背景技術(shù)：
：1型糖尿病(T1DM)是一種自身免疫疾病，其特征是代謝功能障礙，最顯著的是葡萄糖代謝調(diào)節(jié)異常，伴隨著特有的長期血管與神經(jīng)并發(fā)癥。T1DM是最常見的自身免疫疾病之一，在美國，每250名個(gè)體中就有一名受其影響，且每年報(bào)告約10,000-15,000的新病例，發(fā)病率持續(xù)增長。發(fā)現(xiàn)T1DM的最高患病率在北歐，其中，每150名芬蘭人中就有一名在15歲發(fā)展T1DM。不同的是，T1DM在黑人和亞洲種群中較不常見，其患病頻率低于白人種群中的一半。T1DM的特點(diǎn)是絕對的胰島素缺乏，這使得患者需要依賴外源性的胰島素來維持生存。在T1DM以高血糖癥的癥狀臨床發(fā)作之前，存在較長的無癥狀臨床前階段，其中胰島素生產(chǎn)型β細(xì)胞被逐漸摧毀。貝它細(xì)胞(β細(xì)胞)的自身免疫性破壞與淋巴細(xì)胞性浸潤相關(guān)聯(lián)。此外，已在動(dòng)物模型和人T1DM中鑒定出了MHCI類抗原在細(xì)胞表面上呈遞的異常。該免疫異常可以解釋為什么人類變得無法耐受自身抗原，盡管仍不清楚為什么僅僅β細(xì)胞被優(yōu)先摧毀。有充分證據(jù)證明CD8+T細(xì)胞涉及導(dǎo)致T1DM的疾病過程(LiblauImmunity.2002年7月；17(1):1-6)。對患病個(gè)體的胰島進(jìn)行組織學(xué)分析顯示CD8+T細(xì)胞的浸潤(Bottazzo等.1985N.Engl.J.Med.313:353-360)。T1DM的動(dòng)物模型中，該疾病過程可利用CD8+T細(xì)胞從患病動(dòng)物轉(zhuǎn)移到健康動(dòng)物。在T1DM的發(fā)展與某些HLAI類分子之間存在遺傳上的關(guān)聯(lián)，所述HLAI類分子對于CD8+靶向識別是至關(guān)重要的(Todd等.2007Nat.Genet.39:857-864和Marron等.2002Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:13753-13758.)。最終，活化的CD8+T細(xì)胞存在于發(fā)展T1DM的高風(fēng)險(xiǎn)對象的循環(huán)中(Skowera等.2008JClinInvest.118:3390-402)。早期、發(fā)作后階段中的1型糖尿病的抗原特異性免疫治療具有阻止疾病進(jìn)展并保護(hù)剩余的胰島細(xì)胞功能的可能。也可考慮進(jìn)行安全的免疫治療來對胰島同種異體移植物進(jìn)行保護(hù)，和對存在I型糖尿病的強(qiáng)遺傳素質(zhì)的情況進(jìn)行預(yù)防。胰島β細(xì)胞受Foxp3表達(dá)型調(diào)節(jié)性CD4+T細(xì)胞(Treg)的天然保護(hù)而不被病原性T細(xì)胞影響(參見Wildin等，(2001)NatGenet.27(1):18-20)，并且已確定由過繼性轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)需要對于胰島細(xì)胞抗原的識別(參見Tonkin等,(2008)JImmunol.181(7):4516-22)。已從患病個(gè)體分離出多種糖尿病特異性人自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞(Skowera等.2008JClinInvest.118:3390-402和Lieberman等.ProcNatlAcadSciU.S.A.2003年7月8；100(14):8384-8)。這些T細(xì)胞具有T細(xì)胞受體(TCR)，其主要識別β細(xì)胞抗原例如初前-胰島素(PPI)的肽表位。ALWGPDPAAA15-24(SEQIDNO:1)肽是一種此類的肽，其源自人PPI的信號序列(Skowera等.2008JClinInvest.118:3390-402和WO2009004315)。該肽載于HLA-A*02分子上，并且在胰島素生產(chǎn)型β細(xì)胞的表面上呈遞。因此，ALWGPDPAAA–HLA-A*02復(fù)合物提供能夠被TCR識別的人β細(xì)胞特異性標(biāo)志物。需要提供用于診斷和治療T1DM的組合物。按照本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供一種T細(xì)胞受體(TCR)，其具有結(jié)合ALWGPDPAAA(SEQIDNO:1)HLA-A*02復(fù)合物的性質(zhì)，并且包含TCRα鏈可變結(jié)構(gòu)域和TCRβ鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述α鏈可變結(jié)構(gòu)域包含與SEQIDNO:2的氨基酸殘基1-112的序列有至少90％相同性的氨基酸序列，和所述β鏈可變結(jié)構(gòu)域包含與SEQIDNO:3的氨基酸殘基1-116的序列有至少90％相同性的氨基酸序列。其中，所述α鏈可變結(jié)構(gòu)域具有如下取代中的至少一個(gè)，參照SEQIDNO:2的編號：和/或至少一個(gè)氨基酸插入，和/或所述β鏈可變結(jié)構(gòu)域具有如下取代中的至少一個(gè)，參照SEQIDNO:3的編號：基于本發(fā)明的TCR分子的治療劑可用于遞送免疫抑制劑至β細(xì)胞以防止其被CD8+T細(xì)胞摧毀的目的。所述免疫抑制劑包含抗體片段或細(xì)胞因子。靶向ALWGPDPAAA–HLA-A*02復(fù)合物的TCR也可用于稱為過繼性治療的治療方案。已知用MHCI類限制型TCR轉(zhuǎn)染的T調(diào)節(jié)性細(xì)胞(Treg)能夠產(chǎn)生相較于未經(jīng)轉(zhuǎn)染的Treg有所增強(qiáng)的對于T效應(yīng)細(xì)胞的抑制(Plesa等.2012Blood.119(15):3420-3430)，并且所述細(xì)胞在自身免疫疾病的治療中具有極大潛能(Wright等.2011ExpertRevClinImmunol.7(2):213-25)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)構(gòu)成CD4+T淋巴細(xì)胞總?cè)后w中的小部分(5-10％)(Powrie等，(2003)Science299(5609):1030-1)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特點(diǎn)是，CD25和Foxp3轉(zhuǎn)錄因子的組成型表達(dá)。其中Treg細(xì)胞被減少或被功能改變的嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已顯示多種自身免疫疾病(包括自身免疫甲狀腺炎、胃炎和1型糖尿病)的自行發(fā)展(Hori等，(2003)Science299(5609):1057-61)。已顯示CD4+CD25+Treg細(xì)胞的水平在NOD小鼠和患有T1DM的患者中較低，NOD小鼠是一種自行發(fā)展T1DM的非肥胖型糖尿病小鼠，相比正常對照(Wu等，(2002)ProcNatlAcadSciUSA99(19):12287-92)。可利用向NOD小鼠注射CD4+CD25+Treg細(xì)胞來預(yù)防T1DM(Wu等，(2002)ProcNatlAcadSciUSA99(19):12287-92)。因?yàn)镹OD小鼠發(fā)展自發(fā)性糖尿病，將NOD小鼠模型用作人自體免疫的原型模型，其緊密反映人T1D的多種特征，例如，高血糖癥和導(dǎo)向針對胰島細(xì)胞的自身抗體的存在(Sgouroudis等，(2009)DiabetesMetabResRev25(3):208-18)。天然Treg的低頻率是其治療性應(yīng)用的重要限制。認(rèn)為叉頭/翼型螺旋轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化的首要促進(jìn)物(Hori等，(2003)Science299(5609):1057-61)。Foxp3的異位表達(dá)將原初CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成具有調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表型和功能特點(diǎn)的細(xì)胞(Hori等，(2003)Science299(5609):1057-61)，產(chǎn)生可用于治療性應(yīng)用的更大數(shù)量的Treg。已逐漸明晰，Treg的抗原特異性是通過Treg過繼性轉(zhuǎn)移進(jìn)行成功炎癥抑制所需的(Tonkin等，(2008)JImmunol.181(7):4516-22)。此外，Jaeckel等，(2005DIABETES54:306-310)發(fā)現(xiàn)，具有Foxp3的多克隆CD4+T細(xì)胞的逆病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)對于體內(nèi)干擾已建立的1型糖尿病而言并不有效。然而，給予Foxp3轉(zhuǎn)導(dǎo)的對于胰島抗原具有特異性的T細(xì)胞使患有近期發(fā)作的糖尿病的小鼠中的疾病穩(wěn)定并逆轉(zhuǎn)。Treg，作為CD4+細(xì)胞，識別由MHCII類呈遞的抗原，其僅在抗原呈遞細(xì)胞(APC)上表達(dá)。糖尿病患者中胰島細(xì)胞的損毀可能是因?yàn)榫窒抻贛HCII類表位的可獲得的Treg的小型庫(smallrepertoire)。MHCI類在幾乎全部體細(xì)胞上表達(dá)，并且胰島β細(xì)胞可能具有最高密度的糖尿病特異性抗原-I類MHC復(fù)合物。通過將對于所述抗原-I類MHC復(fù)合物的特異性和所述Treg的抑制物表型相結(jié)合而工程改造出的新型Treg能夠允許所述經(jīng)修飾的Treg對于在其它情況下支持胰島細(xì)胞的損毀的促炎性環(huán)境發(fā)揮最優(yōu)控制。本發(fā)明的TCR還可用作診斷性試劑以檢測呈遞ALWGPDPAAA–HLA-A*02復(fù)合物的細(xì)胞。在該情況中，所述TCR可融合至可檢測標(biāo)記物。為了確保ALWGPDPAAA–HLA-A*02呈遞β細(xì)胞的有效靶向，相較于下述參照PPITCR，本發(fā)明的TCR具有對于肽HLA復(fù)合物的改善的結(jié)合親和力和/或結(jié)合半衰期。希望本發(fā)明的某些TCR，例如用于遞送治療劑或用于診斷的那些，對于所述肽-HLA復(fù)合物具有高親和性和/或緩慢的解離率。使用國際免疫遺傳學(xué)(IMGT)TCR命名描述TCR并且連接到TCR序列的IMGT公共數(shù)據(jù)庫。天然α-β異二聚體TCR具有α鏈和β鏈。廣泛地，各鏈包含可變、連接和恒定區(qū)，并且β鏈通常含有可變區(qū)和連接區(qū)之間的短多變區(qū)，但是該多變區(qū)通常被認(rèn)為是連接區(qū)的部分。各可變區(qū)包含包埋于構(gòu)架序列中的3個(gè)CDR(互補(bǔ)決定區(qū))，一個(gè)是稱為CDR3的高變區(qū)。存在幾種類型的α鏈可變區(qū)(Vα)和幾種類型的β鏈可變區(qū)(Vβ)，它們通過它們的構(gòu)架、CDR1和CDR2序列，以及通過部分限定的CDR3序列區(qū)分。Vα型在IMGT命名中由獨(dú)特的TRAV數(shù)指代。因此，“TRAV12-3”定義具有獨(dú)特構(gòu)架和CDR1以及CDR2序列和CDR3序列的TCRVα，該CDR3部分被氨基酸序列定義，該氨基酸序列在TCR之間保守，但是其也包含TCR之間變化的氨基酸序列。以相同的方式，“TRBV12-4”定義了具有獨(dú)特的構(gòu)架與CDR1和CDR2序列，但是僅僅有部分定義的CDR3序列的TCRVβ區(qū)。類似地，TCR的連接區(qū)由獨(dú)特IMGTTRAJ和TRBJ命名所定義，并且恒定區(qū)由IMGTTRAC和TRBC命名所定義。β鏈多變區(qū)在IMGT命名中以縮寫TRBD提及并且如上所述，級聯(lián)的TRBD/TRBJ區(qū)通常一起被認(rèn)為是連接區(qū)。αβTCR的α和β鏈一般被認(rèn)為各自具有稱為可變和恒定結(jié)構(gòu)域的2個(gè)“結(jié)構(gòu)域”。可變結(jié)構(gòu)域由可變區(qū)和連接區(qū)的級聯(lián)組成。在本申請的說明書和權(quán)利要求中，術(shù)語“TCRα可變結(jié)構(gòu)域”因此是指TRAV和TRAJ區(qū)的級聯(lián)，并且術(shù)語TCRα恒定結(jié)構(gòu)域是指胞外TRAC區(qū)或者是指C-末端截短的TRAC序列。類似地，術(shù)語“TCRβ可變結(jié)構(gòu)域”是指TRBV和TRBD/TRBJ區(qū)的級聯(lián)，并且術(shù)語TCRβ恒定結(jié)構(gòu)域是指胞外TRBC區(qū)或者是指C-末端截短的TRBC序列。由IMGT命名定義的獨(dú)特序列是TCR領(lǐng)域工作人員廣泛熟知并可得的。例如，可在IMGT公共數(shù)據(jù)庫中檢索到它們?！禩細(xì)胞受體資料手冊》(TcellReceptorFactsbook)，(2001)LeFranc和LeFranc，學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress)，ISBN0-12-441352-8也公開了由IMGT命名定義的序列，但是由于其出版日期和隨后的時(shí)間延遲，其中的信息有時(shí)需要通過參考IMGT數(shù)據(jù)庫來確認(rèn)。天然(native)PPITCR具有如下α鏈和β鏈V、J和C基因應(yīng)用：α鏈-TRAV12-3/TRAJ12/TRAC(圖1中給出了天然PPITCRα鏈的胞外序列(SEQIDNO:2)。CDR由氨基酸27-32(CDR1)50-55(CDR2)和90-100(CDR3)確定。β鏈-TRBV12-4/TRBJ2-4/TRBD2*02/TRBC2(圖2中給出了天然PPITCRβ鏈的胞外序列(SEQIDNO:3))。注意，TRBD2序列具有在IMGT命名法中稱為TRBD2*01和*02的2個(gè)等位基因變體，并且上文所述的天然PPITCR克隆具有*02變化形式。還需注意，沒有限定符“*”表示相關(guān)序列僅已知一種等位基因。CDR由氨基酸27-31(CDR1)、49-54(CDR2)和93-106(CDR3)確定。術(shù)語“野生型TCR”、“天然TCR”、“野生型PPITCR”和“天然PPITCR”在本文中同義使用，表示具有分別為SEQIDNO:2和3的胞外α和β鏈的天然產(chǎn)生的TCR。包含分別由SEQIDNO:2和3所示的α和β鏈可變結(jié)構(gòu)域的分離的和/或重組和/或非天然產(chǎn)生的和/或工程改造的TCR形成本發(fā)明的其它方面。一種已知的PPITCR描述于Bulek等.2012NatImmunol.13:283-9和Skowera等.2008JClinInvest.118:3390-402，盡管相應(yīng)于包含分別由SEQIDNO:2和3所示的α和β鏈可變結(jié)構(gòu)域的TCR，該已知TCR在位置18具有Q而非β鏈中的E。出于提供可與本發(fā)明的TCR的結(jié)合特性比較的參照TCR的目的，方便使用具有圖3給出的原始PPITCRα鏈的胞外序列(SEQIDNO:4)和圖4給出的原始PPITCRβ鏈的胞外序列(SEQIDNO:5)的可溶性TCR。該TCR在本文中稱為“參照TCR”或“參照PPITCR”。注意，SEQIDNO:4是SEQIDNO:2的天然α鏈胞外序列，不同之處在于C159已取代T159(即，TRAC的T48)。同樣地，SEQIDNO:5是天然β鏈胞外序列IDNo3，不同之處在于C173已取代S173(即TRBC2恒定區(qū)的S57)，A191已取代C191，且D205已取代N205。這些與天然α和β鏈胞外序列相關(guān)的半胱氨酸取代能夠形成鏈間二硫鍵，其使得重折疊的可溶性TCR穩(wěn)定化，即通過重折疊胞外α和β鏈形成的TCR。使用穩(wěn)定的二硫鍵連接的可溶性TCR作為參照TCR能夠更方便地評價(jià)結(jié)合親和性和結(jié)合半衰期。本發(fā)明TCR可以是非天然產(chǎn)生和/或經(jīng)純化和/或經(jīng)工程改造的。發(fā)明人驚人地發(fā)現(xiàn)，α鏈可變結(jié)構(gòu)域中的插入以及取代會(huì)導(dǎo)致改善的結(jié)合親和性/增加的半衰期。本發(fā)明的TCR可具有存在于α鏈可變結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)插入。此外或或者，它們可具有存在于β鏈可變結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)插入。插入的氨基酸的數(shù)量可以在1-8、2-5范圍內(nèi)和/或可以是1、2、3、4或5個(gè)。當(dāng)前優(yōu)選插入2或3個(gè)氨基酸的情況。盡管不希望受理論限制，相信插入使CDR延長，并通過使CDR與肽-MHC復(fù)合物更為貼近而增加了它們的接觸。當(dāng)偶聯(lián)至可檢測標(biāo)記物或治療劑時(shí)，其中具有插入的TCR可合適用作治療試劑和/或診斷試劑。α鏈可變結(jié)構(gòu)域可具有在對應(yīng)于S28、F30、Y32、Y51、S52、S53、G54和/或D58的殘基之后緊鄰插入的至少一個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，所述α鏈可變結(jié)構(gòu)域可具有參照SEQIDNO:2的編號，在對應(yīng)于S28、Y32、Y51和/或S53的殘基之后緊鄰插入的至少一個(gè)氨基酸。在所述α鏈可變結(jié)構(gòu)域中，所述插入可以是在指示殘基(參照SEQIDNO:2的編號)之后的如下情況中的一種或多種：所述α鏈可變結(jié)構(gòu)域可具有單獨(dú)位于S28的插入或其與位于Y51或S53的插入相組合，或者具有單獨(dú)位于Y32的插入或其與位于Y51或S53的插入相組合。在所述α鏈可變結(jié)構(gòu)域中，所述插入可以是如下情況中的一種或多種(參照SEQIDNO:2的編號)：殘基編號插入S28QYDY32PAQY51QPW或MRIS53SFY所述插入可以是緊鄰S28之后插入的QYD，參照SEQIDNO:2的編號，任選地具有緊鄰S53之后額外插入的SFY，參照SEQIDNO:2的編號。或者，所述插入可以是緊鄰Y32之后的PAQ和緊鄰S53之后的SFY，參照SEQIDNO:2的編號。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，序列可彼此比較，通常本領(lǐng)域熟知的采用序列比對程序和/或算法(例如，BLAST、FASTA和MEGALIGN等)來進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地理解，在此類比對之中，當(dāng)突變包含殘基插入或缺失時(shí)，序列比對將在不包含所述插入或缺失的殘基的序列中引入"缺口"(通常由短劃線或"A"表示)。在某些實(shí)施方式中，在一個(gè)或兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域中存在2-11個(gè)取代?？稍谝粋€(gè)或兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域中存在2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個(gè)取代。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明TCR的α鏈可變結(jié)構(gòu)域可包含與SEQIDNO:2的氨基酸殘基1-112序列有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同性的氨基酸序列，只要所述α鏈可變結(jié)構(gòu)域具有至少一個(gè)上述插入和/或取代即可。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明TCR的β鏈可變結(jié)構(gòu)域可包含與SEQIDNO:3的氨基酸殘基1-116序列有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同性的氨基酸序列，只要所述β鏈可變結(jié)構(gòu)域具有至少一個(gè)上述取代即可。本發(fā)明的其它實(shí)施方式提供如下TCR，其包含如圖6和7中所示的突變的α鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:8-59)之一；和/或圖8中所示的突變的β鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:60-91)。本發(fā)明的特定實(shí)施方式提供如下TCR：其包含如SEQIDNO:32、55、56、57、58和59所示的突變的α鏈可變區(qū)氨基酸序列之一；和/或如SEQIDNO:90所示的突變的β鏈可變區(qū)氨基酸序列。可使用任何合適的方法進(jìn)行插入和取代，包括但不限于，基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、基于限制性酶的克隆或連接獨(dú)立克隆(LIC)法的那些方法。這些方法在許多的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)教科書中有詳細(xì)描述。對于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和基于限制性酶的克隆的進(jìn)一步詳述，參見Sambrook和Russell,(2001)《分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊》(MolecularCloning–ALaboratoryManual)(第3版)，CSHL出版社。關(guān)于連接獨(dú)立克隆(LIC)過程的其他信息可在Rashtchian，(1995)CurrOpinBiotechnol6(1):30-6中發(fā)現(xiàn)。本文所述的任意TCR的表型沉默變體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文所用的術(shù)語“表型沉默變體”理解為是指具有在本文下述的KD和結(jié)合半衰期范圍內(nèi)的對ALWGPDPAAA(SEQIDNO:1)HLA-A*02復(fù)合物的KD和/或結(jié)合半衰期的那些TCR。例如，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，可能產(chǎn)生與上文詳述的那些TCR相比在其恒定區(qū)和/或可變區(qū)摻入變化而沒有改變與ALWGPDPAAA(SEQIDNO:1)HLA-A*02復(fù)合物的相互作用所需的親和性的TCR。這類試驗(yàn)變體包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。其中已經(jīng)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)保守取代的那些TCR也形成本發(fā)明的部分?？赡苣軌蛟谄銫-末端和/或N-末端提供的序列截短1、2、3、4、5或更多個(gè)殘基，而不顯著影響TCR的結(jié)合性質(zhì)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是明顯的。本發(fā)明包括了所有這類試驗(yàn)變體。本發(fā)明的TCR具有結(jié)合ALWGPDPAAA(SEQIDNO:1)HLA-A*02復(fù)合物的性質(zhì)。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的某些TCR能特異性地結(jié)合呈遞該表位的細(xì)胞，因此特別適合作為用于遞送治療劑或可檢測標(biāo)記物至呈遞那些表位的細(xì)胞和組織的靶向載體。本發(fā)明TCR的語境中，特異性指其識別PPI抗原陽性HLA-A*02陽性靶細(xì)胞的能力，同時(shí)其識別抗原陰性靶細(xì)胞(特別是非癌性人細(xì)胞)的能力最小。本發(fā)明的某些TCR已被發(fā)現(xiàn)高度適用于過繼性療法。這類TCR對復(fù)合物的KD可低于200μM，例如約0.1μM至約100μM，和/或?qū)?fù)合物的結(jié)合半衰期(T1/2)為3秒至約12分鐘范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的TCR對于所述復(fù)合物的KD可以是約0.5μM-約50μM、約1μM-約20μM或約2μM-約10μM。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的某些TCR在與檢測標(biāo)記物或治療劑偶聯(lián)時(shí)極其適合用作治療和/或診斷劑。此類TCR對復(fù)合物的KD為約10pM至約200nM的范圍，T1/2為約10分鐘-約60小時(shí)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的TCR對復(fù)合物的KD可以是約20pM-約100nM、約50pM-約1nM、約100pM-約0.8nM、約200pM-約0.7nM。適于用作治療性和/或診斷性試劑的TCR的α鏈可變區(qū)可具有如下取代中的至少一個(gè)，參照SEQIDNO:2的編號：殘基編號取代N27ES28RQ31LY32WT50L或QY51P或DS52MS53G和/或所述β鏈可變區(qū)可具有如下取代中的至少一個(gè)，參照SEQIDNO:3的編號：-殘基編號取代N50MN51YN52GV53YL96TE98AK99DA101QK102RN103G所述TCR的α鏈可變區(qū)可具有如下取代中的至少一個(gè)，參照SEQIDNO:2的編號：殘基編號取代N27ES28RS52MS53G和/或所述β鏈可變區(qū)可具有如下取代中的至少一個(gè)，參照SEQIDNO:3的編號：殘基編號取代N50MN51YN52GV53YL96TE98AK99DA101QK102RN103G在這些α鏈可變區(qū)中，可具有緊鄰對應(yīng)于S28、Y32、Y51和/或S53的殘基之后插入的至少一個(gè)氨基酸，參照SEQIDNO:2的編號。這些α鏈可變區(qū)可具有單獨(dú)位于S28的插入，或與位于Y51或S53的插入之組合，或者單獨(dú)位于Y32的插入，或與位于Y51或S53的插入之組合。所述插入可以是如下中的一種或多種(參照SEQIDNO:2的編號)：所述插入可以是緊鄰S28之后的QYD和緊鄰S53之后的SFY，參照SEQIDNO:2的編號?；蛘?，所述插入可以是緊鄰Y32之后的PAQ和緊鄰S53之后的SFY，參照SEQIDNO:2的編號。所述TCR可包含如SEQIDNO:32、55、56、57、58和59所示的突變的α鏈可變區(qū)氨基酸序列之一；和/或如SEQIDNO:90所示的突變的β鏈可變區(qū)氨基酸序列?？赏ㄟ^任意合適的方法來確定結(jié)合親和性(與平衡常數(shù)KD呈反比)和結(jié)合半衰期(表示為T1/2)。將理解TCR的親和性翻倍導(dǎo)致KD減半。T1/2計(jì)算為ln2除以解離速率(koff)。因此，T1/2翻倍導(dǎo)致koff減半。通常對TCR的可溶形式測量TCR的KD和koff值，即截短以去除胞質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)域殘基的那些形式。因此，應(yīng)理解如果給定TCR的可溶形式滿足對ALWGPDPAAAHLA-A*02復(fù)合物的結(jié)合親和性和/或結(jié)合半衰期的要求，則該TCR滿足該要求。優(yōu)選地，使用相同的試驗(yàn)方案多次，例如3次或更多次測量給定的TCR的結(jié)合親和性或結(jié)合半衰期，并且取結(jié)果的平均值。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用本文實(shí)施例3的表面等離振子共振(BIAcore)方法來進(jìn)行這些測量。參照ALWGPDPAAAHLA-A*02TCR的KD是約287μM，通過所述方法檢測。本發(fā)明TCR可為αβ異二聚體或可為單鏈形式。單鏈形式包括如下類型的αβTCR多肽：Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ或Vα-Cα-L-Vβ-Cβ，其中Vα和Vβ分別是TCRα和β可變區(qū)，Cα和Cβ分別是TCRα和β恒定區(qū)，且L是接頭序列。為了用作遞送治療劑至抗原呈遞細(xì)胞的靶向試劑，TCR可為可溶形式(即無跨膜或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域)。為了穩(wěn)定，本發(fā)明的TCR和優(yōu)選的可溶性αβ異二聚體TCR可以在相應(yīng)的恒定區(qū)的殘基之間導(dǎo)入二硫鍵，例如，如WO03/020763所述。本發(fā)明的TCR可以是分離的，工程改造的或非天然產(chǎn)生的。為了在過繼性治療中使用，αβ異二聚體TCR可以例如以具有胞質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)域的全長鏈轉(zhuǎn)染。在某些實(shí)施方式中，α鏈可變區(qū)可與SEQIDNO:8-59(任選32、55、56、57、58和59的子集)的Q1到D112的氨基酸序列具有至少96、97、98或99％序列相同性或100％序列相同性，參照SEQIDNO:2的編號。圖6和7中帶下劃線的氨基酸可以是非變異的。在一些實(shí)施方式中，所述β鏈可變區(qū)可與SEQIDNO:60-91(任選90)的D1到L116氨基酸序列具有至少96、97、98或99％的序列相同性。圖8中帶下劃線的氨基酸可以是非變異的。本發(fā)明的α-β雜二聚TCR可由實(shí)施例4中所示的特定的α和β鏈組合產(chǎn)生。本發(fā)明的α-β異二聚體TCR通常包含α鏈TRAC恒定區(qū)序列和β鏈TRBC1或TRBC2恒定區(qū)序列?？赏ㄟ^截短或取代來修飾α和β鏈恒定區(qū)序列以除去TRAC的外顯子2的Cys4和TRBC1或TRBC2的外顯子2的Cys2之間的天然二硫鍵。也可通過用半胱氨酸殘基取代TRAC的Thr48和TRBC1或TRBC2的Ser57來修飾α和β鏈恒定區(qū)序列，所述半胱氨酸在TCR的α和β恒定區(qū)之間形成二硫鍵。本領(lǐng)域已知TCR可經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄后修飾。糖基化是一種這類修飾，其包括寡糖部分與TCR鏈中限定的氨基酸共價(jià)接合。例如，天冬氨酸殘基或絲氨酸/蘇氨酸殘基是供于寡糖接合的熟知位置。特定蛋白質(zhì)的糖基化狀態(tài)取決于多種因素，包括蛋白質(zhì)序列、蛋白質(zhì)構(gòu)象和某些酶的可及性。此外，糖基化狀態(tài)(即寡糖類型、共價(jià)連接和接合總數(shù))可能影響蛋白質(zhì)功能。因此，在產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)時(shí)，通常需要控制糖基化。受控的糖基化已用于改善基于抗原的治療(JefferisR.,NatRevDrugDiscov.2009年3月；8(3):226-34.)。對于本發(fā)明的可溶TCR來說，糖基化可在體內(nèi)受控(例如通過使用特定細(xì)胞系)或體外受控(通過化學(xué)修飾)。此類修飾是理想的，因?yàn)樘腔筛纳扑幋鷦?dòng)力學(xué)、降低免疫原性且更精密地模擬原初人蛋白(SinclairAM和ElliottS.,PharmSci.2005年8月；94(8):1626-35)。本發(fā)明的一方面提供一種多價(jià)TCR復(fù)合物，其包含本發(fā)明的至少兩個(gè)TCR。在一個(gè)實(shí)施方式中，至少兩個(gè)TCR分子通過接頭部分連接以形成多價(jià)復(fù)合物。優(yōu)選地，所述復(fù)合物是水溶性的，因此應(yīng)相應(yīng)選擇所述接頭部分。此外，優(yōu)選所述接頭部分應(yīng)能夠附連至TCR分子上確定的位置，從而使形成的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)多樣性最小化。例如，所述TCR可通過非肽聚合物鏈或肽接頭序列連接。本發(fā)明的TCR復(fù)合物可具有在各TCR的氨基酸殘基之間延伸的非肽聚合物鏈或肽接頭序列，所述氨基酸殘基不位于所述TCR的可變區(qū)序列內(nèi)。鑒于本發(fā)明的復(fù)合物可用于藥物，所述接頭部分應(yīng)考慮其藥物合適性(例如其免疫原性)來選擇。滿足上述所需標(biāo)準(zhǔn)的接頭部分的示例是本領(lǐng)域中已知的，例如抗體片段連接領(lǐng)域。本發(fā)明的一些可溶性TCR(或其多價(jià)復(fù)合物)可用于向抗原呈遞細(xì)胞和含有抗原呈遞細(xì)胞的組織遞送可檢測的標(biāo)志物或治療劑。因此，可(例如，通過PEG化)將它們與可檢測標(biāo)記物、治療劑或PK修飾部分相關(guān)聯(lián)(共價(jià)或通過其它方式)。診斷目的的可檢測標(biāo)記物包括，例如，熒光標(biāo)記物、放射性標(biāo)記物、酶、核酸探針和造影劑。這些帶標(biāo)記的TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物可用于檢測ALWGPDPAAA-HLA-A*02復(fù)合物或呈遞該復(fù)合物的細(xì)胞的方法中，所述方法包括使待檢測的樣品與本發(fā)明的TCR或TCR復(fù)合物接觸；和，檢測所述TCR或TCR復(fù)合物的結(jié)合。在例如采用生物素化的雜二聚體形成的四聚體TCR復(fù)合物中，可采用熒光鏈霉親和素來提供可檢測標(biāo)記物。所述熒光標(biāo)記的TCR四聚體適用于FACS分析，例如，以檢測攜帶ALWGPDPAAA-HLA-A*02復(fù)合物的抗原呈遞細(xì)胞，其中這些高親和性TCR對于所述ALWGPDPAAA-HLA-A*02復(fù)合物具有特異性。本發(fā)明的TCR可通過采用TCR特異性抗體，尤其是單克隆抗體，來檢測。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的TCR(或其多價(jià)復(fù)合物)可以，或者或此外，與治療劑相關(guān)聯(lián)(例如通過共價(jià)或其它方式連接)，所述治療劑可以是例如免疫效應(yīng)分子例如白介素或細(xì)胞因子。IL-4、IL-10和IL-13是適于與本發(fā)明的TCR相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞因子。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種核酸，其包含編碼本發(fā)明的TCR的α鏈可變區(qū)的序列，和/或，編碼本發(fā)明的TCR的β鏈可變區(qū)的序列。所述核酸可編碼本發(fā)明的TCR。一些實(shí)施方式中，該核酸是cDNA。該核酸可以是非天然產(chǎn)生和/或經(jīng)純化和/或經(jīng)工程改造的。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的核酸的載體。優(yōu)選地，該載體是TCR表達(dá)載體。所述載體能夠在T細(xì)胞中表達(dá)Foxp3和本發(fā)明的TCR。通常，所述TCR和鏈將與GFP/Foxp3融合蛋白一起由三順反子(tricistronic)逆病毒載體采用病毒核糖體跳躍(2A)和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)而表達(dá)。該類型的載體能高效地將常規(guī)CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成抗原特異性調(diào)節(jié)性表型T細(xì)胞。胰島-抗原特異性增強(qiáng)的本發(fā)明親和性TCR與確保了胰島特異性的Foxp3的共同遞送不與調(diào)節(jié)性活性分離，因此允許經(jīng)轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞發(fā)揮對于在其它情況下支持胰島細(xì)胞的損毀的促炎性環(huán)境的最優(yōu)控制。本發(fā)明還提供含有本發(fā)明的核酸或載體的細(xì)胞。該載體可包含在單個(gè)開放閱讀框，或2個(gè)不同的開放閱讀框(分別是α鏈和β鏈)中編碼的本發(fā)明的核酸。另一個(gè)方面提供了含有第一表達(dá)載體和第二表達(dá)載體的細(xì)胞，該第一表達(dá)載體包含編碼本發(fā)明的TCR的α鏈的核酸，該第二表達(dá)載體包含編碼本發(fā)明的TCR的β鏈的核酸。這類細(xì)胞可特別用于過繼性療法。本發(fā)明細(xì)胞可以是經(jīng)分離和/或重組和/或非天然產(chǎn)生和/或經(jīng)工程改造的。因?yàn)楸景l(fā)明的TCR在過繼性治療中有效用，本發(fā)明包括呈遞本發(fā)明的TCR的非天然產(chǎn)生和/或經(jīng)純化和/或經(jīng)工程改造的細(xì)胞。經(jīng)工程改造的細(xì)胞可以是T細(xì)胞，尤其是T調(diào)節(jié)性細(xì)胞(Treg)。存在用編碼本發(fā)明的TCR的核酸(例如DNA或RNA)轉(zhuǎn)染T細(xì)胞的多種合適方法(參見例如Robbins等,2008JImmunol.180:6116-6131和Plesa等.2012Blood.119(15):3420-3430)。表達(dá)本發(fā)明的TCR的T細(xì)胞將適用于對T1DM進(jìn)行基于過繼性療法的治療。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，存在多種可進(jìn)行過繼性療法的合適方法(參見例如Rosenberg等，(2008)NatRevCancer8(4):299-308)。一方面中，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含識別胰島細(xì)胞上呈遞的ALWGPDPAAA-HLA-A*02復(fù)合物的多個(gè)調(diào)節(jié)性表型T細(xì)胞，和，一種或多種藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或賦形劑，其中所述調(diào)節(jié)性表型T細(xì)胞包含引入的載體，其能夠表達(dá)本發(fā)明的TCR，其可以是αβ雜二聚TCR。所述組合物可用于治療1型糖尿病。本發(fā)明涉及TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞的方面可能需要識別胰島細(xì)胞上呈遞的ALWGPDPAAA-HLA-A*02復(fù)合物的αβ雜二聚TCR-轉(zhuǎn)染的調(diào)節(jié)性表型T細(xì)胞。來自給定個(gè)體的CD4+T細(xì)胞典型群體一般包含約5-10％的天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。盡管調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能從總?cè)后w分離并用TCR轉(zhuǎn)染，優(yōu)選在用非調(diào)節(jié)性CD4+T細(xì)胞起始，并引入能夠表達(dá)Foxp3的載體，來將它們轉(zhuǎn)換成調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表型。便利地，該引入的能夠表達(dá)Foxp3的載體也能夠表達(dá)所述TCR。通常但不必需地，用所述TCR或TCR與Foxp3轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞將從待用本發(fā)明組合物治療的患者獲取。對于給予患者，本發(fā)明的TCR、多價(jià)復(fù)合物、核酸、載體或細(xì)胞可在藥物組合物中與一種或多種藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或賦形劑一起提供。本發(fā)明的TCR、多價(jià)復(fù)合物、核酸、載體或細(xì)胞通常將以無菌的藥物組合物的部分提供，其通常包含藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。這種藥物組合物可以是任意合適的形式，(取決于將其給予患者所需的方法)?？梢詥挝粍┬吞峁?，通常以密封的容器提供或可以試劑盒的部分提供。這種試劑盒將通常(雖然不必需)包括使用說明。其可包括多種所述的單位劑型。藥物組合物可適應(yīng)通過任意合適的途徑給藥，優(yōu)選通過胃腸外(包括皮下、肌內(nèi)或優(yōu)選靜脈內(nèi))途徑。這類制劑可通過藥學(xué)領(lǐng)域已知的任何方法制備，例如通過將活性成分與運(yùn)載體或賦形劑在無菌條件下混合。本發(fā)明還提供：·能夠與作為肽-HLA-A2復(fù)合物呈遞的ALWGPDPAAA肽相結(jié)合的TCR、包含多個(gè)所述TCR的多價(jià)TCR復(fù)合物、編碼所述TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物的核酸、包含所述核酸的載體，和/或，表達(dá)和/或呈遞所述TCR的細(xì)胞，其用于醫(yī)藥，優(yōu)選地用于治療自身免疫疾病的方法中；·能夠與作為肽-HLA-A2復(fù)合物呈遞的ALWGPDPAAA肽相結(jié)合的TCR、包含多個(gè)所述TCR的多價(jià)TCR復(fù)合物、編碼所述TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物的核酸、包含所述核酸的載體，和/或，表達(dá)和/或呈遞所述TCR的細(xì)胞，在制備用于治療自身免疫疾病的藥物中的應(yīng)用；·一種治療患有自身免疫疾病的患者的方法，所述方法包括給予所述患者能夠與作為肽-HLA-A2復(fù)合物呈遞的ALWGPDPAAA肽相結(jié)合的TCR、包含多個(gè)所述TCR的多價(jià)TCR復(fù)合物、編碼所述TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物的核酸、包含所述核酸的載體，和/或，表達(dá)和/或呈遞所述TCR的細(xì)胞。結(jié)合以肽-HLA-A2復(fù)合物呈遞的ALWGPDPAAA肽的TCR優(yōu)選是本發(fā)明的TCR。同樣地，所述多價(jià)TCR復(fù)合物、核酸、載體和細(xì)胞可基于本發(fā)明。所述自身免疫疾病可以是1型糖尿病。該方法還包括過繼性療法。本發(fā)明各方面的優(yōu)選特征可經(jīng)修改作為各其他方面。本文所述的出版文獻(xiàn)以法律允許的最大程度納入本文。該申請文件中任何文獻(xiàn)的引用或鑒定并非承認(rèn)這類文獻(xiàn)是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。本文參照所附附圖進(jìn)行說明，其中：圖1(SEQIDNO:2)給出了具有基因應(yīng)用TRAV12-3/TRAJ12/TRAC的野生型PPI特異性TCR的α鏈的胞外部分的氨基酸序列。圖2(SEQIDNO:3)給出了具有基因應(yīng)用TRBV12-4/TRBJ2-4/TRBD2*02/TRBC2的野生型PPI特異性TCR的β鏈的胞外部分的氨基酸序列。圖3(SEQIDNO:4)給出了可溶性TCR(在本文中稱為參照TCR)的α鏈的氨基酸序列。該序列與圖1的序列相同，不同之處在于半胱氨酸(粗體并帶下劃線)取代SEQIDNO:1的T159(即TRAC恒定區(qū)的T48)?；パa(bǔ)決定區(qū)帶下劃線。圖4(SEQIDNO:5)給出了可溶性TCR(在本文中稱為參考TCR)的β鏈的氨基酸序列。該序列與圖1的序列相同，不同之處在于半胱氨酸(粗體且?guī)聞澗€)取代S173(即TRBC2恒定區(qū)的S57)，且A202取代C191且D205取代N216?；パa(bǔ)決定區(qū)帶下劃線。圖5(SEQIDNO:6和SEQIDNO:7)給出了分別編碼圖3和4的TCRα和β鏈的DNA序列(引入的半胱氨酸以粗體顯示)。圖6(SEQIDNO:8-18)給出了α鏈可變區(qū)的氨基酸序列，其包含取代，其可存在于本發(fā)明的TCR中。圖7(SEQIDNO:19-59)給出了其它α鏈可變區(qū)的氨基酸序列，其包含插入或插入和取代，其可存在于本發(fā)明的TCR中。圖8(SEQIDNO:60-91)給出了β鏈可變區(qū)的氨基酸序列，其包含取代，其可存在于本發(fā)明的TCR中。圖9的圖顯示一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠用TCR轉(zhuǎn)染的Treg細(xì)胞注射。實(shí)施例實(shí)施例1–分別將參照PPITCRα和β鏈可變區(qū)序列克隆進(jìn)入基于pEX956和pEX821的表達(dá)質(zhì)粒從分離自PPIT細(xì)胞克隆(克隆1E6，來自MarkPeakman，英國倫敦國王學(xué)院，英國)的總cDNAPCR擴(kuò)增參照PPITCR可變?chǔ)梁蚑CR可變?chǔ)聟^(qū)。在α鏈的情況中，采用編碼限制性位點(diǎn)NdeI的α鏈可變區(qū)序列特異性寡核苷酸A1(引物序列：gaattccatatgcaaaaagaagttgaacaagatcctggaccactc(SEQIDNO:92))和編碼限制性位點(diǎn)SalI的α鏈恒定區(qū)序列特異性寡核苷酸A2(引物序列：ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg(SEQIDNO:93))來擴(kuò)增α鏈可變區(qū)。在β鏈的情況中，采用編碼限制性位點(diǎn)NdeI的β鏈可變區(qū)序列特異性寡核苷酸B1(引物序列：gaattccatatggatgctggagttattcaatcaccccggcacgag(SEQIDNO:94))和編碼限制型位點(diǎn)AgeI的β鏈恒定區(qū)序列特異性寡核苷酸B2(引物序列：tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc(SEQIDNO:95))來擴(kuò)增β鏈可變區(qū)。通過標(biāo)準(zhǔn)方法分別將α或β可變區(qū)克隆到含有Cα或Cβ的基于pEX956和pEX821的表達(dá)質(zhì)粒中，這類標(biāo)準(zhǔn)方法描述于(Sambrook和Russell的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(MolecularCloningaLaboratoryManual)第3版)。使用應(yīng)用生物系統(tǒng)3730xlDNA分析儀來對質(zhì)粒進(jìn)行測序。用NdeI和SalI切割的編碼TCRα鏈的DNA序列連接到用NdeI和XhoI切割的pEX956+Ca載體中。用NdeI和AgeI切割的編碼TCRβ鏈的DNA序列連接到用NdeI和AgeI切割的pEX956+Cb載體中。將連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌菌株XL1-藍(lán)細(xì)胞中并接種于含有100μg/ml氨芐青霉素的LB/瓊脂平板上。在37℃下過夜孵育10之后，挑取單個(gè)菌落并在37℃下在10ml的含有100μg/ml氨芐青霉素的LB中振蕩過夜生長。使用Miniprep試劑盒(恰根公司(Qiagen))純化克隆的質(zhì)粒并且使用應(yīng)用生物系統(tǒng)3730xlDNA分析儀來對質(zhì)粒進(jìn)行測序。圖3和4分別顯示由圖5的DNA序列(SEQIDNO:6和7)產(chǎn)生的參照PPITCRα和β鏈胞外氨基酸序列(SEQIDNO:4和5)。注意到，相對于天然TCR，半胱氨酸在α和β鏈的恒定區(qū)中被取代以在重折疊時(shí)提供人工鏈間二硫鍵以形成異二聚TCR。導(dǎo)入的半胱氨酸以粗體和下劃線顯示。實(shí)施例2–可溶性參照PPITCR的表達(dá)、重折疊和純化實(shí)施例1制備的分別含有TCRα-鏈和β-鏈的表達(dá)質(zhì)粒分開轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株BL21pLysS中，并且在用0.5mMIPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)之前，使單個(gè)抗氨芐青霉素菌落在37℃下在TYP(氨芐青霉素100μg/ml)培養(yǎng)基中生長至約0.6至0.8的OD600。在誘導(dǎo)后3小時(shí)通過在BeckmanJ-6B中4000rpm離心30分鐘來收獲細(xì)胞。用在MgCl2和DNA酶I存在下用25mlBug(諾瓦基公司(Novagen))來裂解細(xì)胞團(tuán)塊。通過在BeckmanJ2-21離心機(jī)中以13000rpm離心30分鐘來回收包涵體團(tuán)塊。進(jìn)行3次去污劑洗滌以去除細(xì)胞碎片和膜組分。每次在通過于BeckmanJ2-21中13000rpm下離心15分鐘進(jìn)行成塊之前將包涵體團(tuán)塊在曲通緩沖液(50mMTris-HClpH8.0，0.5％曲通-X100，200mMNaCl，10mMNaEDTA)中均質(zhì)化。然后通過在以下緩沖液中類似的洗滌來去除去污劑和鹽：50mMTris-HClpH8.0，1mMNaEDTA。最后，包涵體分成30mg等份并在-70℃下冷凍。通過用6M鹽酸胍溶解來定量包涵體蛋白質(zhì)產(chǎn)率并且在日立(Hitachi)U-2001分光光度計(jì)上取得OD測量。然后使用消光系數(shù)來計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。大約15mg的TCRβ鏈和15mg的TCRα鏈溶解的包涵體從凍存物中融化并稀釋到10ml的胍溶液(6M鹽酸胍，50mMTrisHClpH8.1，100mMNaCl，10mMEDTA，10mMDTT)中以確保完全鏈變性。然后將含有完全還原并變性的TCR鏈的胍溶液注入0.5升的以下重折疊緩沖液中：100mMTrispH8.1，400mML-精氨酸，2mMEDTA，5M尿素。在加入變性的TCR鏈之前約5分鐘加入終濃度分別為6.6mM和3.7mM的氧化還原對(鹽酸半胱胺和二鹽酸胱胺)。將溶液放置約30分鐘。重折疊的TCR在1膜(斯派公司(Spectrum)；產(chǎn)品編號132670)上用10LH2O透析18-20小時(shí)。在這段時(shí)間之后，2次將透析緩沖液改成新鮮的10mMTrispH8.1(10L)并且在3℃±5℃下繼續(xù)透析另外約8小時(shí)。通過將經(jīng)透析的重折疊物加載到50HQ陰離子交換柱并使用純化儀(GE醫(yī)療公司(GEHealthcare))以50個(gè)柱體積的含0-500mMNaCl的10mMTrispH8.1的梯度洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)來從降解產(chǎn)物和雜質(zhì)中分離可溶性TCR。收集峰組分并且加入蛋白酶抑制劑的混合物(卡巴開公司(Calbiochem))。收集的組分然后儲(chǔ)存在4℃下并在收集和濃縮之前通過考馬斯染色SDS-PAGE來分析。最后，使用在PBS緩沖液(西格瑪公司(Sigma))中預(yù)平衡的GE醫(yī)療公司的75HR凝膠過濾柱來純化和表征可溶性TCR。在由表面等離振子共振分析表征之前，收集并濃縮大約50kDa的相對分子量處洗脫的峰。實(shí)施例3–結(jié)合表征BIAcore分析表面等離振子共振生物傳感器(3000)可用于分析可溶性TCR與其肽-MHC配體的結(jié)合。這通過產(chǎn)生可溶性生物素化的肽-HLA(“pHLA”)復(fù)合物來促進(jìn)，該復(fù)合物可固定于鏈霉親和素包被的結(jié)合表面(傳感器芯片)。傳感器芯片包含4個(gè)單獨(dú)的流動(dòng)池，其能夠同時(shí)測量結(jié)合4種不同的pHLA復(fù)合物的T-細(xì)胞受體。手動(dòng)注射pHLA復(fù)合物允許較容易地操作精確水平的固定化I類分子。生物素化的I類HLA-A*02分子在體外從含有組分亞基蛋白質(zhì)和合成肽的細(xì)菌表達(dá)的包涵體重折疊，之后進(jìn)行純化和體外酶促生物素化(O’Callaghan等，(1999)Anal.Biochem.266:9-15)。表達(dá)帶有C-末端生物素化標(biāo)簽的HLA-A*02-重鏈，其標(biāo)簽代替合適的構(gòu)建體中的蛋白質(zhì)的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。得到約75mg/升細(xì)菌培養(yǎng)物的包涵體表達(dá)水平。MHC輕鏈或β2-微球蛋白在大腸桿菌中也以包涵體形式從合適的構(gòu)建體表達(dá)，水平為約500mg/升細(xì)菌培養(yǎng)物。大腸桿菌細(xì)胞經(jīng)裂解并且將包涵體純化至大約80％的純度。來自包涵體的蛋白質(zhì)在6M鹽酸胍、50mMTrispH8.1、100mMNaCl、10mMDTT、10mMEDTA中變性，并且通過在<5℃下向重疊緩沖液中加入單個(gè)脈沖的變性蛋白質(zhì)來在30mg/升重鏈、30mg/升β2m的濃度下在0.4ML-精氨酸、100mMTrispH8.1、3.7mM二鹽酸胱胺、6.6mM鹽酸半胱胺、需用HLA-A*02分子加載的4mg/LAFP肽中重折疊。在4℃下持續(xù)至少1小時(shí)以完成重折疊。通過在10倍體積的10mMTrispH8.1中透析來交換緩沖液。然后蛋白質(zhì)溶液濾過1.5μm乙酸纖維素過濾器并加載在50HQ陰離子交換柱(8ml床體積)上。使用純化儀(GE醫(yī)療公司)用10mMTrispH8.1中0-500mMNaCl的線性梯度來洗脫蛋白質(zhì)。HLA-A*02-肽復(fù)合物在約250mMNaCl處洗脫，并且收集峰組分，加入蛋白酶抑制劑的混合物(卡巴開公司)并且在冰上冷卻該組分。生物素化標(biāo)記的pHLA分子使用相同緩沖液平衡的GE醫(yī)療快速脫鹽柱緩沖液交換成10mMTrispH8.1，5mMNaCl。洗脫之后含蛋白質(zhì)的組分立即在冰上冷卻并且加入蛋白酶抑制劑混合物(卡巴開公司)。然后加入生物素化試劑：1mM生物素，5mMATP(緩沖至pH8)，7.5mMMgCl2，和5μg/mlBirA酶(按照O’Callaghan等，(1999)Anal.Biochem.266:9-15純化)。然后該混合物在室溫下孵育過夜。使用凝膠過濾色譜純化生物素化的pHLA-A*01分子。用經(jīng)過濾的PBS預(yù)平衡GE醫(yī)療75HR10/30柱并且加載1ml的生物素化反應(yīng)混合物并且用純化儀(GE醫(yī)療公司)以0.5ml/分鐘向柱上加PBS。在約15ml處洗脫單個(gè)峰的生物素化的pHLA-A*02分子。收集含有蛋白質(zhì)的組分，在冰上冷卻，并且加入蛋白酶抑制劑混合物。使用考馬斯結(jié)合試驗(yàn)(PerBio)來確定蛋白質(zhì)濃度，并且等份的生物素化的pHLA-A*02分子在–20℃下冷凍儲(chǔ)存。3000表面等離振子共振(SPR)生物傳感器測量出折射率的變化，其以小流動(dòng)池內(nèi)的傳感器表面附近的反應(yīng)單位(RU)表示，這是一種可用于檢測受體配體相互作用并分析它們的親和性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)的原理。實(shí)驗(yàn)在25℃的溫度下使用PBS緩沖液(西格瑪公司，pH7.1-7.5)作為運(yùn)行緩沖液進(jìn)行，并且該緩沖液用于制備蛋白質(zhì)樣品的稀釋物。通過標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)方法將鏈霉親和素固定于流動(dòng)池。pHLA復(fù)合物通過生物素標(biāo)簽固定。然后通過將可溶性TCR以恒定流速通過不同流動(dòng)池的表面上，測量該操作中的SPR反應(yīng)來進(jìn)行試驗(yàn)。平衡結(jié)合常數(shù)上述分析方法用于確定平衡結(jié)合常數(shù)。制備參考PPITCR的二硫鍵連接的可溶性異二聚體形式的連續(xù)稀釋物并且以5μl/分鐘的恒定流速注入2個(gè)不同的流動(dòng)池上；一個(gè)包被約1000RU的特異性ALWGPDPAAAHLA-A*02復(fù)合物，第二個(gè)包被約1000RU的非特異性HLA-A*02–肽復(fù)合物。使用來自對照池的測量值將反應(yīng)就各濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)反應(yīng)對TCR樣品的濃度作圖并且擬合至非線性曲線擬合模型以計(jì)算平衡結(jié)合常數(shù)KD(Price和Dwek，《生物化學(xué)家的生理化學(xué)原理和問題》(PrinciplesandProblemsinPhysicalChemistryforBiochemists)(第2版)1979，牛津，克拉仁敦出版社(ClarendonPress))。參考PPITCR的二硫鍵連接的可溶形式(實(shí)施例2)證明大約287μM的KD。基于相同BIAcore數(shù)據(jù)，T1/2值過快以致無法檢測。動(dòng)力學(xué)參數(shù)對于高親和性TCR，通過實(shí)驗(yàn)測量解離速率常數(shù)kd和結(jié)合速率常數(shù)ka來確定KD。平衡常數(shù)KD計(jì)算為kd/ka。TCR注射在2個(gè)不同的池上，一個(gè)用約1000RU的特異性ALWGPDPAAAHLA-A*02復(fù)合物包被，第二個(gè)用約1000RU的非特異性HLA-A1-肽復(fù)合物包被。流速設(shè)定為50μl/分鐘。通常注射約250μl的1μM濃度的TCR。然后緩沖液流過直至反應(yīng)已經(jīng)回到基線或已消逝超過2小時(shí)。使用軟件來計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)。解離期擬合至能夠計(jì)算半衰期的單指數(shù)衰減等式。實(shí)施例4–改善親和性PPITCR的生成實(shí)施例1中描述的參照PPITCR用為模板，由其產(chǎn)生對于ALWGPDPAAAHLA-A*02復(fù)合物具有增加的親和性的本發(fā)明的TCR。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可通過定點(diǎn)誘變(來自Stratagene公司的QuickChangeTM定點(diǎn)誘變試劑盒)將產(chǎn)生這些突變鏈必需的密碼子取代或密碼子插入引入編碼對應(yīng)野生型胰島素特異性鼠TCR鏈的DNA中。圖6、7(α鏈)和8(β鏈)(SEQIDNO:8-59(α鏈)和60-91(β鏈))中列出TCRα和β鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，其在組合時(shí)顯示對于ALWGPDPAAAHLA-A*02復(fù)合物改善的親和性(相較于參照TCR)。相對于參照WTPPITCR獲得改善的親和性的TCRα和β鏈組合的示例如下：實(shí)施例5–用親和性增強(qiáng)的TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的Treg阻止了小鼠模型中糖尿病的發(fā)作CD25被消耗的CD4+T細(xì)胞從非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠的脾分離，并經(jīng)誘導(dǎo)以表達(dá)Foxp3以產(chǎn)生Treg表型。所述細(xì)胞用對源自小鼠胰島素的肽具有特異性的親和性增強(qiáng)的TCR(Kd＝0.74μM)轉(zhuǎn)導(dǎo)。然后，將活化的細(xì)胞注射進(jìn)入受體NOD小鼠(n＝4)。平行制備不接受CD4細(xì)胞的對照組(n＝3)。為了誘導(dǎo)糖尿病快速發(fā)作，在2天后用分離自G9轉(zhuǎn)基因小鼠的活化的CD8+T細(xì)胞克隆注射NOD小鼠(Wong等2009Diabetes58(5):1156–1164)。在注射G9細(xì)胞之后30天監(jiān)測小鼠的尿葡萄糖。一旦呈陽性，隨后進(jìn)行血糖測試以確認(rèn)糖尿病的發(fā)作。結(jié)果(圖9)顯示注射TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的Treg阻止了監(jiān)測期間的糖尿病發(fā)作。相反，未接受這些細(xì)胞的小鼠在30天的末尾均呈現(xiàn)糖尿病陽性。當(dāng)前第1頁1 2 3