專利名稱：一株原玻璃蠅節(jié)桿菌菌株及將其用于降解棉酚生產(chǎn)飼料蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株原玻璃蠅節(jié)桿菌菌株，尤其涉及一種將其用于棉籽餅粕發(fā)酵降解 棉酚生產(chǎn)飼料蛋白的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國(guó)是世界產(chǎn)棉大國(guó)，棉花產(chǎn)量居世界第一位，每年棉籽餅粕產(chǎn)量約40(Γ500萬(wàn) 噸，占各類植物餅粕總產(chǎn)量的30%。棉籽餅粕不僅資源豐富、分布廣泛，而且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也很 高，蛋白質(zhì)含量約為40%，氨基酸組成也較好，但因棉籽仁和棉籽餅粕中含有棉酚等有毒物 質(zhì)，其用途受到很大限制，多年來(lái)我國(guó)的棉籽餅粕資源有80%左右都用作肥料還田，用作飼 料蛋白資源的不足30%，造成了蛋白質(zhì)的極大浪費(fèi)。特別是近年來(lái)隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，世界 范圍內(nèi)蛋白質(zhì)飼料的缺乏日益突出。棉籽餅(粕)是當(dāng)前形勢(shì)下理想的替代豆粕的植物蛋 白質(zhì)源，而且棉籽餅粕價(jià)格低廉，現(xiàn)時(shí)售價(jià)不到大豆餅粕價(jià)格的一半，對(duì)棉籽餅粕的開發(fā)利 用，無(wú)疑會(huì)給我國(guó)畜牧業(yè)帶來(lái)顯著的經(jīng)濟(jì)效益。棉酚，又叫棉毒素或棉籽醇，化學(xué)名為1，1，6，6，7，7-六羥基_5，5-二異丙基-3， 3- 二甲基-(2，2-聯(lián)二萘)-8，8- 二醛基，分子式為C3tlH3tlO8,分子量518. 5，是棉屬植物體內(nèi) 形成的一種黃色多酚型物質(zhì)。棉酚在生物體內(nèi)與酶和蛋白質(zhì)結(jié)合，破壞蛋白質(zhì)的可消化性， 破壞胃粘膜組織并引起消化功能紊亂，當(dāng)含量超過安全界限時(shí)會(huì)導(dǎo)致畜禽生長(zhǎng)遲緩、中毒 及死亡。目前常用物理化學(xué)的方法對(duì)棉籽餅粕進(jìn)行脫毒處理，游離棉酚的含量經(jīng)處理后雖 可降低，但處理后產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)成分遭到了嚴(yán)重破壞，動(dòng)物的適口性和采食量也降低了。生物 發(fā)酵法是目前最有發(fā)展前途的脫毒方法，生產(chǎn)成本低、脫毒效果也好，該方法在利用微生物 發(fā)酵降解棉酚的同時(shí)，也提高了粗飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。如何更好的處理棉籽餅粕，使棉粕這一 豐富的飼料蛋白資源更好地應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)成為人們廣為關(guān)注的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一株原玻璃蠅節(jié)桿菌 菌株以及將其用于棉籽餅粕發(fā)酵降解棉酚生產(chǎn)飼料蛋白的方法，以便使棉粕更好地應(yīng)用于 畜牧業(yè)生產(chǎn)。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之一是，一株原玻璃蠅節(jié)桿菌菌株， 其具有序列表1所列RNA序列的16S rRNA基因，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普 通微生物中心，編號(hào)為CGMCC No. 3554。命名為 A. protophormiae KDN0065。上述原玻璃蠅節(jié)桿菌菌株CGMCC No. 3554，在MRS培養(yǎng)基上37 °C培養(yǎng)48 72h，菌 落呈圓形，直徑2 4mm，淺黃色，邊緣整齊，中間微凸，粘稠濕潤(rùn)有光澤。其菌體形態(tài)特征為 革蘭氏染色陽(yáng)性，菌體形狀有短桿狀——球狀的循環(huán)變化，有鞭毛，無(wú)芽孢。生理生化特征 為好氣，呼吸代謝，氧化酶陰性，能還原硝酸鹽，不抗酸，利用葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，能利用葡 萄糖、蔗糖、D-果糖、D-半乳糖、棉子糖，利用瓊脂，最適生長(zhǎng)溫度為37°C。
本發(fā)明采取的技術(shù)方案之二是，將上述的原玻璃蠅節(jié)桿菌菌株CGMCCNo. 3554用 于棉籽餅粕發(fā)酵降解棉酚。一種原玻璃蠅節(jié)桿菌菌株CGMCC No. 3554用于棉籽餅粕發(fā)酵降解棉酚生產(chǎn)飼料蛋 白的方法，包括下列內(nèi)容a、制備發(fā)酵菌種，制備過程如下(1)制備一級(jí)種子將原玻璃蠅節(jié)桿菌菌株CGMCC No. 3554接種至MRS斜面培養(yǎng) 基，37°C培養(yǎng)12h ；(2)制備二級(jí)種子從一級(jí)種子接種至含0. 08%瓊脂的MRS液體培養(yǎng)基，37°C通風(fēng) 培養(yǎng)24h，裝液量50ml/250ml，回旋式搖床200r/min ；b、將二級(jí)種子植于添加了一定量葡萄糖和玉米漿的棉籽餅粕培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在 37°C條件下發(fā)酵72hr，制得發(fā)酵脫毒的棉籽餅粕，即為飼料蛋白原料。在該棉籽餅粕中游離 棉酚含量降低60%，同時(shí)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，能提高發(fā)酵底料棉籽餅粕的品質(zhì)，從 而使之成為優(yōu)質(zhì)的飼料蛋白原料。上述的原玻璃蠅節(jié)桿菌菌株CGMCC No. 3554用于棉籽餅粕發(fā)酵降解棉酚生產(chǎn)飼料 蛋白的方法，其b步驟的具體內(nèi)容如下(1)配制發(fā)酵培養(yǎng)基取一定量經(jīng)細(xì)粉碎的棉籽餅粕，在每100份棉籽餅粕中加入 4份的葡萄糖、2份的玉米漿、0. 2份的KH2PO4和60份的水，混勻作為發(fā)酵培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)
基無(wú)需滅菌；(2)發(fā)酵培養(yǎng)在棉籽餅粕發(fā)酵培養(yǎng)基中接入10份的二級(jí)種子，37°C厭氧發(fā)酵 72hr ；(3)發(fā)酵結(jié)束，培養(yǎng)物在65 °C烘干，粉碎后包裝。發(fā)明人通過下列途徑得到原玻璃蠅節(jié)桿菌菌株CGMCC No. 3554。首先從棉粕堆 下土樣中的大量菌株中篩選目的菌株在MRS平板中添加醋酸棉酚，共生長(zhǎng)出來(lái)13個(gè)菌 株，增加平板中醋酸棉酚含量，篩選出其中生長(zhǎng)良好的9株菌。然后進(jìn)行培養(yǎng)，將生長(zhǎng)良好 的9株菌分別接種到棉籽餅粕培養(yǎng)基中進(jìn)行固態(tài)厭氧發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束檢測(cè)棉粕中棉酚的含 量。經(jīng)多次發(fā)酵培養(yǎng)，其中編號(hào)為KDN0065的菌株降解棉酚效果顯著，遺傳穩(wěn)定，經(jīng)其發(fā) 酵后棉籽餅粕中游離棉酚含量降低60%，不超過0. 5g/kg，顯著低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)1.2g/ kg)。對(duì)編號(hào)為KDN0065的目標(biāo)菌株進(jìn)行基因序列分析，結(jié)果表明該菌株為原玻璃蠅節(jié)桿菌 (A. protophormiae)，將其定名為A. protophormiae KDN0065，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心，編號(hào)為CGMCC No. 3554。本發(fā)明的原玻璃蠅節(jié)桿菌菌株CGMCC No. 3554，其發(fā)酵培養(yǎng)基不需要滅菌，生產(chǎn)成 本低廉；應(yīng)用菌株CGMCC No. 3554發(fā)酵降解棉籽餅粕中的棉酚生產(chǎn)飼料蛋白，采用固態(tài)厭 氧發(fā)酵，工藝簡(jiǎn)單；棉籽餅粕經(jīng)發(fā)酵脫毒，不僅游離棉酚含量降低60%，還提高了棉粕底物 的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1將棉粕堆下土樣中的大量菌株接種在添加醋酸棉酚的MRS平板中，共生長(zhǎng)出來(lái)13 個(gè)菌株，增加平板中醋酸棉酚含量，篩選出其中生長(zhǎng)良好的9株菌。然后將生長(zhǎng)良好的9株菌分別接種到棉籽餅粕培養(yǎng)基中進(jìn)行固態(tài)厭氧發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束檢測(cè)棉粕中棉酚的含量。經(jīng) 多次發(fā)酵培養(yǎng)，其中編號(hào)為KDN0065的菌株降解棉酚效果顯著，遺傳穩(wěn)定，經(jīng)其發(fā)酵后棉籽 餅粕中游離棉酚含量降低60%，不超過0. 5g/kg。該菌株保藏編號(hào)為CGMCC No. 3554。實(shí)施例2菌株CGMCC No. 3554用于棉籽餅粕固態(tài)厭氧發(fā)酵。(1)將菌株CGMCC No. 3554接種至MRS斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12h ；(2)然后接種至含0. 08 %瓊脂的MRS液體培養(yǎng)基，37 ！通風(fēng)培養(yǎng)24h，裝液量 50ml/250ml,回旋式搖床200r/min制得二級(jí)種子；(3)取一定量經(jīng)細(xì)粉碎的棉籽餅粕，在每100份棉籽餅粕中加入4份的葡萄糖、2 份的玉米漿、0. 2份的KH2PO4和60份的水，混勻作為發(fā)酵培養(yǎng)基；(4)在棉籽餅粕發(fā)酵培養(yǎng)基中接入10份的二級(jí)種子，37°C厭氧發(fā)酵72hr。(5)發(fā)酵結(jié)束，培養(yǎng)物在65 °C烘干，粉碎后包裝。按照國(guó)標(biāo)GB13086-91“飼料中游離棉酚的測(cè)定方法”，發(fā)酵結(jié)束測(cè)得干燥后棉籽餅 粕中殘余的游離棉酚小于0. 5g/kg。實(shí)施例3本實(shí)施例與實(shí)施例2的區(qū)別在于發(fā)酵培養(yǎng)基不同，其余步驟一樣。發(fā)酵培養(yǎng)基配制取一定量經(jīng)細(xì)粉碎的棉籽餅粕，在每100份棉籽餅粕中加入4份 的糖蜜、2份的玉米漿、和60份的水，混勻作為發(fā)酵培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基無(wú)需滅菌。按照國(guó) 標(biāo)GB13086-91 “飼料中游離棉酚的測(cè)定方法”測(cè)得干燥后棉籽餅粕中殘余的游離棉酚小于 0.5g/kg。實(shí)施例4本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于發(fā)酵底物接種原玻璃蠅節(jié)桿菌CGMCCNo. 3554的 同時(shí)，接種另一株干酪乳酸桿菌進(jìn)行混菌發(fā)酵。干酪乳酸桿菌一級(jí)種子制備與菌株CGMCC No. 3554相同，其二級(jí)種子接種MRS液體培養(yǎng)基，37°C厭氧培養(yǎng)12hr，裝液量170ml/250ml， 兩種種子各接5份，其余操作步驟與實(shí)施例2相同。按照國(guó)標(biāo)GB13086-91 “飼料中游離棉 酚的測(cè)定方法”測(cè)得干燥后棉籽餅粕中殘余的游離棉酚為0. 5g/kg。序列表<110>青島康地恩生物科技有限公司<120> 一株原玻璃蠅節(jié)桿菌菌株及將其用于降解棉酚生產(chǎn)飼料蛋白的方法<160>1<211>1498<212>16S rRNA<223> 原玻璃蠅節(jié)桿菌(A. protophormiae)<400>1TACGGCTACC TTGTTACGAC TTAGTCCCAA TCGCCAGTCC CACCTTCGAC 50GACTCCCCCC ACACAAGGTG GTTAGGCCAT CGGCTTCGGG TGTTACCAAC 100TTTCGTGACT TGACGGGCGG TGTGTACAAG GCCCGGGAAC GTATTCACCG 150CAGCGTTGCT GATCTGCGAT TACTAGCGAC TCCGACTTCA TGGGGTCGAG 200
TTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACCGGCTTTTAGGGATTAGCTCCACC250
TCACAGTATCGCAACCCATTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCC300
AAGACATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGT350
TGACCCCGGCAGTCTCCCATGAGTCCCCGGCATAACCCGCTGGCAACATG400
GAACGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACG450
AGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTGAACCAGCCCCAAAAGGGGAAAG500
ACCATCTCTGGCCCGGTCTGGAACATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCG550
CGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTC600
AATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGCACTT650
AATGCGTTAGCTACGGCGCGGAAAACGTGGAATGTCCCCCACACCTAGTG700
CCCAACGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCC750
CATGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTAAATGCCCAGAGACCTGCCTTCGCC800
ATCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAATTC850
CAGTCTCCCCTACATCACTCTAGTCTGCCCGTACCCACCGCAGATCCGAG900
GTTGAGCCTCGGACTTTCACGGCAGACGCGACAAACCGCCTACGAGCTCT950
TTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCGCCCTACGTATTACCGCGGC1000
TGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTCTTCTGCAAGTACCGTCACCCCAA1050
AAAGGGGCTTCTTCCCTACTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCAT1100
CCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCC1150
CCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGG1200
CCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTGAGCCATTA1250
CCTCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGAGTCCATCCCCAACCGATAAATCT1300
TTCCACCCCCTGCCATGCAGCAGGAAGTCATATCCGGTATTAGACCCAGT1350
TTCCCGGGCTTATCCCGAAGTCAGGGGCAGGTTACTCACGTGTTACTCAC1400
CCGTTCGCCACTAATCCACCAGTGCAAGCACCAGCATCATCGTTCGACTT1450
GCATGTGTTAAGCACGCCGCCAGCGTTCATCCTGAGCCAGGATCAAAC1498
權(quán)利要求
一株原玻璃蠅節(jié)桿菌菌株，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號(hào)為CGMCC No.3554；其具有ID NO1所示的16S rRNA基因。
2.將權(quán)利要求1所述的原玻璃蠅節(jié)桿菌菌株用于棉籽餅粕發(fā)酵降解棉酚。
3.一種將權(quán)利要求1所述的原玻璃蠅節(jié)桿菌菌株用于棉籽餅粕發(fā)酵降解棉酚生產(chǎn)飼 料蛋白的方法，包括下列內(nèi)容a、制備種子，種子制備過程如下(1)制備一級(jí)種子將原玻璃蠅節(jié)桿菌菌株CGMCCNo. 3554接種至MRS斜面培養(yǎng)基， 37°C 培養(yǎng) 12h ；(2)制備二級(jí)種子從一級(jí)種子接種至含0.08%瓊脂的MRS液體培養(yǎng)基，37°C通風(fēng)培養(yǎng) 24h，裝液量50ml/250ml，回旋式搖床200r/min ；b、將二級(jí)種子接種到添加葡萄糖和玉米漿的棉籽餅粕培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在37°C條件下發(fā) 酵72hr，制得發(fā)酵脫毒的棉籽餅粕飼料蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求4所述的原玻璃蠅節(jié)桿菌菌株用于棉籽餅粕發(fā)酵降解棉酚生產(chǎn)飼料 蛋白的方法，其b步驟的具體內(nèi)容如下(1)配制發(fā)酵培養(yǎng)基取一定量經(jīng)細(xì)粉碎的棉籽餅粕，在每100份棉籽餅粕中加入4份 的葡萄糖、2份的玉米漿、0. 2份的KH2PO4和60份的水，混勻作為發(fā)酵培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基無(wú) 需滅菌；(2)發(fā)酵培養(yǎng)在棉籽餅粕發(fā)酵培養(yǎng)基中接入10份的二級(jí)種子，37°C厭氧發(fā)酵72hr；(3)發(fā)酵結(jié)束，培養(yǎng)物在65°C烘干，粉碎后包裝。
全文摘要
一株原玻璃蠅節(jié)桿菌菌株，保藏編號(hào)為CGMCC No.3554，其具有ID No1所示的16S rRNA基因。一種將該原玻璃蠅節(jié)桿菌菌株用于棉籽餅粕發(fā)酵降解棉酚生產(chǎn)飼料蛋白的方法，包括a、制備種子，b、將種子接種到添加葡萄糖和玉米漿的棉籽餅粕培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在37℃條件下發(fā)酵72h，制得發(fā)酵脫毒的棉籽餅粕飼料蛋白。該原玻璃蠅節(jié)桿菌菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)成本低廉；應(yīng)用該菌株發(fā)酵降解棉籽餅粕中的棉酚生產(chǎn)飼料蛋白的工藝簡(jiǎn)單；棉籽餅粕發(fā)酵脫毒后，游離棉酚含量降低60％，棉粕底物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提高。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101892172SQ20091021720
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2009年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者于俊堯, 周生飛, 柳紅艷, 蔡冬梅, 馬立周 申請(qǐng)人:青島康地恩生物科技有限公司