高親和性TCR還包含α鏈可變域氨基酸序列SEQIDNO:6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21和22之一和/或β鏈可變域氨基酸序列SEQIDNO:23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34和35之一。因此，上述作為模板鏈的高穩(wěn)定性單鏈TCRα鏈可變域(SEQIDNO:3)可與氨基酸序列為SEQIDNO:23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35的TCRβ鏈可變域組合形成所述單鏈TCR分子?；蛘?，上述作為模板鏈的高穩(wěn)定性單鏈TCRβ鏈可變域(SEQIDNO:4)可與氨基酸序列為SEQIDNO:6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的TCRα鏈可變域組合形成所述單鏈TCR分子。又或者，TCRα鏈可變域SEQIDNO：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22與TCRβ鏈可變域SEQIDNO:23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35組合形成所述單鏈TCR分子。本發(fā)明中，高親和力單鏈TCR分子的α鏈可變域與β鏈可變域的氨基酸序列優(yōu)選自下表1：表1本發(fā)明的TCR也可以多價復(fù)合體的形式提供。本發(fā)明的多價TCR復(fù)合體包含兩個、三個、四個或更多個本發(fā)明TCR相結(jié)合而形成的多聚物，如可以用p53的四聚結(jié)構(gòu)域來產(chǎn)生四聚體，或多個本發(fā)明TCR與另一分子結(jié)合而形成的復(fù)合物。本發(fā)明的TCR復(fù)合物可用于體外或體內(nèi)追蹤或靶向呈遞特定抗原的細胞，也可用于產(chǎn)生具有此類應(yīng)用的其他多價TCR復(fù)合物的中間體。本發(fā)明的TCR可以單獨使用，也可與偶聯(lián)物以共價或其他方式結(jié)合，優(yōu)選以共價方式結(jié)合。所述偶聯(lián)物包括可檢測標記物(為診斷目的，其中所述TCR用于檢測呈遞ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的細胞的存在)、治療劑、PK(蛋白激酶)修飾部分或任何以上這些物質(zhì)的組合結(jié)合或偶聯(lián)。用于診斷目的的可檢測標記物包括但不限于：熒光或發(fā)光標記物、放射性標記物、MRI(磁共振成像)或CT(電子計算機X射線斷層掃描技術(shù))造影劑、或能夠產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物的酶?？膳c本發(fā)明TCR結(jié)合或偶聯(lián)的治療劑包括但不限于：1.放射性核素(Koppe等，2005，癌轉(zhuǎn)移評論(Cancermetastasisreviews)24，539)；2.生物毒(Chaudhary等，1989，自然(Nature)339，394；Epel等，2002，癌癥免疫學(xué)和免疫治療(CancerImmunologyandImmunotherapy)51，565)；3.細胞因子如IL-2等(Gillies等，1992，美國國家科學(xué)院院刊(PNAS)89，1428；Card等，2004，癌癥免疫學(xué)和免疫治療(CancerImmunologyandImmunotherapy)53，345；Halin等，2003，癌癥研究(CancerResearch)63，3202)；4.抗體Fc片段(Mosquera等，2005，免疫學(xué)雜志(TheJournalOfImmunology)174，4381)；5.抗體scFv片段(Zhu等，1995，癌癥國際期刊(InternationalJournalofCancer)62,319)；6.金納米顆粒/納米棒(Lapotko等，2005，癌癥通信(Cancerletters)239，36；Huang等，2006，美國化學(xué)學(xué)會雜志(JournaloftheAmericanChemicalSociety)128，2115)；7.病毒顆粒(Peng等，2004，基因治療(Genetherapy)11，1234)；8.脂質(zhì)體(Mamot等，2005，癌癥研究(Cancerresearch)65，11631)；9.納米磁粒；10.前藥激活酶(例如，DT-心肌黃酶(DTD)或聯(lián)苯基水解酶-樣蛋白質(zhì)(BPHL))；11.化療劑(例如，順鉑)或任何形式的納米顆粒等。與本發(fā)明TCR結(jié)合的抗體或其片段包括抗-T細胞或NK-細胞決定抗體，如抗-CD3或抗-CD28或抗-CD16抗體，上述抗體或其片段與TCR的結(jié)合能夠?qū)π?yīng)細胞進行定向來更好地靶向靶細胞。一個優(yōu)選的實施方式是本發(fā)明TCR與抗-CD3抗體或所述抗-CD3抗體的功能片段或變體結(jié)合。具體地，本發(fā)明的TCR與抗CD3單鏈抗體的融合分子包括選自下組的TCRα鏈可變域氨基酸序列SEQIDNO:6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56和選自下組的TCRβ鏈可變域氨基酸序列SEQIDNO:23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69。優(yōu)選地，本發(fā)明高親和力單鏈TCR分子與抗-CD3單鏈抗體融合分子的氨基酸序列選自SEQIDNO:70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明TCR的核酸分子。本發(fā)明的核酸分子可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。例如，編碼本發(fā)明TCR的核酸序列可以與本發(fā)明附圖中所示的核酸序列相同或是簡并的變異體。舉例說明“簡并的變異體”的含義，如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQIDNO:1的蛋白序列，但與SEQIDNO:2的序列有差別的核酸序列。本發(fā)明的核酸分子全長序列或其片段通?？梢杂玫幌抻赑CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明TCR(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的核酸分子的載體，以及用本發(fā)明的載體或編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞。本發(fā)明還包括表達本發(fā)明TCR的分離細胞，特別是T細胞。有許多方法適合于用編碼本發(fā)明的高親和力TCR的DNA或RNA進行T細胞轉(zhuǎn)染(如，Robbins等.，(2008)J.Immunol.180:6116-6131)。表達本發(fā)明高親和性TCR的T細胞可以用于過繼免疫治療。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠知曉進行過繼性治療的許多合適方法(如，Rosenberg等.，(2008)NatRevCancer8(4)：299-308)。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，所述藥物組合物含有藥學(xué)上可接受的載體以及本發(fā)明TCR、或本發(fā)明TCR復(fù)合物、或呈遞本發(fā)明TCR的細胞。本發(fā)明還提供了一種治療疾病的方法，包括給需要治療的對象施用適量的本發(fā)明TCR、或本發(fā)明TCR復(fù)合物、或呈遞本發(fā)明TCR的細胞、或本發(fā)明的藥物組合物。應(yīng)理解，本文中氨基酸名稱采用國際通用的單英文字母標識，與其相對應(yīng)的氨基酸名稱三英文字母簡寫分別是：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)；本發(fā)明中，Pro60或者60P均表示第60位脯氨酸，其他以此類推。另外，本發(fā)明中所述突變的具體形式的表述方式如“R28I”代表第28位的R被I取代，同理，“R28I/K/M”代表第28位的R被I取代或被K取代或被M取代。其他以此類推。在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。因此，本發(fā)明TCR還包括本發(fā)明TCR的至多5個，較佳地至多3個，更佳地至多2個，最佳地1個氨基酸(尤其是位于CDR區(qū)之外的氨基酸)，被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換，并仍能夠保持其功能性的TCR。本發(fā)明還包括對本發(fā)明TCR略作修飾后的TCR。修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括：本發(fā)明TCR的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在本發(fā)明TCR的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的TCR。這種修飾可以通過將TCR暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的TCR。本發(fā)明的TCR、TCR復(fù)合物或本發(fā)明TCR轉(zhuǎn)染的T細胞可與藥學(xué)上可接受的載體一起在藥物組合物中提供。本發(fā)明的TCR、多價TCR復(fù)合物或細胞通常作為無菌藥物組合物的一部分提供，所述組合物通常包括藥學(xué)上可接受的載體。該藥物組合物可以是任何合適的形式(取決于給予患者的所需方法)。其可采用單位劑型提供，通常在密封的容器中提供，可作為試劑盒的一部分提供。此類試劑盒(但非必需)包括使用說明書。其可包括多個所述單位劑型。此外，本發(fā)明的TCR可以單用，也可與其他治療劑結(jié)合或偶聯(lián)在一起使用(如配制在同一藥物組合物中)。藥物組合物還可含有藥學(xué)上可接受的載體。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體：它們本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體，且給藥后沒有過分的毒性。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在雷明頓藥物科學(xué)(Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N.J.1991))中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。這類載體包括(但并不限于)：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐劑、及其組合。治療性組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。通常，可將治療性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液中、液體載體的固體形式。一旦配成本發(fā)明的組合物，可將其通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)：眼內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥，優(yōu)選為胃腸外包括皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)。待預(yù)防或治療的對象可以是動物；尤其是人。當本發(fā)明的藥物組合物被用于實際治療時，可根據(jù)使用情況而采用各種不同劑型的藥物組合物。較佳地，可以例舉的有針劑、口服劑等。這些藥物組合物可根據(jù)常規(guī)方法通過混合、稀釋或溶解而進行配制，并且偶爾添加合適的藥物添加劑，如賦形劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、稀釋劑、緩沖劑、等滲劑(isotonicities)、防腐劑、潤濕劑、乳化劑、分散劑、穩(wěn)定劑和助溶劑，而且該配制過程可根據(jù)劑型用慣常方式進行。本發(fā)明的藥物組合物還可以緩釋劑形式給藥。例如，本發(fā)明TCR可被摻入以緩釋聚合物為載體的藥丸或微囊中，然后將該藥丸或微囊通過手術(shù)植入待治療的組織。作為緩釋聚合物的例子，可例舉的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羥基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，較佳地可例舉的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。當本發(fā)明的藥物組合物被用于實際治療時，作為活性成分的本發(fā)明TCR或TCR復(fù)合物或呈遞本發(fā)明TCR的細胞，可根據(jù)待治療的每個病人的體重、年齡、性別、癥狀程度而合理地加以確定，最終由醫(yī)師決定合理的用量。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：(1)本發(fā)明篩選出了對所述ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物具有高親和力的TCR。(2)本發(fā)明的TCR對所述ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的親和力和/或結(jié)合半衰期是野生型TCR的至少2倍。(3)本發(fā)明的高親和力的TCR對所述ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的親和力和/或結(jié)合半衰期可以達到野生型TCR的103-106倍。下面的具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如(Sambrook和Russell等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?MolecularCloning-ALaboratoryManual)(第三版)(2001)CSHL出版社)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。材料和方法本發(fā)明實施例中所用的實驗材料如無特殊說明均可從市售渠道獲得，其中，E.coliDH5α購自Tiangen、E.coliBL21(DE3)購自Tiangen、E.coliTuner(DE3)購自Novagen、質(zhì)粒pET28a購自Novagen。實施例1單鏈TCR模板鏈的產(chǎn)生本發(fā)明利用定點突變的方法，根據(jù)專利文獻WO2014/206304中所述，構(gòu)建了以一個柔性短肽(linker)連接TCRα與β鏈可變域而構(gòu)成的穩(wěn)定性單鏈TCR分子，其氨基酸及DNA序列分別為SEQIDNO:1和SEQIDNO:2，如圖1a和圖1b所示。并以該單鏈TCR分子為模板進行高親和性TCR分子的篩選。該模板鏈的α可變域(SEQIDNO:3)及β可變域(SEQIDNO:4)的氨基酸序列如圖2a和2b所示；柔性短肽(linker)的氨基酸序列為SEQIDNO:5，如圖3所示。將攜帶模板鏈的目的基因經(jīng)NcoⅠ和NotⅠ雙酶切，與經(jīng)過NcoⅠ和NotⅠ雙酶切的pET28a載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，涂布含卡那霉素的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取陽性克隆進行PCR篩選，對陽性重組子進行測序，確定序列正確后抽提重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3),用于表達。實施例2實施例1中構(gòu)建的單鏈TCR的表達、復(fù)性和純化將實施例1中制備的含有重組質(zhì)粒pET28a-模板鏈的BL21(DE3)菌落全部接種于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8，加入IPTG至終濃度為0.5mM，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。5000rpm離心15min收獲細胞沉淀物，用BugbusterMasterMix(Merck)裂解細胞沉淀物，6000rpm離心15min回收包涵體，再用Bugbuster(Merck)進行洗滌以除去細胞碎片和膜組分，6000rpm離心15min,收集包涵體。將包涵體溶解在緩沖液(20mMTris-HClpH8.0,8M尿素)中，高速離心去除不溶物，上清液用BCA法定量后進行分裝，于-80℃保存?zhèn)溆?。?mg溶解的單鏈TCR包涵體蛋白中，加入2.5mL緩沖液(6MGua-HCl，50mMTris-HClpH8.1，100mMNaCl，10mMEDTA)，再加入DTT至終濃度為10mM,37℃處理30min。用注射器向125mL復(fù)性緩沖液(100mMTris-HClpH8.1,0.4ML-精氨酸,5M尿素,2mMEDTA,6.5mMβ-mercapthoethylamine,1.87mMCystamine)中滴加上述處理后的單鏈TCR，4℃攪拌10min，然后將復(fù)性液裝入截留量為4kDa的纖維素膜透析袋,透析袋置于1L預(yù)冷的水中，4℃緩慢攪拌過夜。17小時后，將透析液換成1L預(yù)冷的緩沖液(20mMTris-HClpH8.0)，4℃繼續(xù)透析8h，然后將透析液換成相同的新鮮緩沖液繼續(xù)透析過夜。17小時后，樣品經(jīng)0.45μm濾膜過濾，真空脫氣后通過陰離子交換柱(HiTrapQHP,GEHealthcare)，用20mMTris-HClpH8.0配制的0-1MNaCl線性梯度洗脫液純化蛋白，收集的洗脫組分進行SDS-PAGE分析，包含單鏈TCR的組分濃縮后進一步用凝膠過濾柱(Superdex7510/300,GEHealthcare)進行純化，目標組分也進行SDS-PAGE分析。用于BIAcore分析的洗脫組分進一步采用凝膠過濾法測試其純度。條件為：色譜柱AgilentBioSEC-3(300A，φ7.8×300mm)，流動相為150mM磷酸鹽緩沖液，流速0.5mL/min，柱溫25℃，紫外檢測波長214nm。實施例3結(jié)合表征BIAcore分析使用BIAcoreT200實時分析系統(tǒng)檢測TCR分子與ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的結(jié)合活性。將抗鏈霉親和素的抗體(GenScript)加入偶聯(lián)緩沖液(10mM醋酸鈉緩沖液，pH4.77)，然后將抗體流過預(yù)先用EDC和NHS活化過的CM5芯片，使抗體固定在芯片表面，最后用乙醇胺的鹽酸溶液封閉未反應(yīng)的活化表面，完成偶聯(lián)過程，偶聯(lián)水平約為15,000RU。使低濃度的鏈霉親和素流過已包被抗體的芯片表面，然后將ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物流過檢測通道，另一通道作為參比通道，再將0.05mM的生物素以10μL/min的流速流過芯片2min，封閉鏈霉親和素剩余的結(jié)合位點。采用單循環(huán)動力學(xué)分析方法測定其親和力，將TCR用HEPES-EP緩沖液(10mMHEPES,150mMNaCl，3mMEDTA,0.005％P20，pH7.4)稀釋成幾個不同的濃度，以30μL/min的流速，依次流過芯片表面，每次進樣的結(jié)合時間為120s，最后一次進樣結(jié)束后讓其解離600s。每一輪測定結(jié)束后用pH1.75的10mMGly-HCl再生芯片。利用BIAcoreEvaluation軟件計算動力學(xué)參數(shù)。上述ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的制備過程如下：a.純化收集100ml誘導(dǎo)表達重鏈或輕鏈的E.coli菌液，于4℃8000g離心10min后用10mlPBS洗滌菌體一次，之后用5mlBugBusterMasterMixExtractionReagents(Merck)劇烈震蕩重懸菌體，并于室溫旋轉(zhuǎn)孵育20min，之后于4℃，6000g離心15min，棄去上清，收集包涵體。將上述包涵體重懸于5mlBugBusterMasterMix中，室溫旋轉(zhuǎn)孵育5min；加30ml稀釋10倍的BugBuster，混勻，4℃6000g離心15min；棄去上清，加30ml稀釋10倍的BugBuster重懸包涵體，混勻，4℃6000g離心15min，重復(fù)兩次，加30ml20mMTris-HClpH8.0重懸包涵體，混勻，4℃6000g離心15min，最后用20mMTris-HCl8M尿素溶解包涵體，SDS-PAGE檢測包涵體純度，BCA試劑盒測濃度。b.復(fù)性將合成的短肽ILSLELMKL(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)溶解于DMSO至20mg/ml的濃度。輕鏈和重鏈的包涵體用8M尿素、20mMTrispH8.0、10mMDTT來溶解，復(fù)性前加入3M鹽酸胍、10mM醋酸鈉、10mMEDTA進一步變性。將ILSLELMKL肽以25mg/L(終濃度)加入復(fù)性緩沖液(0.4ML-精氨酸、100mMTrispH8.3、2mMEDTA、0.5mM氧化性谷胱甘肽、5mM還原型谷胱甘肽、0.2mMPMSF，冷卻至4℃)，然后依次加入20mg/L的輕鏈和90mg/L的重鏈(終濃度，重鏈分三次加入，8h/次)，復(fù)性在4℃進行至少3天至完成，SDS-PAGE檢測能否復(fù)性成功。c.復(fù)性后純化用10體積的20mMTrispH8.0作透析來更換復(fù)性緩沖液，至少更換緩沖液兩次來充分降低溶液的離子強度。透析后用0.45μm醋酸纖維素濾膜過濾蛋白質(zhì)溶液，然后加載到HiTrapQHP(GE通用電氣公司)陰離子交換柱上(5ml床體積)。利用Akta純化儀(GE通用電氣公司)，20mMTrispH8.0配制的0-400mMNaCl線性梯度液洗脫蛋白，pMHC約在250mMNaCl處洗脫，收集諸峰組分，SDS-PAGE檢測純度。d.生物素化用Millipore超濾管將純化的pMHC分子濃縮，同時將緩沖液置換為20mMTrispH8.0，然后加入生物素化試劑0.05MBicinepH8.3、10mMATP、10mMMgOAc、50μMD-Biotin、100μg/mlBirA酶(GST-BirA)，室溫孵育混合物過夜，SDS-PAGE檢測生物素化是否完全。e.純化生物素化后的復(fù)合物用Millipore超濾管將生物素化標記后的pMHC分子濃縮至1ml，采用凝膠過濾層析純化生物素化的pMHC，利用Akta純化儀(GE通用電氣公司)，用過濾過的PBS預(yù)平衡HiPrepTM16/60S200HR柱(GE通用電氣公司)，加載1ml濃縮過的生物素化pMHC分子，然后用PBS以1ml/min流速洗脫。生物素化的pMHC分子在約55ml時作為單峰洗脫出現(xiàn)。合并含有蛋白質(zhì)的組分，用Millipore超濾管濃縮，BCA法(Thermo)測定蛋白質(zhì)濃度，加入蛋白酶抑制劑cocktail(Roche)將生物素化的pMHC分子分裝保存在-80℃。實施例4高親和性單鏈TCR的產(chǎn)生噬菌體展示技術(shù)是產(chǎn)生TCR高親和力變體文庫以篩選高親和力變體的一種手段。將Li等((2005)NatureBiotech23(3):349-354)描述的TCR噬菌體展示和篩選方法應(yīng)用于實施例1中的單鏈TCR模板。通過突變該模板鏈的CDR區(qū)來建立高親和性TCR的文庫并進行淘選。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過閱讀上述文獻可以獲得所述建庫及篩選方法。即通過使用具有所需的一個或多個密碼子變化的引物和作為模板的含相關(guān)DNA的質(zhì)粒來實現(xiàn)。經(jīng)過幾輪淘選后的噬菌體文庫均和相應(yīng)抗原有特異性結(jié)合，從中挑取單克隆，并進行序列分析。采用實施例3中BIAcore方法分析TCR分子與ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的相互作用，篩選出了親和力和/或結(jié)合半衰期是野生型TCR的至少2倍的高親和性TCR，即篩選出的高親和性TCR結(jié)合ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的解離平衡常數(shù)KD小于等于野生型TCR結(jié)合ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的解離平衡常數(shù)KD的二分之一，結(jié)果如下表2所示。利用上述方法檢測到參比TCR與ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物相互作用的KD值為270μM，其相互作用曲線如圖11所示，即野生型TCR與ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物相互作用的KD值也為270μM。具體地，采用SEQIDNO:36中所示的編號，這些高親和力TCR突變體的α鏈可變域在下列一個或多個位點的氨基酸發(fā)生突變：28R、29V、30S、32S、50I、52S、53N、55D、94S、96Y、97A和98L和/或采用SEQIDNO:37中所示的編號，這些高親和力TCR突變體的β鏈可變域在下列一個或多個位點的氨基酸發(fā)生突變27G、28T、29S、30N、31P、32N、53I、54G、92A、93W和95V。更具體地，采用SEQIDNO:36所示的編號，這些高親和力TCR的α鏈可變域包含選自下組的一個或多個氨基酸殘基28I、28K、或28M；29Y或29L；30N；32A；50L；52R；53G；55S或55T；94D；96I；97H、97I、97V或97L；98M、98I或98F；和/或采用SEQIDNO:37所示的編號，這些高親和力TCR的β鏈可變域包含選自下組的一個或多個氨基酸殘基27P或27L；28H、28S、28R或28D；29N、29Y或29D；30P、30T、30I或30L；31R；32L、32A或32I；53V；54R；92S；93Y；95L。高親和性單鏈TCR的α鏈可變域(SEQIDNO:6-22)和β鏈可變域(SEQIDNO:23-35)的具體氨基酸序列分別如圖4a-q和圖5a-m所示。表2實施例5高親和性αβ異質(zhì)二聚TCR的產(chǎn)生將實施例4中篩選到的高親和力的單鏈TCR的α與β鏈可變域的CDR分別轉(zhuǎn)移到αβ異質(zhì)二聚TCR的可變域的相應(yīng)位點中，并通過BIAcore來檢測其與ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物的親和力。上述CDR區(qū)高親和力突變點的引入采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的定點突變的方法。由于TCR可變區(qū)的CDR區(qū)決定了其與pMHC復(fù)合物之間的親和力，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)測引入上述篩選到的CDR區(qū)突變后，可以獲得高親和性αβ異質(zhì)二聚TCR。上述野生型TCR的α鏈與β鏈可變域氨基酸序列分別如圖6a(SEQIDNO:36)和6b(SEQIDNO:37)所示。應(yīng)注意，為獲得更加穩(wěn)定的可溶性TCR，以便更方便地評估TCR與ILSLELMKL-HLAA0201復(fù)合物之間的結(jié)合親和力和/或結(jié)合半衰期，αβ異質(zhì)二聚TCR可以是在α和β鏈的恒定區(qū)中分別引入了一個半胱氨酸殘基以形成人工鏈間二硫鍵的TCR，本實施例中引入半胱氨酸殘基后的TCRα與β鏈的氨基酸序列分別如圖7a(SEQIDNO:38)和7b所示(SEQIDNO:39)，引入的半胱氨酸殘基以加粗字母表示。通過《分子克隆實驗室手冊》(MolecularCloningaLaboratoryManual)(第三版，Sambrook和Russell)中描述的標準方法將待表達的TCRα和β鏈的胞外序列基因經(jīng)合成后分別插入到表達載體pET28a+(Novagene)，上下游的克隆位點分別是NcoI和NotI。CDR區(qū)的突變通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重疊PCR(overlapPCR)引入。插入片段經(jīng)過測序確認無誤。實施例6αβ異質(zhì)二聚TCR的表達、復(fù)性和純化將TCRα和β鏈的表達載體分別通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化進入表達細菌BL21(DE3),細菌用LB培養(yǎng)液生長，于OD600＝0.6時用終濃度0.5mMIPTG誘導(dǎo)，TCR的α和β鏈表達后形成的包涵體通過BugBusterMix(Novagene)進行提取，并且經(jīng)BugBuster溶液反復(fù)多次洗滌，包涵體最后溶解于6M鹽酸胍,10mM二硫蘇糖醇(DTT),10mM乙二胺四乙酸(EDTA),20mMTris(pH8.1)中。溶解后的TCRα和β鏈以1：1的質(zhì)量比快速混合于5M尿素,0.4M精氨酸,20mMTris(pH8.1),3.7mMcystamine,6.6mMβ-mercapoethylamine(4℃)中，終濃度為60mg/mL?；旌虾髮⑷芤褐糜?0倍體積的去離子水中透析(4℃)，12小時后將去離子水換成緩沖液(20mMTris,pH8.0)繼續(xù)于4℃透析12小時。透析完成后的溶液經(jīng)0.45μM的濾膜過濾后，通過陰離子交換柱(HiTrapQHP,5ml,GEHealthcare)純化。洗脫峰含有復(fù)性成功的α和β二聚體的TCR通過SDS-PAGE膠確認。TCR隨后通過凝膠過濾層析(HiPrep16/60，SephacrylS-100HR，GEHealthcare)進一步純化。純化后的TCR純度經(jīng)過SDS-PAGE測定大于90％，濃度由BCA法確定。實施例7抗-CD3抗體與高親和性單鏈TCR的融合體的表達、復(fù)性和純化將本發(fā)明的高親和性單鏈TCR分子與抗CD3抗體的單鏈分子(scFv)進行融合，構(gòu)建融合分子。通過重疊(overlap)PCR的方法，設(shè)計引物,連接抗-CD3抗體及高親和性單鏈TCR分子的基因，設(shè)計中間的連接短肽(linker)為GGGGS，并且使融合分子的基因片段帶上限制性內(nèi)切酶位點NcoⅠ和NotⅠ。將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)NcoⅠ和NotⅠ雙酶切，與經(jīng)過NcoⅠ和NotⅠ雙酶切的pET28a載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞，涂布含卡那霉素的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取陽性克隆進行PCR篩選，對陽性重組子進行測序，確定序列正確后抽提重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，用于表達。融合蛋白的表達將含有目的基因的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株BL21(DE3)中，涂布LB平板(卡那霉素50μg/ml)置于37℃培養(yǎng)過夜。次日，挑克隆接種至10mlLB液體培養(yǎng)基(卡那霉素50μg/ml)培養(yǎng)2-3h，按體積比1:100接種至1LLB培養(yǎng)基(卡那霉素50μg/ml)中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.5-0.8，然后使用終濃度為0.5mM的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達。誘導(dǎo)4小時以后，以6000rpm離心10min收獲細胞。PBS緩沖液洗滌菌體一次，并且分裝菌體，取相當于200ml的細菌培養(yǎng)物的菌體用5mlBugBusterMasterMix(Novagen)裂解細菌，以6000g離心15min收集包涵體。然后進行4次洗滌劑洗滌以去除細胞碎片和膜組分。然后，用緩沖液如PBS洗滌包涵體以除去洗滌劑和鹽。最終，將包涵體用含8M尿素的Tris緩沖溶液溶解，并測定包涵體濃度，將其分裝后置于-80℃冷凍保存。融合蛋白的重折疊從-80℃超低溫冰箱中取出約10mg包涵體解凍，加二硫蘇糖醇(DTT)至終濃度為10mM，在37℃中溫育30min到1小時以確保二硫鍵完全打開。然后將包涵體樣品溶液分別滴入200ml4℃預(yù)冷重折疊緩沖液(100mMTrispH8.1，400mML-精氨酸，2mMEDTA，5M尿素，6.5mMβ-mercapthoethylamine,1.87mMCystamine)，4℃緩慢攪拌約30分鐘。復(fù)性溶液用8倍體積預(yù)冷的H2O透析16-20小時。再用8倍體積的10mMTrispH8.0透析兩次，4℃繼續(xù)透析約8小時，透析后樣品過濾后進行以下純化。融合蛋白的第一步純化經(jīng)過透析的重折疊物(10mMTrispH8.0中)使用POROSHQ/20陰離子交換層析預(yù)裝柱(AppliedBiosystems)，在AKTA純化儀(GEHealthcare)用0-600mMNaCl進行梯度洗脫。通過考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE分析各個組分，然后合并。融合蛋白的第二步純化將第一步純化合并的樣品溶液濃縮以供此步純化，利用在PBS緩沖液中預(yù)平衡的Superdex7510/300GL凝膠過濾層析預(yù)裝柱(GEHealthcare)純化融合蛋白，考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE分析出峰的組分，然后合并。實施例8抗-CD3抗體與高親和性αβ異質(zhì)二聚TCR的融合體的表達、復(fù)性和純化將抗-CD3的單鏈抗體(scFv)與αβ異質(zhì)二聚TCR融合，制備融合分子?？?CD3的scFv與TCR的β鏈融合，該TCRβ鏈可以包含任一上述高親和性αβ異質(zhì)二聚TCR的β鏈可變域，融合分子的TCRα鏈可以包含任一上述高親和性αβ異質(zhì)二聚TCR的α鏈可變域。融合分子表達載體的構(gòu)建1.α鏈表達載體的構(gòu)建將攜帶αβ異質(zhì)二聚TCR的α鏈的目的基因經(jīng)NcoⅠ和NotⅠ雙酶切，與經(jīng)過NcoⅠ和NotⅠ雙酶切的pET28a載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，涂布于含卡那霉素的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取陽性克隆進行PCR篩選，對陽性重組子進行測序，確定序列正確后抽提重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliTuner(DE3),用于表達。2.抗-CD3(scFv)-β鏈表達載體的構(gòu)建通過重疊(overlap)PCR的方法，設(shè)計引物將抗-CD3scFv和高親和性異質(zhì)二聚TCRβ鏈基因連接起來，中間的連接短肽(linker)為GGGGS，并且使抗-CD3的scFv與高親和性異質(zhì)二聚TCRβ鏈的融合蛋白的基因片段帶上限制性內(nèi)切酶位點NcoⅠ(CCATGG)和NotⅠ(GCGGCCGC)。將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)NcoⅠ和NotⅠ雙酶切，與經(jīng)過NcoⅠ和NotⅠ雙酶切的pET28a載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞，涂布含卡那霉素的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取陽性克隆進行PCR篩選，對陽性重組子進行測序，確定序列正確后抽提重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliTuner(DE3)感受態(tài)細胞，用于表達。融合蛋白的表達、復(fù)性及純化將表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化進入E.coliTuner(DE3)感受態(tài)細胞，涂布LB平板(卡那霉素50μg/mL)置于37℃培養(yǎng)過夜。次日，挑克隆接種至10mLLB液體培養(yǎng)基(卡那霉素50μg/mL)培養(yǎng)2-3h，按體積比1:100接種至1LLB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.5-0.8，加入終濃度為1mMIPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達。誘導(dǎo)4小時以后，以6000rpm離心10min收獲細胞。PBS緩沖液洗滌菌體一次，并且分裝菌體，取相當于200mL的細菌培養(yǎng)物的菌體用5mLBugBusterMasterMix(Merck)裂解細菌，以6000g離心15min收集包涵體。然后進行4次洗滌劑洗滌以去除細胞碎片和膜組分。然后，用緩沖液如PBS洗滌包涵體以除去洗滌劑和鹽。最終，將包涵體用含6M鹽酸胍,10mM二硫蘇糖醇(DTT),10mM乙二胺四乙酸(EDTA),20mMTris,pH8.1緩沖溶液溶解，并測定包涵體濃度，將其分裝后置于-80℃冷凍保存。溶解后的TCRα鏈和抗-CD3(scFv)-β鏈以2：5的質(zhì)量比快速混合于5M尿素(urea),0.4ML-精氨酸(L-arginine),20mMTrispH8.1,3.7mMcystamine,6.6mMβ-mercapoethylamine(4℃)，終濃度α鏈和抗-CD3(scFv)-β鏈分別為0.1mg/mL，0.25mg/mL。混合后將溶液置于10倍體積的去離子水中透析(4℃)，12小時后將去離子水換成緩沖液(10mMTris,pH8.0)繼續(xù)于4℃透析12小時。透析完成后的溶液經(jīng)0.45μM的濾膜過濾后，通過陰離子交換柱(HiTrapQHP5ml,GEhealthcare)純化。洗脫峰含有復(fù)性成功的TCRα鏈與抗-CD3(scFv)-β鏈二聚體的TCR通過SDS-PAGE膠確認。TCR融合分子隨后通過尺寸排阻色譜法(S-10016/60，GEhealthcare)進一步純化，以及陰離子交換柱(HiTrapQHP5ml,GEhealthcare)再次純化。純化后的TCR融合分子純度經(jīng)過SDS-PAGE測定大于90％，濃度由BCA法測定。實施例9抗-CD3抗體與高親和性單鏈TCR的融合體的細胞功能及特異性本實施例證明了抗-CD3抗體與高親和性單鏈TCR的融合體能夠介導(dǎo)效應(yīng)細胞對RHAMM抗原陽性癌細胞識別與激活功能。將實施例7中制備的抗-CD3抗體與高親和性單鏈TCR的融合體通過ELISPOT實驗檢測其在細胞中的功能及特異性。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知利用ELISPOT實驗檢測細胞功能的方法。本實施例IFN-γELISPOT實驗中所用的效應(yīng)細胞為從健康志愿者的血液中分離到的CD8+T細胞，靶細胞系為抗原(RHAMM)陽性的IM9(674)和Mel526(390)細胞，對照組為HLA陰性(A2-)的SK-BR-3細胞。首先準備ELISPOT平板。實驗第0天，ELISPOT平板乙醇活化包被，4℃過夜。實驗第1天，去掉包被液，洗滌封閉，室溫下孵育兩個小時，去除封閉液，按以下順序?qū)⒃囼灥母鱾€組分加入ELISPOT平板：培養(yǎng)基調(diào)整CD8+T細胞至8X104個細胞/毫升，培養(yǎng)基調(diào)整各靶細胞系至2X105個細胞/毫升，培養(yǎng)基將蛋白稀釋至濃度為0.04μM，逐一10倍梯度稀釋，共6個濃度梯度?；旌暇鶆蚝笕?0μL蛋白稀釋液、100μL靶細胞系2X105個細胞/毫升(即20,000個細胞/孔)、50μL效應(yīng)細胞8X104個細胞/毫升(即40,00個效應(yīng)細胞/孔)加入對應(yīng)孔中，并設(shè)置二個復(fù)孔。溫育過夜(37℃，5％CO2)。實驗第2天，洗滌平板并進行二級檢測和顯色，干燥平板，再利用免疫斑點平板讀數(shù)計(ELISPOTREADERsystem；AID20公司)計數(shù)膜上形成的斑點。實驗結(jié)果如圖13所示，相較于對照組SK-BR-3細胞，抗-CD3抗體與高親和性單鏈TCR的融合體介導(dǎo)的效應(yīng)細胞在抗原(RHAMM)陽性的IM9和Mel526細胞系有特異性反應(yīng)。實施例10抗-CD3抗體與高親和性αβ異質(zhì)二聚TCR的融合體的細胞功能及特異性本實施例證明了抗-CD3抗體與高親和性αβ異質(zhì)二聚TCR的融合體能夠介導(dǎo)效應(yīng)細胞識別RHAMM抗原陽性癌細胞識別與激活功能。將實施例八中制備的抗-CD3抗體與高親和性αβ異質(zhì)二聚TCR的融合體通過ELISPOT實驗檢測其在細胞中的功能及特異性。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知利用ELISPOT實驗檢測細胞功能的方法。本實施例IFN-γELISPOT實驗中所用的效應(yīng)細胞為從健康志愿者的血液中分離到的CD8+T細胞，靶細胞系為抗原(RHAMM)陽性的IM9(674)和Mel526(390)細胞，對照組為HLA陰性(A2-)的SK-BR-3細胞。首先準備ELISPOT平板。實驗第0天，ELISPOT平板乙醇活化包被，4℃過夜。實驗第1天，去掉包被液，洗滌封閉，室溫下孵育兩個小時，去除封閉液，按以下順序?qū)⒃囼灥母鱾€組分加入ELISPOT平板：培養(yǎng)基調(diào)整CD8+T細胞至8X104個細胞/毫升，培養(yǎng)基調(diào)整各靶細胞系至2X105個細胞/毫升，培養(yǎng)基將蛋白稀釋至濃度為0.04μM，逐一10倍梯度稀釋，共6個濃度梯度?；旌暇鶆蚝笕?0μL蛋白稀釋液、100μL靶細胞系2X105個細胞/毫升(即20,000個細胞/孔)、50μL效應(yīng)細胞8X104個細胞/毫升(即40,00個效應(yīng)細胞/孔)加入對應(yīng)孔中，并設(shè)置二個復(fù)孔。溫育過夜(37℃，5％CO2)。實驗第2天，洗滌平板并進行二級檢測和顯色，干燥平板，再利用免疫斑點平板讀數(shù)計(ELISPOTREADERsystem；AID20公司)計數(shù)膜上形成的斑點。實驗結(jié)果如圖14所示，相較于對照組SK-BR-3細胞，抗-CD3抗體與高親和性αβ異質(zhì)二聚TCR的融合體介導(dǎo)的效應(yīng)細胞在抗原(RHAMM)陽性的IM9和Mel526細胞系有特異性反應(yīng)。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>廣州市香雪制藥股份有限公司<120>針對RHAMM抗原短肽的高親和力T細胞受體<130>P2016-1675<150>CN201510570265.X<151>2015-09-09<160>84<170>PatentInversion3.5<210>1<211>247<212>PRT<213>人工序列<400>1GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspArgValSerGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnSerGlyTyr859095AlaLeuAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsnGlyGly100105110GlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGly115120125SerGluGlyGlyThrGlySerGlnThrIleHisGlnThrProArgThr130135140LeuSerValProThrGlySerProValThrLeuGluCysThrValGlu145150155160GlyThrSerAsnProAsnLeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArg165170175GlyLeuArgLeuLeuPheTyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSer180185190GluValProGlnArgTyrSerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPhe195200205GluLeuSerIleLysLysValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeu210215220CysAlaTrpSerValAspGlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThr225230235240ArgLeuGluValAspAlaAla245<210>2<211>741<212>DNA<213>人工序列<400>2caaaaagaagttgaacaaaactcaggcccgctgtcggtcccggaaggcgaaaatgtctca60atcaactgtacctactcagatcgtgtgtcacagtcgtttttctggtatcgtcaatatccg120ggcaaaagtccggaactgattatgtcaatctattcgaacggcgataaagaagacggtcgt180ttcacggcacagctggataaaagctctcaatatgttagcctggaaattcgcgatattcag240ccgaacgacagcgcgacgtatttttgcgcggccaccaactctggctacgccctgaatttc300ggcaaaggcaccaaactgtcagtccataatggcggtggcagcgaaggtggcggttctgaa360ggcggtggcagtgaaggtggcggttccgaaggcggcaccggttctcagacgattcaccaa420accccgcgtacgctgtcagtgccgaccggctcgccggttaccctggaatgtacggtcgaa480ggcacctcaaacccgaatctgtattggtatcgtcaagatccgggccgtggtctgcgcctg540ctgttttattcggtgggcattggtcagatcagttccgaagttccgcaacgctacagcgca600tctcgtccgcaggaccgccaatttgaactgagtatcaaaaaagtcacgccgagtgattcc660gcattctatctgtgcgcttggtccgtggacggtgctgaacagtactttggtccgggcacc720cgtctggaagttgatgcggcc741<210>3<211>110<212>PRT<213>人工序列<400>3GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspArgValSerGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnSerGlyTyr859095AlaLeuAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsn100105110<210>4<211>113<212>PRT<213>人工序列<400>4SerGlnThrIleHisGlnThrProArgThrLeuSerValProThrGly151015SerProValThrLeuGluCysThrValGluGlyThrSerAsnProAsn202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArgGlyLeuArgLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnArgTyr505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheGluLeuSerIleLysLys65707580ValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeuCysAlaTrpSerValAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuGluValAspAla100105110Ala<210>5<211>24<212>PRT<213>人工序列<400>5GlyGlyGlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGlySerGluGly151015GlyGlySerGluGlyGlyThrGly20<210>6<211>110<212>PRT<213>人工序列<400>6GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnSerGlyTyr859095AlaLeuAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsn100105110<210>7<211>110<212>PRT<213>人工序列<400>7GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspLysLeuAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnSerGlyTyr859095AlaLeuAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsn100105110<210>8<211>110<212>PRT<213>人工序列<400>8GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspLysLeuAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyTyr859095HisMetAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsn100105110<210>9<211>110<212>PRT<213>人工序列<400>9GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspLysLeuAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095IleIleAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsn100105110<210>10<211>110<212>PRT<213>人工序列<400>10GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095IleIleAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsn100105110<210>11<211>110<212>PRT<213>人工序列<400>11GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspLysLeuAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyTyr859095HisMetAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsn100105110<210>12<211>110<212>PRT<213>人工序列<400>12GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspLysLeuAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095HisIleAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsn100105110<210>13<211>110<212>PRT<213>人工序列<400>13GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnAla202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyTyr859095ValMetAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsn100105110<210>14<211>110<212>PRT<213>人工序列<400>14GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspArgValSerGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095IlePheAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsn100105110<210>15<211>110<212>PRT<213>人工序列<400>15GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerLeuTyrArgGlyGlySerLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095HisIleAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsn100105110<210>16<211>110<212>PRT<213>人工序列<400>16GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrArgAsnGlyThrLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyTyr859095HisMetAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsn100105110<210>17<211>110<212>PRT<213>人工序列<400>17GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspMetLeuAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrArgAsnGlyThrLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyTyr859095HisMetAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsn100105110<210>18<211>110<212>PRT<213>人工序列<400>18GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerLeuTyrArgGlyGlySerLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095LeuIleAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsn100105110<210>19<211>110<212>PRT<213>人工序列<400>19GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrArgAsnGlyThrLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095IleIleAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsn100105110<210>20<211>110<212>PRT<213>人工序列<400>20GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerLeuTyrArgGlyGlySerLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyTyr859095ValMetAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsn100105110<210>21<211>110<212>PRT<213>人工序列<400>21GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerLeuTyrArgGlyGlySerLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095IleIleAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsn100105110<210>22<211>110<212>PRT<213>人工序列<400>22GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrArgAsnGlyThrLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095LeuIleAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsn100105110<210>23<211>113<212>PRT<213>人工序列<400>23SerGlnThrIleHisGlnThrProArgThrLeuSerValProThrGly151015SerProValThrLeuGluCysThrValGluProHisSerProArgLeu202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArgGlyLeuArgLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnArgTyr505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheGluLeuSerIleLysLys65707580ValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeuCysAlaTrpSerValAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuGluValAspAla100105110Ala<210>24<211>113<212>PRT<213>人工序列<400>24SerGlnThrIleHisGlnThrProArgThrLeuSerValProThrGly151015SerProValThrLeuGluCysThrValGluLeuSerAsnThrArgAla202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArgGlyLeuArgLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnArgTyr505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheGluLeuSerIleLysLys65707580ValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeuCysAlaTrpSerValAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuGluValAspAla100105110Ala<210>25<211>113<212>PRT<213>人工序列<400>25SerGlnThrIleHisGlnThrProArgThrLeuSerValProThrGly151015SerProValThrLeuGluCysThrValGluGlyThrSerAsnProAsn202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArgGlyLeuArgLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyValArgGlnIleSerSerGluValProGlnArgTyr505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheGluLeuSerIleLysLys65707580ValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeuCysAlaTrpSerValAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuGluValAspAla100105110Ala<210>26<211>113<212>PRT<213>人工序列<400>26SerGlnThrIleHisGlnThrProArgThrLeuSerValProThrGly151015SerProValThrLeuGluCysThrValGluGlyThrSerAsnProAsn202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArgGlyLeuArgLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnArgTyr505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheGluLeuSerIleLysLys65707580ValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeuCysSerTyrSerLeuAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuGluValAspAla100105110Ala<210>27<211>113<212>PRT<213>人工序列<400>27SerGlnThrIleHisGlnThrProArgThrLeuSerValProThrGly151015SerProValThrLeuGluCysThrValGluLeuArgTyrIleArgAla202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArgGlyLeuArgLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyValArgGlnIleSerSerGluValProGlnArgTyr505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheGluLeuSerIleLysLys65707580ValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeuCysAlaTrpSerValAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuGluValAspAla100105110Ala<210>28<211>113<212>PRT<213>人工序列<400>28SerGlnThrIleHisGlnThrProArgThrLeuSerValProThrGly151015SerProValThrLeuGluCysThrValGluLeuArgTyrIleArgAla202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArgGlyLeuArgLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnArgTyr505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheGluLeuSerIleLysLys65707580ValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeuCysAlaTrpSerLeuAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuGluValAspAla100105110Ala<210>29<211>113<212>PRT<213>人工序列<400>29SerGlnThrIleHisGlnThrProArgThrLeuSerValProThrGly151015SerProValThrLeuGluCysThrValGluProHisSerProArgLeu202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArgGlyLeuArgLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnArgTyr505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheGluLeuSerIleLysLys65707580ValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeuCysSerTyrSerLeuAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuGluValAspAla100105110Ala<210>30<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>30SerGlnThrIleHisGlnThrProArgThrLeuSerValProThrGly151015SerProValThrLeuGluCysThrValGluLeuAspAspLeuArgIle202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArgGlyLeuArgLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnArgTyr505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheGluLeuSerIleLysLys65707580ValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeuCysAlaTrpSerLeuAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuGluValAsp100105110<210>31<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>31SerGlnThrIleHisGlnThrProArgThrLeuSerValProThrGly151015SerProValThrLeuGluCysThrValGluLeuArgTyrIleArgAla202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArgGlyLeuArgLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnArgTyr505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheGluLeuSerIleLysLys65707580ValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeuCysSerTyrSerLeuAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuGluValAsp100105110<210>32<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>32SerGlnThrIleHisGlnThrProArgThrLeuSerValProThrGly151015SerProValThrLeuGluCysThrValGluProHisSerProArgLeu202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArgGlyLeuArgLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnArgTyr505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheGluLeuSerIleLysLys65707580ValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeuCysAlaTrpSerLeuAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuGluValAsp100105110<210>33<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>33SerGlnThrIleHisGlnThrProArgThrLeuSerValProThrGly151015SerProValThrLeuGluCysThrValGluProHisSerProArgLeu202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArgGlyLeuArgLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyValArgGlnIleSerSerGluValProGlnArgTyr505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheGluLeuSerIleLysLys65707580ValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeuCysAlaTrpSerValAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuGluValAsp100105110<210>34<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>34SerGlnThrIleHisGlnThrProArgThrLeuSerValProThrGly151015SerProValThrLeuGluCysThrValGluLeuAspAspLeuArgIle202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArgGlyLeuArgLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnArgTyr505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheGluLeuSerIleLysLys65707580ValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeuCysSerTyrSerLeuAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuGluValAsp100105110<210>35<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>35SerGlnThrIleHisGlnThrProArgThrLeuSerValProThrGly151015SerProValThrLeuGluCysThrValGluLeuAspAspLeuArgIle202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArgGlyLeuArgLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnArgTyr505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheGluLeuSerIleLysLys65707580ValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeuCysAlaTrpSerValAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuGluValAsp100105110<210>36<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>36GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015AlaIleAlaSerLeuAsnCysThrTyrSerAspArgValSerGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrSerGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAsnLysAlaSerGlnTyrValSerLeuLeuIleArgAspSerGln65707580ProSerAspSerAlaThrTyrLeuCysAlaAlaThrAsnSerGlyTyr859095AlaLeuAsnPheGlyLysGlyThrSerLeuLeuValThrProHis100105110<210>37<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>37SerGlnThrIleHisGlnTrpProAlaThrLeuValGlnProValGly151015SerProLeuSerLeuGluCysThrValGluGlyThrSerAsnProAsn202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAlaAlaGlyArgGlyLeuGlnLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnAsnLeu505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheIleLeuSerSerLysLys65707580LeuLeuLeuSerAspSerGlyPheTyrLeuCysAlaTrpSerValAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuThrValThr100105110<210>38<211>204<212>PRT<213>人工序列<400>38GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015AlaIleAlaSerLeuAsnCysThrTyrSerAspArgValSerGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrSerGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAsnLysAlaSerGlnTyrValSerLeuLeuIleArgAspSerGln65707580ProSerAspSerAlaThrTyrLeuCysAlaAlaThrAsnSerGlyTyr859095AlaLeuAsnPheGlyLysGlyThrSerLeuLeuValThrProHisIle100105110GlnAsnProAspProAlaValTyrGlnLeuArgAspSerLysSerSer115120125AspLysSerValCysLeuPheThrAspPheAspSerGlnThrAsnVal130135140SerGlnSerLysAspSerAspValTyrIleThrAspLysCysValLeu145150155160AspMetArgSerMetAspPheLysSerAsnSerAlaValAlaTrpSer165170175AsnLysSerAspPheAlaCysAlaAsnAlaPheAsnAsnSerIleIle180185190ProGluAspThrPhePheProSerProGluSerSer195200<210>39<211>241<212>PRT<213>人工序列<400>39SerGlnThrIleHisGlnTrpProAlaThrLeuValGlnProValGly151015SerProLeuSerLeuGluCysThrValGluGlyThrSerAsnProAsn202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAlaAlaGlyArgGlyLeuGlnLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnAsnLeu505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheIleLeuSerSerLysLys65707580LeuLeuLeuSerAspSerGlyPheTyrLeuCysAlaTrpSerValAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuThrValThrGlu100105110AspLeuLysAsnValPheProProGluValAlaValPheGluProSer115120125GluAlaGluIleSerHisThrGlnLysAlaThrLeuValCysLeuAla130135140ThrGlyPheTyrProAspHisValGluLeuSerTrpTrpValAsnGly145150155160LysGluValHisSerGlyValCysThrAspProGlnProLeuLysGlu165170175GlnProAlaLeuAsnAspSerArgTyrCysLeuSerSerArgLeuArg180185190ValSerAlaThrPheTrpGlnAsnProArgAsnHisPheArgCysGln195200205ValGlnPheTyrGlyLeuSerGluAsnAspGluTrpThrGlnAspArg210215220AlaLysProValThrGlnIleValSerAlaGluAlaTrpGlyArgAla225230235240Asp<210>40<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>40GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015AlaIleAlaSerLeuAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrSerGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAsnLysAlaSerGlnTyrValSerLeuLeuIleArgAspSerGln65707580ProSerAspSerAlaThrTyrLeuCysAlaAlaThrAsnSerGlyTyr859095AlaLeuAsnPheGlyLysGlyThrSerLeuLeuValThrProHis100105110<210>41<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>41GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015AlaIleAlaSerLeuAsnCysThrTyrSerAspLysLeuAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrSerGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAsnLysAlaSerGlnTyrValSerLeuLeuIleArgAspSerGln65707580ProSerAspSerAlaThrTyrLeuCysAlaAlaThrAsnSerGlyTyr859095AlaLeuAsnPheGlyLysGlyThrSerLeuLeuValThrProHis100105110<210>42<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>42GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015AlaIleAlaSerLeuAsnCysThrTyrSerAspArgValSerGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrSerGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAsnLysAlaSerGlnTyrValSerLeuLeuIleArgAspSerGln65707580ProSerAspSerAlaThrTyrLeuCysAlaAlaThrAsnAspGlyTyr859095HisMetAsnPheGlyLysGlyThrSerLeuLeuValThrProHis100105110<210>43<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>43GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015AlaIleAlaSerLeuAsnCysThrTyrSerAspArgValSerGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrSerGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAsnLysAlaSerGlnTyrValSerLeuLeuIleArgAspSerGln65707580ProSerAspSerAlaThrTyrLeuCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095IleIleAsnPheGlyLysGlyThrSerLeuLeuValThrProHis100105110<210>44<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>44GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015AlaIleAlaSerLeuAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrSerGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAsnLysAlaSerGlnTyrValSerLeuLeuIleArgAspSerGln65707580ProSerAspSerAlaThrTyrLeuCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095IleIleAsnPheGlyLysGlyThrSerLeuLeuValThrProHis100105110<210>45<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>45GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015AlaIleAlaSerLeuAsnCysThrTyrSerAspLysLeuAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrSerGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAsnLysAlaSerGlnTyrValSerLeuLeuIleArgAspSerGln65707580ProSerAspSerAlaThrTyrLeuCysAlaAlaThrAsnAspGlyTyr859095ValMetAsnPheGlyLysGlyThrSerLeuLeuValThrProHis100105110<210>46<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>46GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015AlaIleAlaSerLeuAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrSerGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAsnLysAlaSerGlnTyrValSerLeuLeuIleArgAspSerGln65707580ProSerAspSerAlaThrTyrLeuCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095HisIleAsnPheGlyLysGlyThrSerLeuLeuValThrProHis100105110<210>47<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>47GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015AlaIleAlaSerLeuAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnAla202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrSerGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAsnLysAlaSerGlnTyrValSerLeuLeuIleArgAspSerGln65707580ProSerAspSerAlaThrTyrLeuCysAlaAlaThrAsnAspGlyTyr859095ValMetAsnPheGlyLysGlyThrSerLeuLeuValThrProHis100105110<210>48<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>48GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015AlaIleAlaSerLeuAsnCysThrTyrSerAspArgValSerGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrSerGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAsnLysAlaSerGlnTyrValSerLeuLeuIleArgAspSerGln65707580ProSerAspSerAlaThrTyrLeuCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095IlePheAsnPheGlyLysGlyThrSerLeuLeuValThrProHis100105110<210>49<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>49GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015AlaIleAlaSerLeuAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrSerGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerLeuTyrArgGlyGlySerLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAsnLysAlaSerGlnTyrValSerLeuLeuIleArgAspSerGln65707580ProSerAspSerAlaThrTyrLeuCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095HisIleAsnPheGlyLysGlyThrSerLeuLeuValThrProHis100105110<210>50<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>50GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015AlaIleAlaSerLeuAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrSerGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrArgAsnGlyThrLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAsnLysAlaSerGlnTyrValSerLeuLeuIleArgAspSerGln65707580ProSerAspSerAlaThrTyrLeuCysAlaAlaThrAsnAspGlyTyr859095HisMetAsnPheGlyLysGlyThrSerLeuLeuValThrProHis100105110<210>51<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>51GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015AlaIleAlaSerLeuAsnCysThrTyrSerAspMetLeuAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrSerGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrArgAsnGlyThrLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAsnLysAlaSerGlnTyrValSerLeuLeuIleArgAspSerGln65707580ProSerAspSerAlaThrTyrLeuCysAlaAlaThrAsnAspGlyTyr859095HisMetAsnPheGlyLysGlyThrSerLeuLeuValThrProHis100105110<210>52<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>52GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015AlaIleAlaSerLeuAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrSerGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerLeuTyrArgGlyGlySerLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAsnLysAlaSerGlnTyrValSerLeuLeuIleArgAspSerGln65707580ProSerAspSerAlaThrTyrLeuCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095LeuIleAsnPheGlyLysGlyThrSerLeuLeuValThrProHis100105110<210>53<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>53GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015AlaIleAlaSerLeuAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrSerGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrArgAsnGlyThrLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAsnLysAlaSerGlnTyrValSerLeuLeuIleArgAspSerGln65707580ProSerAspSerAlaThrTyrLeuCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095IleIleAsnPheGlyLysGlyThrSerLeuLeuValThrProHis100105110<210>54<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>54GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015AlaIleAlaSerLeuAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrSerGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerLeuTyrArgGlyGlySerLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAsnLysAlaSerGlnTyrValSerLeuLeuIleArgAspSerGln65707580ProSerAspSerAlaThrTyrLeuCysAlaAlaThrAsnAspGlyTyr859095ValMetAsnPheGlyLysGlyThrSerLeuLeuValThrProHis100105110<210>55<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>55GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015AlaIleAlaSerLeuAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrSerGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerLeuTyrArgAsnGlyThrLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAsnLysAlaSerGlnTyrValSerLeuLeuIleArgAspSerGln65707580ProSerAspSerAlaThrTyrLeuCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095IleIleAsnPheGlyLysGlyThrSerLeuLeuValThrProHis100105110<210>56<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>56GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015AlaIleAlaSerLeuAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrSerGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrArgAsnGlyThrLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAsnLysAlaSerGlnTyrValSerLeuLeuIleArgAspSerGln65707580ProSerAspSerAlaThrTyrLeuCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095LeuIleAsnPheGlyLysGlyThrSerLeuLeuValThrProHis100105110<210>57<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>57SerGlnThrIleHisGlnTrpProAlaThrLeuValGlnProValGly151015SerProLeuSerLeuGluCysThrValGluProHisSerProArgLeu202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAlaAlaGlyArgGlyLeuGlnLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnAsnLeu505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheIleLeuSerSerLysLys65707580LeuLeuLeuSerAspSerGlyPheTyrLeuCysAlaTrpSerValAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuThrValThr100105110<210>58<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>58SerGlnThrIleHisGlnTrpProAlaThrLeuValGlnProValGly151015SerProLeuSerLeuGluCysThrValGluLeuSerAsnThrArgAla202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAlaAlaGlyArgGlyLeuGlnLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnAsnLeu505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheIleLeuSerSerLysLys65707580LeuLeuLeuSerAspSerGlyPheTyrLeuCysAlaTrpSerValAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuThrValThr100105110<210>59<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>59SerGlnThrIleHisGlnTrpProAlaThrLeuValGlnProValGly151015SerProLeuSerLeuGluCysThrValGluGlyThrSerAsnProAsn202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAlaAlaGlyArgGlyLeuGlnLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyValArgGlnIleSerSerGluValProGlnAsnLeu505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheIleLeuSerSerLysLys65707580LeuLeuLeuSerAspSerGlyPheTyrLeuCysAlaTrpSerValAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuThrValThr100105110<210>60<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>60SerGlnThrIleHisGlnTrpProAlaThrLeuValGlnProValGly151015SerProLeuSerLeuGluCysThrValGluGlyThrSerAsnProAsn202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAlaAlaGlyArgGlyLeuGlnLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnAsnLeu505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheIleLeuSerSerLysLys65707580LeuLeuLeuSerAspSerGlyPheTyrLeuCysSerTyrSerLeuAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuThrValThr100105110<210>61<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>61SerGlnThrIleHisGlnTrpProAlaThrLeuValGlnProValGly151015SerProLeuSerLeuGluCysThrValGluLeuArgTyrIleArgAla202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAlaAlaGlyArgGlyLeuGlnLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyValArgGlnIleSerSerGluValProGlnAsnLeu505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheIleLeuSerSerLysLys65707580LeuLeuLeuSerAspSerGlyPheTyrLeuCysAlaTrpSerValAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuThrValThr100105110<210>62<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>62SerGlnThrIleHisGlnTrpProAlaThrLeuValGlnProValGly151015SerProLeuSerLeuGluCysThrValGluLeuArgTyrIleArgAla202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAlaAlaGlyArgGlyLeuGlnLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnAsnLeu505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheIleLeuSerSerLysLys65707580LeuLeuLeuSerAspSerGlyPheTyrLeuCysAlaTrpSerLeuAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuThrValThr100105110<210>63<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>63SerGlnThrIleHisGlnTrpProAlaThrLeuValGlnProValGly151015SerProLeuSerLeuGluCysThrValGluProHisSerProArgLeu202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAlaAlaGlyArgGlyLeuGlnLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnAsnLeu505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheIleLeuSerSerLysLys65707580LeuLeuLeuSerAspSerGlyPheTyrLeuCysSerTyrSerLeuAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuThrValThr100105110<210>64<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>64SerGlnThrIleHisGlnTrpProAlaThrLeuValGlnProValGly151015SerProLeuSerLeuGluCysThrValGluLeuAspAspLeuArgIle202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAlaAlaGlyArgGlyLeuGlnLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnAsnLeu505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheIleLeuSerSerLysLys65707580LeuLeuLeuSerAspSerGlyPheTyrLeuCysAlaTrpSerLeuAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuThrValThr100105110<210>65<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>65SerGlnThrIleHisGlnTrpProAlaThrLeuValGlnProValGly151015SerProLeuSerLeuGluCysThrValGluLeuArgTyrIleArgAla202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAlaAlaGlyArgGlyLeuGlnLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnAsnLeu505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheIleLeuSerSerLysLys65707580LeuLeuLeuSerAspSerGlyPheTyrLeuCysSerTyrSerLeuAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuThrValThr100105110<210>66<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>66SerGlnThrIleHisGlnTrpProAlaThrLeuValGlnProValGly151015SerProLeuSerLeuGluCysThrValGluProHisSerProArgLeu202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAlaAlaGlyArgGlyLeuGlnLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnAsnLeu505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheIleLeuSerSerLysLys65707580LeuLeuLeuSerAspSerGlyPheTyrLeuCysAlaTrpSerLeuAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuThrValThr100105110<210>67<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>67SerGlnThrIleHisGlnTrpProAlaThrLeuValGlnProValGly151015SerProLeuSerLeuGluCysThrValGluProHisSerProArgLeu202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAlaAlaGlyArgGlyLeuGlnLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyValArgGlnIleSerSerGluValProGlnAsnLeu505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheIleLeuSerSerLysLys65707580LeuLeuLeuSerAspSerGlyPheTyrLeuCysAlaTrpSerValAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuThrValThr100105110<210>68<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>68SerGlnThrIleHisGlnTrpProAlaThrLeuValGlnProValGly151015SerProLeuSerLeuGluCysThrValGluLeuAspAspLeuArgIle202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAlaAlaGlyArgGlyLeuGlnLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnAsnLeu505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheIleLeuSerSerLysLys65707580LeuLeuLeuSerAspSerGlyPheTyrLeuCysSerTyrSerLeuAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuThrValThr100105110<210>69<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>69SerGlnThrIleHisGlnTrpProAlaThrLeuValGlnProValGly151015SerProLeuSerLeuGluCysThrValGluLeuAspAspLeuArgIle202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAlaAlaGlyArgGlyLeuGlnLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnAsnLeu505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheIleLeuSerSerLysLys65707580LeuLeuLeuSerAspSerGlyPheTyrLeuCysAlaTrpSerValAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuThrValThr100105110<210>70<211>496<212>PRT<213>人工序列<400>70GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnSerGlyTyr859095AlaLeuAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsnGlyGly100105110GlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGly115120125SerGluGlyGlyThrGlySerGlnThrIleHisGlnThrProArgThr130135140LeuSerValProThrGlySerProValThrLeuGluCysThrValGlu145150155160GlyThrSerAsnProAsnLeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArg165170175GlyLeuArgLeuLeuPheTyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSer180185190GluValProGlnArgTyrSerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPhe195200205GluLeuSerIleLysLysValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeu210215220CysAlaTrpSerValAspGlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThr225230235240ArgLeuGluValAspGlyGlyGlyGlySerGluValGlnLeuValGlu245250255SerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySerLeuArgLeuSerCys260265270AlaAlaSerGlyTyrSerPheThrGlyTyrThrMetAsnTrpValArg275280285GlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValAlaLeuIleAsnProTyr290295300LysGlyValSerThrTyrAsnGlnLysPheLysAspArgPheThrIle305310315320SerValAspLysSerLysAsnThrAlaTyrLeuGlnMetAsnSerLeu325330335ArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgSerGlyTyrTyr340345350GlyAspSerAspTrpTyrPheAspValTrpGlyGlnGlyThrLeuVal355360365ThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly370375380GlyGlySerGlyGlyAlaIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeu385390395400SerAlaSerValGlyAspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGln405410415AspIleArgAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAla420425430ProLysLeuLeuIleTyrTyrThrSerArgLeuGluSerGlyValPro435440445SerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspTyrThrLeuThrIle450455460SerSerLeuGlnProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnGly465470475480AsnThrLeuProTrpThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys485490495<210>71<211>496<212>PRT<213>人工序列<400>71GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerLeuTyrArgGlyGlySerLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyTyr859095ValMetAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsnGlyGly100105110GlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGly115120125SerGluGlyGlyThrGlySerGlnThrIleHisGlnThrProArgThr130135140LeuSerValProThrGlySerProValThrLeuGluCysThrValGlu145150155160LeuAspAspLeuArgIleLeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArg165170175GlyLeuArgLeuLeuPheTyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSer180185190GluValProGlnArgTyrSerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPhe195200205GluLeuSerIleLysLysValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeu210215220CysAlaTrpSerLeuAspGlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThr225230235240ArgLeuGluValAspGlyGlyGlyGlySerGluValGlnLeuValGlu245250255SerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySerLeuArgLeuSerCys260265270AlaAlaSerGlyTyrSerPheThrGlyTyrThrMetAsnTrpValArg275280285GlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValAlaLeuIleAsnProTyr290295300LysGlyValSerThrTyrAsnGlnLysPheLysAspArgPheThrIle305310315320SerValAspLysSerLysAsnThrAlaTyrLeuGlnMetAsnSerLeu325330335ArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgSerGlyTyrTyr340345350GlyAspSerAspTrpTyrPheAspValTrpGlyGlnGlyThrLeuVal355360365ThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly370375380GlyGlySerGlyGlyAlaIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeu385390395400SerAlaSerValGlyAspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGln405410415AspIleArgAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAla420425430ProLysLeuLeuIleTyrTyrThrSerArgLeuGluSerGlyValPro435440445SerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspTyrThrLeuThrIle450455460SerSerLeuGlnProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnGly465470475480AsnThrLeuProTrpThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys485490495<210>72<211>496<212>PRT<213>人工序列<400>72GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrArgAsnGlyThrLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095IleIleAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsnGlyGly100105110GlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGly115120125SerGluGlyGlyThrGlySerGlnThrIleHisGlnThrProArgThr130135140LeuSerValProThrGlySerProValThrLeuGluCysThrValGlu145150155160LeuArgTyrIleArgAlaLeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArg165170175GlyLeuArgLeuLeuPheTyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSer180185190GluValProGlnArgTyrSerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPhe195200205GluLeuSerIleLysLysValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeu210215220CysSerTyrSerLeuAspGlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThr225230235240ArgLeuGluValAspGlyGlyGlyGlySerGluValGlnLeuValGlu245250255SerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySerLeuArgLeuSerCys260265270AlaAlaSerGlyTyrSerPheThrGlyTyrThrMetAsnTrpValArg275280285GlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValAlaLeuIleAsnProTyr290295300LysGlyValSerThrTyrAsnGlnLysPheLysAspArgPheThrIle305310315320SerValAspLysSerLysAsnThrAlaTyrLeuGlnMetAsnSerLeu325330335ArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgSerGlyTyrTyr340345350GlyAspSerAspTrpTyrPheAspValTrpGlyGlnGlyThrLeuVal355360365ThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly370375380GlyGlySerGlyGlyAlaIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeu385390395400SerAlaSerValGlyAspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGln405410415AspIleArgAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAla420425430ProLysLeuLeuIleTyrTyrThrSerArgLeuGluSerGlyValPro435440445SerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspTyrThrLeuThrIle450455460SerSerLeuGlnProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnGly465470475480AsnThrLeuProTrpThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys485490495<210>73<211>496<212>PRT<213>人工序列<400>73GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrArgAsnGlyThrLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095IleIleAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsnGlyGly100105110GlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyAsp115120125SerGluGlyGlyThrGlySerGlnThrIleHisGlnThrProArgThr130135140LeuSerValProThrGlySerProValThrLeuGluCysThrValGlu145150155160LeuArgTyrIleArgAlaLeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArg165170175GlyLeuArgLeuLeuPheTyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSer180185190GluValProGlnArgTyrSerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPhe195200205GluLeuSerIleLysLysValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeu210215220CysAlaTrpSerLeuAspGlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThr225230235240ArgLeuGluValAspGlyGlyGlyGlySerGluValGlnLeuValGlu245250255SerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySerLeuArgLeuSerCys260265270AlaAlaSerGlyTyrSerPheThrGlyTyrThrMetAsnTrpValArg275280285GlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValAlaLeuIleAsnProTyr290295300LysGlyValSerThrTyrAsnGlnLysPheLysAspArgPheThrIle305310315320SerValAspLysSerLysAsnThrAlaTyrLeuGlnMetAsnSerLeu325330335ArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgSerGlyTyrTyr340345350GlyAspSerAspTrpTyrPheAspValTrpGlyGlnGlyThrLeuVal355360365ThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly370375380GlyGlySerGlyGlyAlaIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeu385390395400SerAlaSerValGlyAspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGln405410415AspIleArgAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAla420425430ProLysLeuLeuIleTyrTyrThrSerArgLeuGluSerGlyValPro435440445SerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspTyrThrLeuThrIle450455460SerSerLeuGlnProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnGly465470475480AsnThrLeuProTrpThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys485490495<210>74<211>496<212>PRT<213>人工序列<400>74GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrArgAsnGlyThrLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyTyr859095HisMetAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsnGlyGly100105110GlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGly115120125SerGluGlyGlyThrGlySerGlnThrIleHisGlnThrProArgThr130135140LeuSerValProThrGlySerProValThrLeuGluCysThrValGlu145150155160ProHisSerProArgLeuLeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArg165170175GlyLeuArgLeuLeuPheTyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSer180185190GluValProGlnArgTyrSerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPhe195200205GluLeuSerIleLysLysValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeu210215220CysAlaTrpSerLeuAspGlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThr225230235240ArgLeuGluValAspGlyGlyGlyGlySerGluValGlnLeuValGlu245250255SerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySerLeuArgLeuSerCys260265270AlaAlaSerGlyTyrSerPheThrGlyTyrThrMetAsnTrpValArg275280285GlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValAlaLeuIleAsnProTyr290295300LysGlyValSerThrTyrAsnGlnLysPheLysAspArgPheThrIle305310315320SerValAspLysSerLysAsnThrAlaTyrLeuGlnMetAsnSerLeu325330335ArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgSerGlyTyrTyr340345350GlyAspSerAspTrpTyrPheAspValTrpGlyGlnGlyThrLeuVal355360365ThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly370375380GlyGlySerGlyGlyAlaIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeu385390395400SerAlaSerValGlyAspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGln405410415AspIleArgAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAla420425430ProLysLeuLeuIleTyrTyrThrSerArgLeuGluSerGlyValPro435440445SerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspTyrThrLeuThrIle450455460SerSerLeuGlnProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnGly465470475480AsnThrLeuProTrpThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys485490495<210>75<211>496<212>PRT<213>人工序列<400>75GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrArgAsnGlyThrLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyTyr859095HisMetAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsnGlyGly100105110GlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGly115120125SerGluGlyGlyThrGlySerGlnThrIleHisGlnThrProArgThr130135140LeuSerValProThrGlySerProValThrLeuGluCysThrValGlu145150155160ProHisSerProArgLeuLeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArg165170175GlyLeuArgLeuLeuPheTyrSerValGlyValArgGlnIleSerSer180185190GluValProGlnArgTyrSerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPhe195200205GluLeuSerIleLysLysValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeu210215220CysAlaTrpSerValAspGlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThr225230235240ArgLeuGluValAspGlyGlyGlyGlySerGluValGlnLeuValGlu245250255SerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySerLeuArgLeuSerCys260265270AlaAlaSerGlyTyrSerPheThrGlyTyrThrMetAsnTrpValArg275280285GlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValAlaLeuIleAsnProTyr290295300LysGlyValSerThrTyrAsnGlnLysPheLysAspArgPheThrIle305310315320SerValAspLysSerLysAsnThrAlaTyrLeuGlnMetAsnSerLeu325330335ArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgSerGlyTyrTyr340345350GlyAspSerAspTrpTyrPheAspValTrpGlyGlnGlyThrLeuVal355360365ThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly370375380GlyGlySerGlyGlyAlaIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeu385390395400SerAlaSerValGlyAspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGln405410415AspIleArgAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAla420425430ProLysLeuLeuIleTyrTyrThrSerArgLeuGluSerGlyValPro435440445SerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspTyrThrLeuThrIle450455460SerSerLeuGlnProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnGly465470475480AsnThrLeuProTrpThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys485490495<210>76<211>496<212>PRT<213>人工序列<400>76GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerLeuTyrArgGlyGlySerLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095IleIleAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsnGlyGly100105110GlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGly115120125SerGluGlyGlyThrGlySerGlnThrIleHisGlnThrProArgThr130135140LeuSerValProThrGlySerProValThrLeuGluCysThrValGlu145150155160LeuArgTyrIleArgAlaLeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArg165170175GlyLeuArgLeuLeuPheTyrSerValGlyValArgGlnIleSerSer180185190GluValProGlnArgTyrSerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPhe195200205GluLeuSerIleLysLysValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeu210215220CysAlaTrpSerValAspGlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThr225230235240ArgLeuGluValAspGlyGlyGlyGlySerGluValGlnLeuValGlu245250255SerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySerLeuArgLeuSerCys260265270AlaAlaSerGlyTyrSerPheThrGlyTyrThrMetAsnTrpValArg275280285GlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValAlaLeuIleAsnProTyr290295300LysGlyValSerThrTyrAsnGlnLysPheLysAspArgPheThrIle305310315320SerValAspLysSerLysAsnThrAlaTyrLeuGlnMetAsnSerLeu325330335ArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgSerGlyTyrTyr340345350GlyAspSerAspTrpTyrPheAspValTrpGlyGlnGlyThrLeuVal355360365ThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly370375380GlyGlySerGlyGlyAlaIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeu385390395400SerAlaSerValGlyAspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGln405410415AspIleArgAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAla420425430ProLysLeuLeuIleTyrTyrThrSerArgLeuGluSerGlyValPro435440445SerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspTyrThrLeuThrIle450455460SerSerLeuGlnProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnGly465470475480AsnThrLeuProTrpThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys485490495<210>77<211>496<212>PRT<213>人工序列<400>77GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrArgAsnGlyThrLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095LeuIleAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsnGlyGly100105110GlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGly115120125SerGluGlyGlyThrGlySerGlnThrIleHisGlnThrProArgThr130135140LeuSerValProThrGlySerProValThrLeuGluCysThrValGlu145150155160LeuAspAspLeuArgIleLeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArg165170175GlyLeuArgLeuLeuPheTyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSer180185190GluValProGlnArgTyrSerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPhe195200205GluLeuSerIleLysLysValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeu210215220CysSerTyrSerLeuAspGlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThr225230235240ArgLeuGluValAspGlyGlyGlyGlySerGluValGlnLeuValGlu245250255SerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySerLeuArgLeuSerCys260265270AlaAlaSerGlyTyrSerPheThrGlyTyrThrMetAsnTrpValArg275280285GlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValAlaLeuIleAsnProTyr290295300LysGlyValSerThrTyrAsnGlnLysPheLysAspArgPheThrIle305310315320SerValAspLysSerLysAsnThrAlaTyrLeuGlnMetAsnSerLeu325330335ArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgSerGlyTyrTyr340345350GlyAspSerAspTrpTyrPheAspValTrpGlyGlnGlyThrLeuVal355360365ThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly370375380GlyGlySerGlyGlyAlaIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeu385390395400SerAlaSerValGlyAspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGln405410415AspIleArgAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAla420425430ProLysLeuLeuIleTyrTyrThrSerArgLeuGluSerGlyValPro435440445SerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspTyrThrLeuThrIle450455460SerSerLeuGlnProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnGly465470475480AsnThrLeuProTrpThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys485490495<210>78<211>496<212>PRT<213>人工序列<400>78GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrArgAsnGlyThrLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095LeuIleAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsnGlyGly100105110GlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGly115120125SerGluGlyGlyThrGlySerGlnThrIleHisGlnThrProArgThr130135140LeuSerValProThrGlySerProValThrLeuGluCysThrValGlu145150155160LeuArgTyrIleArgAlaLeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArg165170175GlyLeuArgLeuLeuPheTyrSerValGlyValArgGlnIleSerSer180185190GluValProGlnArgTyrSerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPhe195200205GluLeuSerIleLysLysValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeu210215220CysAlaTrpSerValAspGlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThr225230235240ArgLeuGluValAspGlyGlyGlyGlySerGluValGlnLeuValGlu245250255SerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySerLeuArgLeuSerCys260265270AlaAlaSerGlyTyrSerPheThrGlyTyrThrMetAsnTrpValArg275280285GlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValAlaLeuIleAsnProTyr290295300LysGlyValSerThrTyrAsnGlnLysPheLysAspArgPheThrIle305310315320SerValAspLysSerLysAsnThrAlaTyrLeuGlnMetAsnSerLeu325330335ArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgSerGlyTyrTyr340345350GlyAspSerAspTrpTyrPheAspValTrpGlyGlnGlyThrLeuVal355360365ThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly370375380GlyGlySerGlyGlyAlaIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeu385390395400SerAlaSerValGlyAspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGln405410415AspIleArgAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAla420425430ProLysLeuLeuIleTyrTyrThrSerArgLeuGluSerGlyValPro435440445SerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspTyrThrLeuThrIle450455460SerSerLeuGlnProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnGly465470475480AsnThrLeuProTrpThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys485490495<210>79<211>496<212>PRT<213>人工序列<400>79GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerLeuTyrArgGlyGlySerLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095HisIleAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsnGlyGly100105110GlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGly115120125SerGluGlyGlyThrGlySerGlnThrIleHisGlnThrProArgThr130135140LeuSerValProThrGlySerProValThrLeuGluCysThrValGlu145150155160LeuSerAsnThrArgAlaLeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArg165170175GlyLeuArgLeuLeuPheTyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSer180185190GluValProGlnArgTyrSerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPhe195200205GluLeuSerIleLysLysValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeu210215220CysAlaTrpSerValAspGlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThr225230235240ArgLeuGluValAspGlyGlyGlyGlySerGluValGlnLeuValGlu245250255SerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySerLeuArgLeuSerCys260265270AlaAlaSerGlyTyrSerPheThrGlyTyrThrMetAsnTrpValArg275280285GlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValAlaLeuIleAsnProTyr290295300LysGlyValSerThrTyrAsnGlnLysPheLysAspArgPheThrIle305310315320SerValAspLysSerLysAsnThrAlaTyrLeuGlnMetAsnSerLeu325330335ArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgSerGlyTyrTyr340345350GlyAspSerAspTrpTyrPheAspValTrpGlyGlnGlyThrLeuVal355360365ThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly370375380GlyGlySerGlyGlyAlaIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeu385390395400SerAlaSerValGlyAspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGln405410415AspIleArgAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAla420425430ProLysLeuLeuIleTyrTyrThrSerArgLeuGluSerGlyValPro435440445SerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspTyrThrLeuThrIle450455460SerSerLeuGlnProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnGly465470475480AsnThrLeuProTrpThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys485490495<210>80<211>496<212>PRT<213>人工序列<400>80GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnAspProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrArgAsnGlyThrLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095LeuIleAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsnGlyGly100105110GlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGly115120125SerGluGlyGlyThrGlySerGlnThrIleHisGlnThrProArgThr130135140LeuSerValProThrGlySerProValThrLeuGluCysThrValGlu145150155160LeuAspAspLeuArgIleLeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArg165170175GlyLeuArgLeuLeuPheTyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSer180185190GluValProGlnArgTyrSerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPhe195200205GluLeuSerIleLysLysValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeu210215220CysAlaTrpSerValAspGlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThr225230235240ArgLeuGluValAspGlyGlyGlyGlySerGluValGlnLeuValGlu245250255SerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySerLeuArgLeuSerCys260265270AlaAlaSerGlyTyrSerPheThrGlyTyrThrMetAsnTrpValArg275280285GlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValAlaLeuIleAsnProTyr290295300LysGlyValSerThrTyrAsnGlnLysPheLysAspArgPheThrIle305310315320SerValAspLysSerLysAsnThrAlaTyrLeuGlnMetAsnSerLeu325330335ArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgSerGlyTyrTyr340345350GlyAspSerAspTrpTyrPheAspValTrpGlyGlnGlyThrLeuVal355360365ThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly370375380GlyGlySerGlyGlyAlaIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeu385390395400SerAlaSerValGlyAspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGln405410415AspIleArgAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAla420425430ProLysLeuLeuIleTyrTyrThrSerArgLeuGluSerGlyValPro435440445SerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspTyrThrLeuThrIle450455460SerSerLeuGlnProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnGly465470475480AsnThrLeuProTrpThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys485490495<210>81<211>496<212>PRT<213>人工序列<400>81GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095HisIleAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsnGlyGly100105110GlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGly115120125SerGluGlyGlyThrGlySerGlnThrIleHisGlnThrProArgThr130135140LeuSerValProThrGlySerProValThrLeuGluCysThrValGlu145150155160GlyThrSerAsnProAsnLeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArg165170175GlyLeuArgLeuLeuPheTyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSer180185190GluValProGlnArgTyrSerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPhe195200205GluLeuSerIleLysLysValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeu210215220CysAlaTrpSerValAspGlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThr225230235240ArgLeuGluValAspGlyGlyGlyGlySerGluValGlnLeuValGlu245250255SerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySerLeuArgLeuSerCys260265270AlaAlaSerGlyTyrSerPheThrGlyTyrThrMetAsnTrpValArg275280285GlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValAlaLeuIleAsnProTyr290295300LysGlyValSerThrTyrAsnGlnLysPheLysAspArgPheThrIle305310315320SerValAspLysSerLysAsnThrAlaTyrLeuGlnMetAsnSerLeu325330335ArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgSerGlyTyrTyr340345350GlyAspSerAspTrpTyrPheAspValTrpGlyGlnGlyThrLeuVal355360365ThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly370375380GlyGlySerGlyGlyAlaIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeu385390395400SerAlaSerValGlyAspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGln405410415AspIleArgAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAla420425430ProLysLeuLeuIleTyrTyrThrSerArgLeuGluSerGlyValPro435440445SerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspTyrThrLeuThrIle450455460SerSerLeuGlnProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnGly465470475480AsnThrLeuProTrpThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys485490495<210>82<211>496<212>PRT<213>人工序列<400>82GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015GluAsnValSerIleAsnCysThrTyrSerAspIleTyrAsnGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrProGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrArgAsnGlyThrLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAspLysSerSerGlnTyrValSerLeuGluIleArgAspIleGln65707580ProAsnAspSerAlaThrTyrPheCysAlaAlaThrAsnAspGlyIle859095IleIleAsnPheGlyLysGlyThrLysLeuSerValHisAsnGlyGly100105110GlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGly115120125SerGluGlyGlyThrGlySerGlnThrIleHisGlnThrProArgThr130135140LeuSerValProThrGlySerProValThrLeuGluCysThrValGlu145150155160LeuArgTyrIleArgAlaLeuTyrTrpTyrArgGlnAspProGlyArg165170175GlyLeuArgLeuLeuPheTyrSerValGlyValArgGlnIleSerSer180185190GluValProGlnArgTyrSerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPhe195200205GluLeuSerIleLysLysValThrProSerAspSerAlaPheTyrLeu210215220CysAlaTrpSerValAspGlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThr225230235240ArgLeuGluValAspGlyGlyGlyGlySerGluValGlnLeuValGlu245250255SerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySerLeuArgLeuSerCys260265270AlaAlaSerGlyTyrSerPheThrGlyTyrThrMetAsnTrpValArg275280285GlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValAlaLeuIleAsnProTyr290295300LysGlyValSerThrTyrAsnGlnLysPheLysAspArgPheThrIle305310315320SerValAspLysSerLysAsnThrAlaTyrLeuGlnMetAsnSerLeu325330335ArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgSerGlyTyrTyr340345350GlyAspSerAspTrpTyrPheAspValTrpGlyGlnGlyThrLeuVal355360365ThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly370375380GlyGlySerGlyGlyAlaIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeu385390395400SerAlaSerValGlyAspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGln405410415AspIleArgAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAla420425430ProLysLeuLeuIleTyrTyrThrSerArgLeuGluSerGlyValPro435440445SerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspTyrThrLeuThrIle450455460SerSerLeuGlnProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnGly465470475480AsnThrLeuProTrpThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys485490495<210>83<211>204<212>PRT<213>人工序列<400>83GlnLysGluValGluGlnAsnSerGlyProLeuSerValProGluGly151015AlaIleAlaSerLeuAsnCysThrTyrSerAspArgValSerGlnSer202530PhePheTrpTyrArgGlnTyrSerGlyLysSerProGluLeuIleMet354045SerIleTyrSerAsnGlyAspLysGluAspGlyArgPheThrAlaGln505560LeuAsnLysAlaSerGlnTyrValSerLeuLeuIleArgAspSerGln65707580ProSerAspSerAlaThrTyrLeuCysAlaAlaThrAsnSerGlyTyr859095AlaLeuAsnPheGlyLysGlyThrSerLeuLeuValThrProHisIle100105110GlnAsnProAspProAlaValTyrGlnLeuArgAspSerLysSerSer115120125AspLysSerValCysLeuPheThrAspPheAspSerGlnThrAsnVal130135140SerGlnSerLysAspSerAspValTyrIleThrAspLysThrValLeu145150155160AspMetArgSerMetAspPheLysSerAsnSerAlaValAlaTrpSer165170175AsnLysSerAspPheAlaCysAlaAsnAlaPheAsnAsnSerIleIle180185190ProGluAspThrPhePheProSerProGluSerSer195200<210>84<211>241<212>PRT<213>人工序列<400>84SerGlnThrIleHisGlnTrpProAlaThrLeuValGlnProValGly151015SerProLeuSerLeuGluCysThrValGluGlyThrSerAsnProAsn202530LeuTyrTrpTyrArgGlnAlaAlaGlyArgGlyLeuGlnLeuLeuPhe354045TyrSerValGlyIleGlyGlnIleSerSerGluValProGlnAsnLeu505560SerAlaSerArgProGlnAspArgGlnPheIleLeuSerSerLysLys65707580LeuLeuLeuSerAspSerGlyPheTyrLeuCysAlaTrpSerValAsp859095GlyAlaGluGlnTyrPheGlyProGlyThrArgLeuThrValThrGlu100105110AspLeuLysAsnValPheProProGluValAlaValPheGluProSer115120125GluAlaGluIleSerHisThrGlnLysAlaThrLeuValCysLeuAla130135140ThrGlyPheTyrProAspHisValGluLeuSerTrpTrpValAsnGly145150155160LysGluValHisSerGlyValSerThrAspProGlnProLeuLysGlu165170175GlnProAlaLeuAsnAspSerArgTyrCysLeuSerSerArgLeuArg180185190ValSerAlaThrPheTrpGlnAsnProArgAsnHisPheArgCysGln195200205ValGlnPheTyrGlyLeuSerGluAsnAspGluTrpThrGlnAspArg210215220AlaLysProValThrGlnIleValSerAlaGluAlaTrpGlyArgAla225230235240Asp當前第1頁1 2 3