專利名稱：人胰島素原c肽高產(chǎn)菌株的構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域中的重組多肽藥物的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
人胰島素原C肽是人胰島素原中A鏈和B鏈之間的連接肽，含31個(gè)M 酸，人胰島素原經(jīng)酶解形成等摩爾的胰島素和C肽。胰島素用于控制糖尿病 患者的血糖，C肽曾^皮認(rèn)為無臨床價(jià)值，最新研究證明C肽能夠減少糖尿病 患者的最嚴(yán)重并發(fā)癥，如糖尿病性腎病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變和糖尿病性神 經(jīng)病變。采用胰島素與C肽聯(lián)合用藥可有效控制血糖和減少糖尿病并發(fā)癥的 發(fā)生。由于人胰島素原C肽具有巨大的治療價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，現(xiàn)在各國大力 開展其生產(chǎn)工藝和臨床前研究，目前全世界還沒有正式生產(chǎn)上市。
人胰島素原C肽是一種含31個(gè)氨基酸的內(nèi)源性小肽，生產(chǎn)人胰島素原C 肽主要有三條工藝路線可供選擇化學(xué)合成法、生物組織提取法、基因工程 法。人胰島素原C肽含31個(gè)氨基酸，用化學(xué)合成法生產(chǎn)人胰島素原C肽存在 合成反應(yīng)步驟多，總收率低，并有價(jià)格高昂以及環(huán)境污染的弊端，因而化學(xué) 合成法不可取。雖然人的血液中含有人胰島素原C肽，但含量極微，從人的 血液提取C肽不可能用于大規(guī)^莫生產(chǎn)。
對于人胰島素原C肽的生產(chǎn)來說，最有效和最直接的解決方法就是利用 基因工程的方法，通過構(gòu)建表iiA胰島素原C肽的基因工程菌株，釆用微生 物發(fā)酵法生產(chǎn)。但由于人胰島素原C肽是一種小肽，利用基因工程來生產(chǎn)小 肽一直是一個(gè)難題，最主要體現(xiàn)在(1)在發(fā)酵表達(dá)方面，分子量小造成表 達(dá)量低(與相同摩爾數(shù)的大的蛋白質(zhì)相比)，另外，分子量小還容易被宿主 細(xì)胞降解，從而造成多肽表達(dá)量進(jìn)一步降低；(2)在分離純化方面，多tt 于分離純化，收率遠(yuǎn)低于分子量大的蛋白質(zhì)；(3)在電泳檢測方面，小肽的 分子量小容易擴(kuò)散，用常規(guī)的蛋白質(zhì)電泳不利于檢測分析。在這三個(gè)難題中， 小肽的分析檢測可以采用色譜和多肽電泳來彌補(bǔ)；小肽的分離純化工藝可以
通過不同的純化方法的優(yōu)化，其收率一般可控制在30-40%;而難度最大的是 如何獲得高表達(dá)人胰島素原C肽的工程菌林。
目前，國內(nèi)外提高C肽表達(dá)量的主要方式是將人胰島素原C肽基因進(jìn)行 串聯(lián)表達(dá)。其基本原理由于人胰島素原C肽不含精氨酸和賴氨酸，先可用 這兩種堿性M酸將單拷貝的人胰島素原C肽基因串l沐來表達(dá)，然后通過 高純度的胰蛋白酶和羧肽酶B進(jìn)行雙酶切，去除C肽之間的連接氨基酸，釋 放出天然的人胰島素原C肽。該方法的優(yōu)點(diǎn)是可以在大腸桿菌或酵母中獲得 多聚(個(gè))人胰島素原C肽串聯(lián)的融合蛋白的高表達(dá)工程菌抹，缺點(diǎn)是需要 昂貴的雙蛋白酶(胰蛋白酶和羧肽酶B)切割，同時(shí)增加了分離純化的步驟 以及受雙蛋白酶切效率的影響，最終降低了人胰島素原C肽的產(chǎn)率。該方法 已經(jīng)分別由瑞典創(chuàng)新肽有限公司(中國專利申請公開CN1268141 )和上海新 藥研究開發(fā)中心(中國專利申請公開CN1606570 )各自申請了專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種胞內(nèi)高表達(dá)人胰島素原C肽的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供有關(guān)的人工合成的核酸分子、載體和宿主細(xì)胞。
本發(fā)明采用基因工程的方法，以畢赤酵母為宿主細(xì)胞，構(gòu)建能高效胞內(nèi) 表達(dá)人胰島素原c肽的工程菌林。
該工程菌主要由三個(gè)部分構(gòu)成畢赤酵母宿主細(xì)胞GS115,畢赤酵母胞 內(nèi)表達(dá)型栽體pPIC3K， 一種能夠編碼人胰島素原C肽的核酸分子。酵母宿主 細(xì)胞GS115以及畢赤酵母表達(dá)載體pPIC3K均購自美國Introgen Corporation (Carlsbad, CA， USA)，能夠編碼人胰島素原C肽的核酸分子是人工設(shè)計(jì)并 用化學(xué)法合成。
該工程菌的主要特點(diǎn)如下
(1) .宿主細(xì)胞選用的畢赤酵母宿主細(xì)胞是GS115， GS115可高密度 發(fā)酵，因而適合于外源蛋白表達(dá)。
(2) 表達(dá)載體選用的酵母表達(dá)載體是pPIC3K,可有效地胞內(nèi)表iiA 胰島素原C肽。
(3).人胰島素原C肽的核酸序列根據(jù)人胰島素原C肽的氨基酸序列， 人工設(shè)計(jì)并化學(xué)合成一種能編碼人胰島素原C肽的核酸分子，其序列見SEQ ID NO: 1。
本發(fā)明研究人員按照本發(fā)明工程菌構(gòu)建方法已經(jīng)獲得高效胞內(nèi)表達(dá)人胰 島素原C肽的工程菌林，并將其2008年10月6日保藏到中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC),保藏號是No.2686,分類命名為巴氏 畢赤酵母(Pichia pastoris)。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線 (1)目的基因的合成
根據(jù)人胰島素原C肽的氨基酸序列，采用化學(xué)合成的方法，合成人胰島 素原C肽基因。人胰島素原C肽含有31個(gè)氨基酸，用化學(xué)合成法合成人胰島 素原C肽全長基因序列，并在目的基因的兩端引入限制性酶切位點(diǎn)。
(2 )獲得正確構(gòu)建的重組表達(dá)載體
在DM連接酶作用下，將化學(xué)合成的人胰島素原C肽基因與表達(dá)載體 pPIC3K進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5oc感受態(tài)細(xì)胞，最后將該感 受態(tài)細(xì)胞涂布于含氨千青霉素的LB平板上，獲得大量單菌落。用PCR方法初 步篩選陽性克隆，將陽性克隆進(jìn)行DM測序，從而獲得含人胰島素原C肽基 因的重組表達(dá)載體。
(3 )將上述重組載體導(dǎo)入酵母菌
提取該重組栽體并進(jìn)行線性化處理，用電穿孔將該線性化的重組載體導(dǎo) 入畢赤酵母中，將菌液涂布于MD選擇性培養(yǎng)基上，獲得了大量的轉(zhuǎn)化子，并 對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定。
(4)高產(chǎn)菌抹的獲得
將上述(3)獲得的轉(zhuǎn)化子涂布在含不同濃度的G418平板上進(jìn)行篩選。 利用蛋白質(zhì)電泳檢測人胰島素原C肽的表達(dá)量，經(jīng)過大規(guī)模篩選，已經(jīng)獲得 了高表達(dá)人胰島素原C肽的工程菌抹。同時(shí)確定了搖瓶試驗(yàn)的培養(yǎng)和誘導(dǎo)表 達(dá)條件，包括可能的最優(yōu)的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、無機(jī)鹽的種類和濃度、誘導(dǎo) 表達(dá)時(shí)間等。在搖瓶培養(yǎng)條件下，重組人胰島素原C肽的表達(dá)水平達(dá)到 100mg/L。
(2 )建立了高密度和高表達(dá)的小試發(fā)酵工藝。在搖瓶的培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá) 條件基礎(chǔ)上，將酵母工程菌在5L Minifors(瑞士 INFORS公司)全自動發(fā)酵罐 進(jìn)行培養(yǎng)，對發(fā)酵過程中的溶氧量、pH值、溫度、攪拌轉(zhuǎn)速等參數(shù)進(jìn)行測定 和控制，優(yōu)化和量化了 pH值、溶氧量、攪拌速度等參數(shù)，酵母工程菌獲得高 密度發(fā)酵，人胰島素原C肽獲得穩(wěn)定高效表達(dá)。
本發(fā)明采用基因工程的方法來生產(chǎn)人胰島素原C肽，可以大規(guī)4莫生產(chǎn)， 成本低廉。


圖1是含人胰島素原C肽基因工程菌的PCR產(chǎn)物的核酸電泳圖，從左到右 電泳泳道-M:是核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)Lamda DNA/HindlH; 電泳泳道-工程菌含人胰島素原C肽的工程菌林做沖莫板，出現(xiàn)人胰島 素原C肽的重組載體的PCR產(chǎn)物以及宿主菌體染色體的特異產(chǎn)物。
圖2是含人胰島素原C肽基因工程菌的SDS-PAGE電泳圖，從左到右 電泳泳道1:工程菌破碎樣品，在3KDa附近有人胰島素原C肽條帶； 電泳泳道M : 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上往下，分別是
2. 5KDa， 6. 5KDa， 10KDa， 16KDa。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)操作和相關(guān)試劑的配方主要參考畢赤酵母操作手冊 (the/7c力/a expression Kit Instruction Manual , Introgen Corporation, Carlsbad, CA， USA)，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，黃培堂翻譯，科學(xué)出版 社)，以及試劑廠家的說明書。
本發(fā)明主要涉及的培養(yǎng)基成分如下(除另有說明外均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))
LB培養(yǎng)基蛋白胨1%，酵母提取物0.5 %,氯化鈉O. 5 °/。；
種子培養(yǎng)基(YPD):蛋白胨2 %，酵母提取物l %，葡萄糖2 %;固體培養(yǎng) 基中加入l. 5%的瓊脂粉。
生長培養(yǎng)基(BMGY):酵母氮源威基l. 34 %，生物素(4 x10 - 5) %，蛋 白胨2 %,酵母提取物l %， 0.1 mo1/ L磷酸鹽緩沖液pH 6.0, 1%甘油；
誘導(dǎo)培養(yǎng)基(B固Y):酵母氮源堿基l. 34 %，生物素(4 x 10 -%，蛋 白胨2 %,酵母提取物l %， 0.1 mo1/ L磷酸鹽緩沖液pH 6.0， 1 % (v/v)曱 醇；
實(shí)例1含人胰島素原C肽的重組表達(dá)載體的構(gòu)建過程
人胰島素原C肽基因的化學(xué)合成根據(jù)人胰島素原C肽的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)，合成兩個(gè)互補(bǔ)的核普酸序列。
正向的核苷酸序列含有下列序列(5 ' —3 ' ): gaggccgaagattta cag gta ggacaagttgagttgggaggaggcccaggggcaggctcgctacagcccttggccttggaaggc tcactgcag.，
反向的核苷酸序列含有下列序列(5 ' — 3 '):
ctgcagtgagccttccaaggccaagggctgtagcgagcctgcccctgggcctcctccc aaxtcaacttgtcctacctgtaaatcttcggcctCo 正向和反向的核苷酸序列的5 '端均設(shè)計(jì)了限制性內(nèi)切酶EcoR I。 兩個(gè)互補(bǔ)的核苷酸序列通過退火即得到人胰島素原C肽基因。將上述核酸 產(chǎn)物和表達(dá)栽體pPIC3K分別用EcoR I酶切后，用DNA連接酶進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化 大腸桿菌DH5oc，在含氨千青霧素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子，最后通過 測序鑒定獲得含人胰島素原C肽基因的正確連接的重組表達(dá)載體。
提取上述重組表達(dá)載體，用Sal I酶切后，酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化酵母受體菌 GS115，涂布于MD平板上。培養(yǎng)48小時(shí)后，將一定的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞涂布于 YPD-G418平板上，G418濃度梯度是0. 25mg/mL， 0. 50mg/mL, 0. 75mg/ mL, 1. Omg/ mL， 1.5mg/mL， 2. 0mg/ mL， 4. 0mg/mL，在30° C培養(yǎng),2-5天后長 出G418抗性菌落。將此抗性菌落用PCR方法進(jìn)行DM鑒定，引物用pPIC3K 的通用測序引物A0X1，結(jié)果如圖l所示。
結(jié)果表明人胰島素原C肽^皮轉(zhuǎn)化到酵母受體菌GS115中。
實(shí)例2搖瓶表達(dá)人胰島素原C肽情況
從固體平板上挑選一個(gè)單菌落，接種到裝有25 mL BMGY的250 mL搖并瓦中， 30。 C, 220 rpm，過夜培養(yǎng)至0D咖-4。
將上述25mL培養(yǎng)液接種到lL BMGY中，繼續(xù)擴(kuò)增至菌體濃度006。。=6。
5000 rpm，室溫離心5min，收獲菌體。用新鮮的無菌B固Y懸浮菌體，至 菌液OD柳-l. 0， 30° C， 220 rpm誘導(dǎo)表達(dá)人胰烏素原C肽。每隔24h取樣，并 補(bǔ)充100%曱醇至終濃度1.5%。誘導(dǎo)培養(yǎng)120h結(jié)束，離心收獲菌體。將菌體通 過蛋白質(zhì)電泳分析，結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明人胰島素原C肽在畢赤酵母 中獲得表達(dá)。
搖瓶培養(yǎng)，分析人胰島素原C肽表達(dá)情況。通過大量篩選轉(zhuǎn)化子，獲得 高表達(dá)人胰島素原C肽的工程菌抹。本發(fā)明獲得的人胰島素原C肽工程菌林 的搖瓶表達(dá)量可達(dá)200mg/L以上。
實(shí)例3發(fā)酵表達(dá)人胰島素原C肽情況
從固體平板上挑選一個(gè)單菌落，接種到裝有25 mL BMGY的250 mL搖瓶中， 30° C， 220 rpm，過夜培養(yǎng)至0D柳-4。
將上述25mL培養(yǎng)液接種到250mL BMGY中，繼續(xù)擴(kuò)增至菌體濃度006。。=6， 將培養(yǎng)液接種到2L BSM發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)整pH-4. 0-7. 5，溫度在28° C， DO=40%，轉(zhuǎn)速500rpm，培養(yǎng)一段時(shí)間后，DO迅速升到100y。以上，表明培養(yǎng)基 中甘油消耗完畢，開始緩慢加入50°/。甘油，甘油流加速度30 mL/h，并維持DO 在35°/。以上，甘油補(bǔ)充時(shí)間4 h。
甲醇誘導(dǎo)階段停止補(bǔ)充甘油后，DO迅速升到100%以上，饑餓一段時(shí)間 后，開始緩慢補(bǔ)充曱醇，曱醇流加速度3-7 mL/h，隨著DO值上升，可將甲 醇流加速度加快。如果DO值低于35%,停止加入曱醇，待DO值持續(xù)升到35%, 才補(bǔ)充甲醇。每隔4 h，取菌體進(jìn)行檢測人胰島素原C肽的含量，發(fā)酵持續(xù) 96 h，收獲發(fā)酵菌體。在整個(gè)發(fā)酵過程中，DO值應(yīng)控制在20%-40%。酵母濕 菌體達(dá)到300g/L以上，C肽的含量達(dá)到1000mg/L以上。SEQUENCE LISTING
< 110〉 西藏射果科技有限公司 北京航空航天大學(xué)
西藏自治區(qū)特色農(nóng)牧業(yè)工程技術(shù)研究開發(fā)中心
<120>人胰島素原C肽高產(chǎn)菌林的構(gòu)建 <130>沒有案巻參考號
<160> 2
<170> Patentln version 3. 3
<210> 1
<211> 93
<212> DM
<213> Artificial
<220>
<223> 編碼人胰島素原C肽 <220>
<221> CDS <222> (l)..(")
<400> 1
gag gcc gaa gat tta cag gta gga caa gtt gag ttg gga gga ggc cca 48 Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 15 10 15
ggg gca ggc teg cU cag ccc Ug gcc Ug gaa ggc tea ctg cag 93 Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin 20 25 30
<210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Construct <400> 2
Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 15 10 15
Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin 20 25 30
權(quán)利要求
1. 一種能夠表達(dá)人胰島素原C肽的核酸分子，其序列為SEQ ID NO:1。
2. —種能胞內(nèi)表達(dá)人胰島素原C肽的重組載體，其特征為選用的表達(dá) 載體是畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)載體pPIC3K, pPIC3K與權(quán)利要求1所述的人胰島素 原C肽的核酸分子形成重組栽體。
3. —種能高效胞內(nèi)表達(dá)人胰島素原C肽的畢赤酵母菌林，其含有權(quán)利要 求2所述的重組栽體。
4. 如權(quán)利要求3所述的畢赤酵母菌林，其特征在于選用的畢赤酵母宿主 細(xì)胞是GS115。
5. —種能夠高效胞內(nèi)表達(dá)人胰島素原C肽的畢赤酵母菌林，其保藏編號 為CGMCC No.2686。
6. —種胞內(nèi)表達(dá)人胰島素原C肽的方法，其特征在于采用權(quán)利要求3-5 中任一畢赤酵母菌林胞內(nèi)表達(dá)獲得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用畢赤酵母表達(dá)人胰島素原C肽的方法，該方法首先合成人胰島素原C肽基因，然后將該基因與畢赤酵母表達(dá)載體進(jìn)行重組，獲得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到畢赤酵母中，最后通過大量篩選轉(zhuǎn)化子并獲得高效胞內(nèi)表達(dá)人胰島素原C肽的工程菌株。
文檔編號C12R1/84GK101381727SQ200810167200
公開日2009年3月11日 申請日期2008年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月8日
發(fā)明者王福清, 王秀云, 權(quán) 鄭 申請人:西藏金稞科技有限公司;北京航空航天大學(xué);西藏自治區(qū)特色農(nóng)牧業(yè)工程技術(shù)研究開發(fā)中心