本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及一類(lèi)作為c-Met激酶抑制劑的苯并雜環(huán)類(lèi)衍生物及其醫(yī)療用途。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤是威脅人類(lèi)健康的重大疾病之一。據(jù)推測(cè)到2020年前，全球癌癥將新增1500萬(wàn)癌癥患者，癌癥的死亡人數(shù)也在全球迅猛上升，可能會(huì)增至1320萬(wàn)。腫瘤的防治已成為各國(guó)醫(yī)藥界的重要研究課題。

肝癌是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，目前已成為僅次于胃癌和食道癌的第三大常見(jiàn)惡性腫瘤，主要分布在東亞、東南亞以及非洲中西部地區(qū)。肝癌的治療手段主要包括手術(shù)治療(肝移植、腫瘤切除及非切除性局部療法如肝動(dòng)脈化療栓塞)、放療及化療，其中，由于肝癌惡性程度高，發(fā)展變化快，早期即存在肝內(nèi)散播以及肝功能失代償?shù)纫蛩兀灾挥猩贁?shù)病人可進(jìn)行手術(shù)切除等治愈性治療方案。根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，切除治療法根治肝癌五年后的復(fù)發(fā)率仍舊高達(dá)40-70％，針對(duì)肝癌的這些生物學(xué)特點(diǎn)，應(yīng)用系統(tǒng)化療藥物阻止其侵襲和轉(zhuǎn)移并抑制中晚期腫瘤演進(jìn)的系統(tǒng)治療模式是肝癌標(biāo)準(zhǔn)化治療的目標(biāo)之一。

目前在臨床上使用的傳統(tǒng)肝癌化療藥物有絲裂霉素、5-氟尿嘧啶、阿霉素及表阿霉素等，這類(lèi)化療藥物最常見(jiàn)的缺陷是組織選擇性差，體內(nèi)分布廣泛，因此在發(fā)揮療效的同時(shí)往往會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的全身性毒副作用，如骨髓抑制作用、消化道毒性(惡心嘔吐)和毛發(fā)細(xì)胞毒性等。因此，尋找療效較高且毒副作用小的新型抗癌藥物已成為肝癌化療創(chuàng)新藥物研究中的重點(diǎn)問(wèn)題。

c-Met是酪氨酸激酶受體家族Ron亞族的一個(gè)原型成員，由原癌基因c-Met表達(dá)，它是唯一已知的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)高親和力受體。研究表明，肝癌組織中，c-Met在mRNA和蛋白水平的陽(yáng)性率和表達(dá)顯著高于癌旁非腫瘤組織或正常肝組織，而且與腫瘤的惡性程度相關(guān)。此外，c-Met基因的突變現(xiàn)象在肝癌中也有發(fā)生，這也說(shuō)明c-Met基因的突變與肝癌的發(fā)生和發(fā)展也有一定關(guān)聯(lián)。近年來(lái)，基于c-Met靶點(diǎn)的抗肝癌藥物研究激起了藥物化學(xué)家濃厚的研究興趣，并且發(fā)現(xiàn)了一些具有開(kāi)發(fā)前景的候選藥物，實(shí)驗(yàn)已證明單獨(dú)采用c-Met抑制劑或協(xié)同其它化療方法進(jìn)行治療，可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制其耐藥性。臨床研究方面，在涵蓋多種腫瘤的臨床研究中發(fā)現(xiàn)多個(gè)c-Met小分子抑制劑藥物對(duì)具有肝硬化的肝癌病人的肝功能沒(méi)有顯著損害，具有一定的安全可控性，同時(shí)也初步展現(xiàn)了其對(duì)肝癌的治療效果。這些研究都證明了HGF/c-Met不僅作為近年來(lái)腫瘤基因治療、抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)之一，也能夠成為治療肝癌藥物研發(fā)與開(kāi)發(fā)的靶點(diǎn)之一。

發(fā)明目的

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一類(lèi)作為c-Met激酶抑制劑的苯并雜環(huán)類(lèi)衍生物，含有這些衍生物的藥物組合物、該化合物的鹽類(lèi)和以該化合物或其鹽類(lèi)為活性成分的藥物在制備抗腫瘤藥物及肝病相關(guān)疾病治療藥物中的應(yīng)用。

術(shù)語(yǔ)說(shuō)明：本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“芳基”是指5到12個(gè)碳原子的全碳單環(huán)或稠合多環(huán)基團(tuán)，具有完全共軛的π電子系統(tǒng)。所述芳基的非限制性實(shí)例有：苯環(huán)、萘環(huán)和蒽環(huán)。芳基可以是取代或無(wú)取代的。芳基的取代基選自鹵素、硝基、氨基、氰基、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷胺基、鹵代的C₁-C₄烷氧基、鹵代的C₁-C₄烷胺基、鹵代的C₁-C₄烷基。

本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)芳基”指5到12個(gè)環(huán)原子的不飽和的碳環(huán)，其中一個(gè)或多個(gè)碳被雜原子例如氧、氮、硫等置換。所述的雜環(huán)芳基可以是單環(huán)，也可以是雙環(huán)，即通過(guò)兩個(gè)環(huán)稠合而成。具體的雜環(huán)芳基可以是：吡啶基，嘧啶基，吡嗪基，異惡唑基，異噻唑基、吡唑基、噻唑基、惡唑基和咪唑基等。雜環(huán)芳基可以是取代或無(wú)取代的。雜環(huán)芳基的取代基可以選自鹵素、硝基、氨基、氰基、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷胺基、鹵代的C₁-C₄烷氧基、鹵代的C₁-C₄烷胺基、鹵代的C₁-C₄烷基。

本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)烷基”指單環(huán)或稠合環(huán)基團(tuán)，在環(huán)中具有5到9個(gè)環(huán)原子，其中至少一個(gè)或兩個(gè)環(huán)原子是選自N、O、S(O)_m(其中m是0至2的整數(shù))的雜原子，其余環(huán)原子是C。這些環(huán)可以具有一條或多條雙鍵，但這些環(huán)不具有完全共軛的π電子系統(tǒng)。所述雜環(huán)烷基可以是取代或無(wú)取代的。無(wú)取代的雜環(huán)烷基的可以是吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉代基、硫代嗎啉代基、高哌嗪基等。雜環(huán)可以是取代或無(wú)取代的。雜環(huán)的取代基選自鹵素、硝基、氨基、氰基、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷胺基、鹵代的C₁-C₄烷氧基、鹵代的C₁-C₄烷胺基、鹵代的C₁-C₄烷基。

本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”是指具有3-6個(gè)碳原子的飽和單環(huán)碳環(huán)?！碍h(huán)烷基”包括例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基和環(huán)辛基?！碍h(huán)烷基”還包括取代環(huán)烷基。所述的環(huán)烷基還可任選在任何可利用碳上被一個(gè)或多個(gè)取代基取代，所述的取代基選自烷氧基、鹵素和鹵代烷基，如全氟烷基等。

本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“烷氧基”是指-O-烷基基團(tuán)。本發(fā)明所用“烷氧基”的實(shí)例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基和叔丁氧基?！巴檠趸边€包括取代烷氧基。烷氧基可任選被鹵素取代一次或多次。

本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“鹵素”表示氟、氯、溴或碘，優(yōu)選為氟或氯。

本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“烷胺基”是指-N-烷基基團(tuán)，具有一般結(jié)構(gòu)－NH(烷基)或－N(烷基)(烷基)之二級(jí)或三級(jí)胺，各烷基可相同或不同。此基包含例如單－(C₁-C₈烷基)胺基及二－(C₁-C₈烷基)胺基，其中各烷基可相同或不同且可含1至8個(gè)碳原子，以及單－(C₁-C₆烷基)胺基及二－(C₁-C₆烷基)胺基及單－(C₁－C₄烷基)胺基及二－(C₁－C₄烷基)胺基。本發(fā)明所用“烷胺基”的實(shí)例包括但不限于甲級(jí)取代氨基、乙基取代氨基、正丙基取代氨基、異丙基取代氨基、正丁基取代氨基。烷胺基可任選被甲基、乙基、丙基等取代一次或兩次。

本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“溶劑合物”是指由溶質(zhì)(例如：本發(fā)明的通式(I)～通式(Ⅲ)化合物)和溶劑形成的可變化學(xué)計(jì)量的復(fù)合物。為了本發(fā)明的目的，所述溶劑不能干擾溶質(zhì)的生物學(xué)活性。合適的溶劑的實(shí)例包括但不限于水、甲醇、乙醇和乙酸。優(yōu)選使用的溶劑為藥學(xué)可接受溶劑。合適的藥學(xué)可接受溶劑包括但不限于水、乙醇和乙酸。更優(yōu)選地，所用溶劑為水。

本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

本發(fā)明所提供的c-Met激酶抑制劑的苯并雜環(huán)類(lèi)衍生物具有通式(Ⅰ)結(jié)構(gòu)：

及其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物；

其中：R₁選自無(wú)取代或取代的芳基、無(wú)取代或取代的雜環(huán)芳基，所述取代的取代基任選自鹵素、硝基、氨基、氰基、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷胺基、鹵代的C₁-C₄烷氧基、鹵代的C₁-C₄烷胺基、鹵代的C₁-C₄烷基；

環(huán)M選自取代的脂肪含氮雜環(huán)，所述脂肪含氮雜環(huán)為五元的飽和或不飽和的脂肪含氮雜環(huán)，或者所述脂肪含氮雜環(huán)為六元的飽和或不飽和的脂肪含氮雜環(huán)，所述取代的取代基選自

A選自其中R₃和R₄分別獨(dú)立選自H、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、鹵代的C₁-C₄烷氧基、鹵代的C₁-C₄烷基，R₃和R₄相同或不同；

R₂選自取代或無(wú)取代的芳基、取代或無(wú)取代的雜環(huán)芳基、取代或無(wú)取代的環(huán)烷基、取代或無(wú)取代的飽和或不飽和的雜環(huán)烷基，任意稠合的芳基、雜環(huán)芳基，所述的取代基任選自鹵素、硝基、氨基、氰基、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷胺基、鹵代的C₁-C₄烷氧基、鹵代的C₁-C₄烷胺基、鹵代的C₁-C₄烷基；作為優(yōu)選，所述的芳基或者雜環(huán)芳基選自吡咯、呋喃、噻吩、吡唑、咪唑、噻唑、噁唑、苯環(huán)、吡啶、噠嗪、嘧啶、吡嗪。

進(jìn)一步地，本發(fā)明優(yōu)選的化合物具有通式(Ⅱ)結(jié)構(gòu)：

及其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其中：

R₂、M和A如通式(Ⅰ)所定義；

R₅選自鹵素、硝基、氨基、氰基、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷氧基、C₁-C₃烷胺基、鹵代的C₁-C₃烷氧基、鹵代的C₁-C₃烷胺基、鹵代的C₁-C₃烷基。

更進(jìn)一步地，本發(fā)明優(yōu)選的化合物具有通式(III)結(jié)構(gòu)：

及其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其中：

R₂、R₅和A如通式(Ⅱ)所定義。

更具體地，本發(fā)明通式(Ⅲ)結(jié)構(gòu)的優(yōu)選化合物為：

N-(1-((2-氨基吡啶-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-基)-N-(4-氟苯基)環(huán)丙基-1,1-二甲酰胺；

N-(4-氯呋喃-2-基)-N-(1-((2-甲基吡啶-4-基)甲基)吲哚-6-基)環(huán)丙基-1,1-二甲酰胺；

N-(2-氯苯基)-N-(1-(3-氰基苯?；?吲哚-6-基)環(huán)丙基-1,1-二甲酰胺；

N-(1-(3-氨基環(huán)己甲?；?-1H-吲哚-6-基)-N-(3-甲氧基苯基)環(huán)丙基-1,1-二甲酰胺；

N-(1-(2-氨基異煙?；?-1H-吲哚-6-基)-N-(1-甲基-1H-吡唑-2-基)環(huán)丙基-1,1-二甲酰胺；

及其上述化合物藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。

本發(fā)明采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法可以制備本發(fā)明所述的作為c-Met激酶抑制劑的苯并雜環(huán)類(lèi)衍生物的鹽。所述的鹽可以是有機(jī)酸鹽、無(wú)機(jī)酸鹽等，所述的有機(jī)酸鹽可以是枸櫞酸鹽、富馬酸鹽、草酸鹽、蘋(píng)果酸鹽、乳酸鹽、樟腦磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽等；所述的無(wú)機(jī)酸鹽可以是氫鹵酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽等。例如，與低級(jí)烷基磺酸，如甲磺酸，三氟甲磺酸等可形成甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽；與芳基磺酸，如苯磺酸或?qū)妆交撬岬瓤尚纬蓪?duì)甲苯磺酸鹽、苯磺酸鹽；與有機(jī)羧酸，如乙酸，富馬酸，酒石酸，草酸，馬來(lái)酸，蘋(píng)果酸，琥珀酸或檸檬酸等可形成相應(yīng)的鹽；與氨基酸，如谷氨酸或天冬氨酸可形成谷氨酸鹽或天冬氨酸鹽。與無(wú)機(jī)酸，如氫鹵酸(如氫氟酸、氫溴酸、氫碘酸、氫氯酸)，硝酸，碳酸，硫酸或磷酸等也可形成相應(yīng)的鹽。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含至少一種活性組分以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體，所述的活性組分可以是如前所述的任意一種形式的化合物(作為c-Met激酶抑制劑的苯并雜環(huán)類(lèi)衍生物)、所述化合物在藥學(xué)上可接受的鹽、所述化合物溶劑合物中的任意一種或任意多種。

所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)稀釋劑，賦形劑，填充劑，粘合劑，濕潤(rùn)劑，崩解劑，吸收促進(jìn)劑，表面活性劑，吸附載體，潤(rùn)滑劑等，必要時(shí)還可以加入香味劑，甜味劑等。本發(fā)明藥物可以制成片劑，粉劑，粒劑，膠囊，口服液及注射用藥等多種形式，上述各劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供以上所述的各種化合物、所述化合物在藥學(xué)上可接受的鹽、所述化合物的溶劑合物、所述的藥物組合物在制備抗腫瘤藥物中的用途，所述的腫瘤選自乳腺癌、肉瘤、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、腎癌、胰腺癌、血癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、頭癌、頸癌、甲狀腺癌、肝癌、卵巢癌、外陰癌、子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、睪丸癌、膀胱癌、食管癌、胃癌、鼻咽癌、頰癌、口腔癌、胃腸道間質(zhì)瘤、皮膚癌、多發(fā)性骨髓瘤。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供以上所述的各種化合物、所述化合物在藥學(xué)上可接受的鹽、所述化合物的溶劑合物、所述的藥物組合物在制備肝病相關(guān)疾病治療藥物中的用途，所述的肝病相關(guān)疾病選自病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、藥物毒性肝炎、肝病肝損傷、肝功能衰竭、慢性重型肝炎、肝硬化、肝膿腫、脂肪肝、原發(fā)性肝癌。

本發(fā)明還提供以上所述的各種化合物、所述化合物在藥學(xué)上可接受的鹽、所述化合物的溶劑合物、所述的藥物組合物，與其他藥物聯(lián)合使用在在制備肝病相關(guān)疾病治療藥物中的用途，所述的肝病相關(guān)疾病選自病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、藥物毒性肝炎、肝病肝損傷、肝功能衰竭、慢性重型肝炎、肝硬化、肝膿腫、脂肪肝、原發(fā)性肝癌。

本發(fā)明還提供了制備通式(Ⅰ)及其藥學(xué)可接受衍生物的方法，通過(guò)化合物的三個(gè)主要組分，本發(fā)明稱(chēng)為化合物的頭部(Ⅳ)、中心(V)和尾巴(Ⅵ)的反應(yīng)來(lái)制備通式(Ⅰ)化合物，部分通式(Ⅰ)化合物的合成路線(xiàn)如下：

每種通式(Ⅰ)化合物都可方便地通過(guò)分開(kāi)制備所述化合物的三種構(gòu)建體，然后再將這些組分組合形成通式(Ⅰ)化合物。為了方便，所述三種構(gòu)建體在本發(fā)明中被稱(chēng)為頭部(Ⅳ)、中心(V)和尾巴(Ⅵ)。為了方便，當(dāng)單獨(dú)使用時(shí)，通篇使用的術(shù)語(yǔ)頭部、中心和尾巴表示各個(gè)構(gòu)建體，當(dāng)在文中以頭部/中心、尾巴/中心和/或頭部/中心/尾巴組合出現(xiàn)時(shí)，也是指相應(yīng)的部分。

本發(fā)明化合物的頭部組分(component)為以通式(Ⅳ)為代表的取代的環(huán)丙基甲酸化合物：

本發(fā)明化合物的中心組分(component)為以通式(V)為代表的具有取代苯并氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物：

本發(fā)明化合物的尾巴組分為以通式(Ⅵ)為代表的化合物：

化合物頭部(Ⅳ)、中心(V)和尾巴(Ⅵ)以如下方案所示的合成路線(xiàn)組合：

如以上反應(yīng)式所示，將丙二酸與式R₁取代胺中間體在氯化亞砜、溶劑(如二氯甲烷)，在室溫條件下縮合得到頭部(Ⅳ)。中心(V)在氯化亞砜、溶劑、室溫或者是堿(如叔丁醇鉀)、溶劑(如二氯甲烷)條件下與帶有氨基保護(hù)基的尾巴(Ⅵ)反應(yīng)，得到的中間體經(jīng)還原反應(yīng)后，產(chǎn)物與頭部(Ⅳ)進(jìn)行縮合反應(yīng)及最后的氨基脫保護(hù)反應(yīng)，最終得到目標(biāo)化合物(Ⅰ)。

本發(fā)明還提供本發(fā)明所述的化合物或其可藥用鹽在制備c-Met激酶抑制劑中的應(yīng)用，特別是在制備治療細(xì)胞增生疾病中的應(yīng)用。所述的細(xì)胞增生疾病包括癌癥。換言之，本發(fā)明提供的化合物(c-Met激酶抑制劑的苯并雜環(huán)類(lèi)衍生物)或其可藥用鹽單獨(dú)或和其他藥物聯(lián)合使用在治療增生類(lèi)疾病(如癌癥)中的應(yīng)用。能和本發(fā)明所提供的化合物或其可藥用鹽聯(lián)合使用的抗腫瘤藥包括但并非限定至少一種以下種類(lèi)：有絲分裂抑制劑(如長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春地辛和長(zhǎng)春瑞賓)；微管蛋白分解抑制劑(如泰素)；烷基化試劑(如順鉑、卡鉑和環(huán)磷酰胺)；抗代謝物(如5-氟尿嘧啶、替加氟、甲氨蝶呤、阿糖胞苷和羥基脲)；可插入抗生素(如阿雷素、絲裂霉素和爭(zhēng)光霉素)；酶(如天門(mén)冬氨酶)；拓樸異構(gòu)酶抑制劑(如依托伯苷和喜樹(shù)堿)；生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(如干擾素)。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的可實(shí)施性，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)，對(duì)相應(yīng)的技術(shù)特征進(jìn)行修改或替換，仍然屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1. 1-(4-氟苯基氨基甲酰基)環(huán)丙烷甲酸的制備

將化合物2-a(環(huán)丙烷二甲酸,0.13g,1.00mmol)溶于二氯甲烷(10ml)，冰浴下攪拌10min后，加入三乙胺(0.42ml,3.00mmol)，緩慢加入氯化亞砜(0.143g,1.20mmol)，繼續(xù)在冰浴下攪拌半小時(shí)，慢慢滴加溶有化合物1-a(3-氟苯胺,0.123g,1.0mmol)的二氯甲烷溶液(10ml)，繼續(xù)在冰浴下攪拌半小時(shí)，恢復(fù)室溫?cái)嚢?h(TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)是否完成)。反應(yīng)完成后，減壓回收二氯甲烷，向剩余反應(yīng)物中加入飽和氯化鈉水溶液(40ml)，乙酸乙酯萃取反應(yīng)液3次，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓回收溶劑。得到白色固體(中間體1)0.21g。

收率75.5％；ESI(M+H)⁺＝224.16(M+1)。

實(shí)施例2. 1-(4-氯呋喃-2-基氨基甲酰基)環(huán)丙烷甲酸的制備

以化合物1-b和化合物2-a為原料，按照實(shí)施例1方法合成。得到目標(biāo)產(chǎn)物(中間體2)。

收率77.4％；ESI(M+H)⁺＝230.11(M+1)。

實(shí)施例3. 1-(2-氯苯基氨基甲?；?環(huán)丙烷甲酸的制備

以化合物1-c和化合物2-a為原料，按照實(shí)施例1方法合成。得到目標(biāo)產(chǎn)物(中間體3)。

收率81.6％；ESI(M+H)⁺＝240.25(M+1)。

實(shí)施例4. 1-(3-甲氧基苯基氨基甲?；?環(huán)丙烷甲酸的制備

以化合物1-d和化合物2-a為原料，按照實(shí)施例1方法合成。得到目標(biāo)產(chǎn)物(中間體4)。

收率74.3％；ESI(M+H)⁺＝236.23(M+1)。

實(shí)施例5. N-(1-甲基-1H-吡唑-2-基氨基甲酰基)環(huán)丙烷甲酸的制備

以化合物1-e和化合物2-a為原料，按照實(shí)施例1方法合成。得到目標(biāo)產(chǎn)物(中間體5)。

收率81.6％；ESI(M+H)⁺＝209.25(M+1)。

實(shí)施例6. 4-((6-氨基-1H-吲哚-1-基)甲基)吡啶酰胺的制備

將氫化鈉(0.048g,2mmol)加入溶有化合物2-a(4-氯甲基吡啶酰胺,0.176g,1.0mmol)的無(wú)水N,N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液中。室溫?cái)嚢?.5h，加入化合物3-a(6-硝基吲哚,0.16g,1.0mmol)，氬氣保護(hù)，將反應(yīng)液升溫至60℃，攪拌1h，恢復(fù)室溫?cái)嚢?TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)是否完成)。反應(yīng)完成后，減壓回收溶劑，向剩余反應(yīng)物中加入飽和氯化鈉水溶液(20ml)，乙酸乙酯萃取反應(yīng)液3次，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓回收溶劑。柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝1:1)，得到產(chǎn)物(中間體6)0.22g。

收率76％；ESI(M+H)⁺＝297.14(M+1)。

將溶有中間體6(0.29g,1mmol)，鋅粉(0.128g,2mmol)，氯化銨(0.106,2mmol)的四氫呋喃(10ml)溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫?cái)嚢?.5h后，升溫至50℃，攪拌1h，恢復(fù)室溫?cái)嚢?TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)是否完成)。反應(yīng)完成后，抽濾，減壓回收濾液，向剩余反應(yīng)物中加入飽和氯化鈉水溶液(20ml)，乙酸乙酯萃取反應(yīng)液3次，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓回收溶劑。柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝1:4，得到產(chǎn)物(中間體7)0.17g。

收率64％；ESI(M+H)⁺＝267.45(M+1)。

實(shí)施例7. 1-((2-甲基吡啶-4-基)-吲哚-6-胺的制備

以化合物2-b和化合物3-b為原料，按照實(shí)施例5方法合成。得到中間體8。

收率68.3％；ESI(M+H)⁺＝270.15(M+1)。

以中間體8為原料，按照實(shí)施例5方法合成。得到中間體9。

收率56.1％；ESI(M+H)⁺＝240.34(M+1)。

實(shí)施例8. 3-(6-氨基-1H-吲哚-1-羰基)環(huán)己基甲酰胺的制備

將化合物2-d(0.17g,1.00mmol)溶于二氯甲烷(10ml)，冰浴下攪拌10min后，加入三乙胺(0.42ml,3.00mmol)，緩慢加入氯化亞砜(0.14g,1.20mmol)，繼續(xù)在冰浴下攪拌半小時(shí)，慢慢滴加溶有化合物3-a(0.16g,1.0mmol)的二氯甲烷溶液(10ml)，繼續(xù)在冰浴下攪拌半小時(shí)，恢復(fù)室溫?cái)嚢?h(TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)是否完成)。反應(yīng)完成后，減壓回收二氯甲烷，向剩余反應(yīng)物中加入飽和氯化鈉水溶液(40ml)，乙酸乙酯萃取反應(yīng)液3次，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓回收溶劑。得到白色固體(中間體12)0.23g。

收率71.2％；ESI(M+H)⁺＝316.25(M+1)。

以中間體12為原料，按照實(shí)施例5方法合成。得到中間體13。

收率68.1％；ESI(M+H)⁺＝286.11(M+1)。

實(shí)施例9. 3-(6-氨基吲哚-1-羰基)苯甲腈的制備

以化合物2-c和化合物3-b為原料，按照實(shí)施例8方法合成。得到中間體10。

收率78.2％；ESI(M+H)⁺＝294.54(M+1)。

以中間體10為原料，按照實(shí)施例5方法合成。得到中間體11。

收率67.6％；ESI(M+H)⁺＝264.2(M+1)。

實(shí)施例10. 4-(6-氨基-1H-吲哚-1-羰基)吡啶酰胺的制備

以化合物2-e和化合物3-a為原料，按照實(shí)施例9方法合成。得到中間體14。

收率69.2％；ESI(M+H)⁺＝311.4(M+1)。

以中間體14為原料，按照實(shí)施例5方法合成。得到中間體15。

收率75.1％；ESI(M+H)⁺＝281.31(M+1)。

實(shí)施例11. N-(1-((2-氨基吡啶-4-基)甲基)-1H-吲哚-6-基)-N-(4-氟苯基)環(huán)丙基-1,1-二甲酰胺(化合物1)的制備

以中間體1和中間體7為原料，按照實(shí)施例9方法合成。得到中間體16。

收率91.2％；ESI(M+H)⁺＝472.3(M+1)。

將中間體16(0.47g,1.00mmol)溶于乙酸乙酯/水/乙腈(10ml,2:2:1)中，冰浴條件下慢慢滴加二乙酸碘苯(0.4g,1.2mmol)，恢復(fù)室溫，攪拌1h，回收溶劑，向剩余反應(yīng)物中加入水(20ml)，乙酸乙酯萃取反應(yīng)液3次，合并有機(jī)相飽和氯化鈉洗1次，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓回收溶劑。硅膠柱層析(乙酸乙酯:石油醚＝2.5:1)，得到目標(biāo)化合物(化合物1)0.37g。

收率84.3％；ESI(M+H)⁺＝444.31(M+1)。

實(shí)施例12. N-(4-氯呋喃-2-基)-N-(1-((2-甲基吡啶-4-基)甲基)吲哚-6-基)環(huán)丙基-1,1-二甲酰胺(化合物2)的制備

以中間體2和中間體9為原料，按照實(shí)施例9方法合成。得到化合物2。

收率81.3％；ESI(M+H)⁺＝449.51(M+1)。

實(shí)施例13. N-(2-氯苯基)-N-(1-(3-氰基苯酰基)吲哚-6-基)環(huán)丙基-1,1-二甲酰胺(化合物3)的制備

以中間體3和中間體11為原料，按照實(shí)施例9方法合成。得到化合物3。

收率79.3％；ESI(M+H)⁺＝471.64(M+1)。

實(shí)施例14. N-(1-(3-氨基環(huán)己甲酰基)-1H-吲哚-6-基)-N-(3-甲氧基苯基)環(huán)丙基-1,1-二甲酰胺(化合物4)的制備

以中間體4和中間體13為原料，按照實(shí)施例9方法合成。得到中間體17。

收率74.3％；ESI(M+H)⁺＝489.32(M+1)。

以中間體17為原料，按照實(shí)施例11方法合成。得到化合物4。

收率86.9％；ESI(M+H)⁺＝461.1(M+1)。

實(shí)施例15. N-(1-(2-氨基異煙?；?-1H-吲哚-6-基)-N-(1-甲基-1H-吡唑-2-基)環(huán)丙基-1,1-二甲酰胺(化合物5)的制備

以中間體5和中間體15為原料，按照實(shí)施例9方法合成。得到中間體18。

收率76.5％；ESI(M+H)⁺＝457.3(M+1)。

以中間體18為原料，按照實(shí)施例11方法合成。得到化合物5。

收率88.9％；ESI(M+H)⁺＝429.44(M+1)。

本發(fā)明制得的化合物對(duì)c-Met激酶、肝及其他腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

以化合物BMS-777607和紫杉醇為陽(yáng)性對(duì)照，采用MTT法測(cè)定化合物對(duì)常見(jiàn)的腫瘤細(xì)胞株(人肝癌細(xì)胞株HepG2、人肺癌細(xì)胞株EBC-1、人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3)的體外抑制作用(IC₅₀)，同時(shí)利用商品化的c-Met激酶試劑盒，評(píng)價(jià)c-Met酶抑制活性(IC₅₀)。

本發(fā)明化合物抗腫瘤活性的藥理實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果如下：

首先是體外腫瘤增殖抑制活性的測(cè)定及初步的構(gòu)效關(guān)系研究，選用不同的實(shí)體瘤和白血病細(xì)胞株對(duì)所合成的化合物進(jìn)行了體外抗腫瘤活性的測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞株：人肝癌細(xì)胞株HepG2、人肺癌細(xì)胞株EBC-1、人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3

培養(yǎng)基：HepG2:RPMI 1640+胎牛血清

EBC-1：RPMI 1640+胎牛血清

HL60：RPMI 1640+胎牛血清

藥物配制方法：將藥物溶于DMSO中制成50mM的儲(chǔ)備液，并按一定比例稀釋得到5個(gè)不同濃度。

腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)：

將所選取的三株腫瘤細(xì)胞HepG2、EBC-1、HL60，于37℃、5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞密度長(zhǎng)到70～90％時(shí)傳代(貼壁細(xì)胞用Duck’s EDTA消化后傳代)，用于以后實(shí)驗(yàn)所需。

將化合物用二甲基亞砜(DMSO)溶解，稀釋?zhuān)[瘤細(xì)胞HepG2、EBC-1、HL60，在96孔板上種入4000個(gè)/200μL/孔，每孔加入化合物1μL，終濃度為50μM，10μM，2μM，0.4μM，0.08μM共同于37℃、5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育72小時(shí)，以DMSO(1％)為空白對(duì)照。72小時(shí)后，加入終濃度為0.25mg/mL的MTT，置于37℃、5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中4小時(shí)，之后吸干培養(yǎng)液，每孔加入100μL DMSO，用酶聯(lián)免疫儀于570nm處測(cè)定吸光度(OD值)，所得數(shù)據(jù)用于計(jì)算IC₅₀。

細(xì)胞抑制率的計(jì)算公式為：細(xì)胞抑制率％＝(對(duì)照組OD值-用藥組OD值)/對(duì)照細(xì)胞OD值×100％，用Bliss法求出半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)。

其次是c-Met小分子抑制劑化合物對(duì)c-Met酶抑制率的測(cè)試方法：

熒光偏振檢測(cè)c-Met激酶采用的是競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的原理：熒光標(biāo)記的磷酸化示蹤物和由c-Met激酶反應(yīng)產(chǎn)生的未標(biāo)記磷酸化產(chǎn)物會(huì)與抗絲氨酸抗體相互競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。在一個(gè)無(wú)磷酸化產(chǎn)物的反應(yīng)液混合物中，當(dāng)一部分熒光示蹤物與抗體結(jié)合時(shí)會(huì)導(dǎo)致較高的偏振值。但是，在包含有磷酸化產(chǎn)物的反應(yīng)液混合中，較少的示蹤物會(huì)結(jié)合到抗體上(熒光示蹤物被從抗體上替代下去)，發(fā)出的信號(hào)發(fā)生去偏振。因此，偏振的改變直接的與反應(yīng)中的c-Met激酶活性相關(guān)。

將目標(biāo)化合物和陽(yáng)性對(duì)照BMS-777607用二甲基亞砜(DMSO)溶解，稀釋至濃度為50μM。室溫下，取濃度為50μM的化合物樣品和陽(yáng)性對(duì)照各0.25μl，加入384孔板，并且每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)平行孔，然后向每個(gè)樣品孔板中分別加入的10μlSTK Substrate 3Working Solution、5μl c-Met Working Solution、10μl ATP Working Solution，輕微振蕩并搖勻數(shù)分鐘。由于孔中加入10μl ATP Working Solution后即開(kāi)始反應(yīng)，由此計(jì)時(shí)，室溫反應(yīng)1小時(shí)。一個(gè)小時(shí)后，向每個(gè)樣品孔中分別加入5μl STK Stop Mix、5μl STK Antibody Mix來(lái)終止反應(yīng)。加入完畢后，室溫放置四個(gè)小時(shí)，用酶標(biāo)儀熒光偏振檢測(cè)樣品的偏振值(在二十四小時(shí)內(nèi)檢測(cè)其信號(hào)都是有效的)，通過(guò)偏振值來(lái)計(jì)算化合物對(duì)酶的抑制率。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置四組對(duì)照，分別是Buffer Control Wells、Tracer Control Wells、No Enzyme Wells以及空白的二甲基亞砜對(duì)照。所得數(shù)據(jù)用于計(jì)算抑制率。

表1目標(biāo)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖以及c-Met激酶的IC₅₀(μM)

從表中數(shù)據(jù)可以看出，部分化合物具有較好的體外腫瘤抑制活性，對(duì)c-Met激酶的抑制活性能達(dá)到納摩爾級(jí)別，如化合物3，對(duì)三種腫瘤細(xì)胞株均顯示了中等到強(qiáng)的抑制活性，化合物3對(duì)腫瘤細(xì)胞株HepG2的抑制活性小于5μM，與陽(yáng)性對(duì)照紫杉醇和BMS-777607活性相當(dāng)，化合物1對(duì)EBC-1和HL60腫瘤株的增殖抑制活性也與陽(yáng)性對(duì)照相當(dāng)，因此，本專(zhuān)利所涉及的化合物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，可作為一類(lèi)結(jié)構(gòu)新穎的肝癌治療藥物。綜上所述，該類(lèi)化合物有較好的肝病治療及抗腫瘤應(yīng)用前景，因而具良好的商業(yè)價(jià)值。