本發(fā)明屬于新藥發(fā)現(xiàn)與創(chuàng)新藥物合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種N-甲基加替沙星醛縮氨基硫脲類衍生物，同時(shí)還涉及一種N-甲基加替沙星醛縮氨基硫脲類衍生物的制備方法，以及其在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

新藥創(chuàng)新起源于先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)，而基于優(yōu)勢(shì)藥效團(tuán)骨架的拼合構(gòu)建先導(dǎo)物分子是最經(jīng)濟(jì)和有效的策略。由醛或酮與氨基硫脲類構(gòu)建的縮氨基硫脲類衍生物因其與大分子或金屬離子易產(chǎn)生配合物或螯合作用而表現(xiàn)出廣泛的藥理活性備受關(guān)注。然而，構(gòu)建縮氨基硫脲分子的醛或酮多為常見的苯類或雜環(huán)芳香類的醛和酮，而對(duì)喹啉醛，尤其是氟喹啉酮醛類形成的縮氨基硫脲類目前尚未見報(bào)道。另一方面，喹啉優(yōu)勢(shì)藥效團(tuán)骨架不僅是重要天然產(chǎn)物生物堿，如奎寧和喜樹堿類的重要結(jié)構(gòu)單元，也是抗菌氟喹諾酮類藥物的藥效團(tuán)骨架。同時(shí)，氟喹諾酮類藥物因有親水性的哌嗪基存在而增大其水溶性，提高生物利用度。尤其是氟喹諾酮類藥物的作用靶點(diǎn)—拓?fù)洚悩?gòu)酶也是抗腫瘤藥物的重要作用靶點(diǎn)，可將其抗菌活性轉(zhuǎn)化為抗腫瘤活性。為此，將氟喹諾酮C-3羧基轉(zhuǎn)化為甲?；纬上鄳?yīng)的氟喹諾酮C-3醛，然后與氨基硫脲類縮合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)喹啉骨架與縮氨基硫脲藥效團(tuán)間的拼合，以期達(dá)到不同結(jié)構(gòu)藥效團(tuán)間的活性疊加，從中發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的氟喹諾酮候選化合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為此，本發(fā)明的目的是提供一種N-甲基加替沙星醛縮氨基硫脲類衍生物，具有抗腫瘤的作用和功效，同時(shí)提供了上述N-甲基加替沙星醛縮氨基硫脲類衍生物的制備方法。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種N-甲基加替沙星醛縮氨基硫脲類衍生物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如通式(I)所示：

其中，取代基R為H原子或1～5個(gè)碳原子的烴基或環(huán)丙基。該類化合物為以下的具體結(jié)構(gòu)的典型化合物：

本發(fā)明同時(shí)提供了一種N-甲基加替沙星醛縮氨基硫脲類衍生物的制備方法，以式(II)所示的加替沙星為原料制備而成，

所述N-甲基加替沙星醛縮氨基硫脲類衍生物的制備方法具體制備步驟如下：

1)將式(II)所示的加替沙星與甲酸和甲醛發(fā)生哌嗪的甲基化反應(yīng)制得式(III)所示N-甲基加替沙星；

2)將式(III)所示的N-甲基加替沙星與水合肼發(fā)生肼解反應(yīng)制得式(IV)所示N-甲基加替沙星酰肼；

3)將式(IV)所示N-甲基加替沙星酰肼化合物與鐵氰化鉀在氯仿的氨水堿性介質(zhì)中常溫反應(yīng)8～12小時(shí)，分出有機(jī)層，用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑，制得式(V)所示的N-甲基加替沙星C-3醛中間體粗品，直接用于下步反應(yīng)；

4)將式(V)所示的N-甲基加替沙星醛與式(VI)所示的肼基二硫代甲酸甲酯縮合，待反應(yīng)完全后經(jīng)處理可制得(VII)所示的N-甲基加替沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯；具體操作步驟可參考文獻(xiàn)(胡惟孝，等，縮氨基硫脲化合物的合成及其抗癌活性的研究，高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2001，22(12)：2014-2017)的制備方法；

5)將式(VII)所示的N-甲基加替沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯與胺類化合物在有機(jī)溶劑中發(fā)生親核取代反應(yīng)，或式(V)所示的N-甲基加替沙星C-3醛粗品與氨基硫脲在有機(jī)溶劑中進(jìn)行縮合反應(yīng)，待反應(yīng)完全后經(jīng)處理得目標(biāo)化合物如式(I)所示，其中，取代基R為H原子或1～5個(gè)碳原子的烴基或環(huán)丙基。

作為進(jìn)一步的改進(jìn)，制備式I所用的有機(jī)溶劑可選擇甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、異丁醇、正丁醇中的至少一種，其中優(yōu)選乙醇或正丁醇。

優(yōu)選的，所述步驟3)中式(IV)所示的N-甲基加替沙星酰肼與鐵氰化鉀的摩爾比為1:3.0～5.0。所述步驟5)中式(VII)所示的N-甲基加替沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯與胺類化合物的摩爾比為1:3.0～10.0；所述胺類化合物為脂肪胺或環(huán)丙胺。

所述的N-甲基加替沙星醛縮氨基硫脲類衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述抗腫瘤藥物為治療肝癌、胰腺癌或白血病藥物。

本發(fā)明的N-甲基加替沙星醛縮氨基硫脲類衍生物基于藥效團(tuán)的拼合理性藥物分子設(shè)計(jì)原理，將氟喹諾酮、亞胺席夫堿及硫脲等三種不同藥效團(tuán)間的有效組合，進(jìn)而設(shè)計(jì)了N-甲基加替沙星醛縮氨基硫脲類衍生物，實(shí)現(xiàn)了不同結(jié)構(gòu)藥效團(tuán)的互補(bǔ)和活性的疊加，從而達(dá)到了增效降毒的效果，可作為全新結(jié)構(gòu)的抗腫瘤藥物開發(fā)。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。式(III)所示N-甲基加替沙星的制備步驟如下：加替沙星(50.0g，133.0mmol)溶于85％甲酸(100mL)和37％的甲醛(20.0g，200.0mmol)混合溶劑中，攪拌回流反應(yīng)12小時(shí)。減壓蒸除溶劑，加水(1000mL)，用30％的氫氧化鈉溶液調(diào)pH 7.0，放置析出固體。濾集固體，干燥，用無水乙醇-DMF(V:V＝3：2)混合溶劑重結(jié)晶，得淡黃色結(jié)晶式(III)，產(chǎn)率87％，mp 172～174℃。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:15.64(brs,1H,COOH),8.76(s,1H,1H,2-H),7.78(d,1H,5-H),4.15(m,1H,CH),3.85(s,3H,OCH₃),3.38～2.56(m,7H,piperazine-H),2.34(s,3H,N-CH₃),1.36(d,3H,CH₃),1.22～1.06(m,4H,CH₂CH₂)；MS(m/z):Calcd.for C₂₀H₂₄FN₃O₄:389.43[M]⁺；Found:390[M+H]⁺。

式(IV)所示N-甲基加替沙星酰肼的制備步驟如下：N-甲基加替沙星(50.0g，129.0mmol)溶于85％水合肼(100mL)和無水乙醇(300mL)的混合溶劑中，攪拌回流反應(yīng)24小時(shí)。減壓蒸除溶劑，加無水乙醇(500mL)和活性炭(2.0g)，回流脫色1小時(shí)，熱過濾，放置析出固體。濾集固體，用無水乙醇洗滌，抽干溶劑，干燥，得淡黃色結(jié)晶式(IV)，產(chǎn)率74.6％，mp 175～177℃。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:11.42(s,1H,CONH),8.78(s,1H,1H,2-H),7.82(d,1H,5-H),4.57(s,2H,NH₂),4.17(m,1H,CH),3.86(s,3H,OCH₃),3.37～2.55(m,7H,piperazine-H),2.34(s,3H,N-CH₃),1.37(d,3H,CH₃),1.23～1.07(m,4H,CH₂CH₂)；MS(m/z):Calcd.for C₂₀H₂₆FN₅O₃:

403.46[M]⁺；Found:404[M+H]⁺。

式(V)所示的N-甲基加替沙星C-3醛中間體的制備步驟如下：N-甲基加替沙星酰肼(10.0g，25.0mmol)懸浮于氯仿(200毫升)與濃氨水(濃度為22～25％，20毫升)的混合溶劑中，常溫慢慢滴加鐵氰化鉀(38.0g，115.0mmol)的水(120毫升)溶液，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)8～10小時(shí)至原料消失(TLC檢測，V_氯仿：V_甲醇＝5:1)。分出有機(jī)層，用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑，得粗品式(V)所示的N-甲基加替沙星C-3醛中間體備用。

式(VI)所示的肼基二硫代甲酸甲酯的制備方法如下：水合肼與二硫化碳在堿性介質(zhì)中縮合后與硫酸二甲酯反應(yīng)制得式(VI)所示的肼基二硫代甲酸甲酯中間體；具體操作步驟可參考文獻(xiàn)(胡惟孝，等，縮氨基硫脲化合物的合成及其抗癌活性的研究，高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，2001，22(12)：2014-2017)的制備方法。

式(VII)所示N-甲基加替沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯的制備步驟如下：將式(V)所示的N-甲基加替沙星C-3醛粗品(10.0g)溶于無水乙醇(150毫升)中，加入肼基二硫代甲酸甲酯(8.0g)，回流反應(yīng)10小時(shí)，放置冷卻至室溫。濾集產(chǎn)生的固體，干燥。粗品用甲醇-氯仿(V/V＝3：1)重結(jié)晶，得淡黃色結(jié)晶式(VI)所示N-甲基加替沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯12.6g，mp 214～216℃。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：11.72(s,1H,CH＝N),8.88(s,1H，2-H)，8.52(s,1H,NH),7.87(d,1H,5-H),4.17(m,1H,CH),3.85(s,3H,OCH₃),3.36～2.57(m,7H,piperazine-H),2.33(s,3H,N-CH₃),2.12(s,3H,SCH₃),1.36～1.07(m,7H,CH₃and CH₂CH₂)；MS(m/z):Calcd.for C₂₀H₂₅FN₅O₂S₂:477.63[M]⁺；Found:478[M+H]⁺。

實(shí)施例1

1-環(huán)丙基-6-氟-7-(3,4-二甲基-哌嗪-1-基)-8-甲氧基-喹啉-4(1H)-酮-3-醛縮氨基硫脲(I-1)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

即式I中的R取代基為H原子。

該化合物的制備方法為：取式(V)所示N-甲基加替沙星醛粗品(1.0g)溶于無水乙醇(20毫升)，加入氨基硫脲(0.5g,5.5mmol)，回流反應(yīng)10小時(shí)，趁熱過濾，乙醇洗滌2次，蒸餾水洗滌2次，干燥，用DMF-乙醇(V:V＝5:3)混合溶劑重結(jié)晶，制得淡黃色結(jié)晶物式(I-1)，得產(chǎn)品0.53g，m.p.232～234℃。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ:11.78(s,1H,CH＝N),9.06(s,1H，2-H)，8.53(s,1H,NH),8.45(s,1H,NH₂),8.34(s,1H,NH₂),7.87(d,1H，5-H)，3.83(s,3H,OCH₃),4.15(m,1H,CH),3.36～2.55(mt,7H，piperazine-H)，2.33(s,3H，N-CH₃)，1.36～1.12(m,7H,CH₃and CH₂CH₂)；MS(m/z)：Calcd.for C₂₁H₂₇FN₆O₂S：446.55[M]⁺；Found：447[M+H]⁺。

實(shí)施例2

1-環(huán)丙基-6-氟-7-(3,4-二甲基-哌嗪-1-基)-8-甲氧基-喹啉-4(1H)-酮-3-醛縮4-甲氨基硫脲(I-2)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

即式I中的R為甲基。

該化合物的制備方法為：取式(VI)所示的N-甲基加替沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯(1.0g,2.1mmol)溶于無水正丁醇(20毫升)中，加入甲胺(0.53g,17.0mmol)后混合反應(yīng)物回流反應(yīng)12小時(shí)，趁熱過濾，固體依次用乙醇洗滌2次，蒸餾水洗滌2次，干燥，用DMF-乙醇(V:V＝1:5)混合溶劑重結(jié)晶，制得黃色結(jié)晶物式(I-2)產(chǎn)品0.40g，m.p.223～225℃。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ:11.76(s,1H,CH＝N),8.97(s,1H，2-H)，8.44(s,1H,NH),8.35(s,1H,NH),7.88(d,1H，5-H)，4.16(m,1H,CH),3.82(s,3H,OCH₃),3.53～3.36(m,7H，piperazine-H and CH₃)，2.57(m,3H，piperazine-H)，2.33(s,3H，N-CH₃)，1.38～1.05(m,7H,CH₃and CH₂CH₂)；MS(m/z)：Calcd.for C₂₂H₂₉FN₆O₂S：460.58[M]⁺；Found：461[M+H]⁺。

實(shí)施例3

1-環(huán)丙基-6-氟-7-(3,4-二甲基-哌嗪-1-基)-8-甲氧基-喹啉-4(1H)-酮-3-醛縮4-乙氨基硫脲(I-3)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

即式I中的R為乙基。

該化合物的制備方法為：取式(VI)所示的N-甲基加替沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯(1.0g,2.1mmol)溶于無水正丁醇(20毫升)中，加入乙胺(0.77g,17.0mmol)后混合反應(yīng)物回流反應(yīng)12小時(shí)，趁熱過濾，固體依次用乙醇洗滌2次，蒸餾水洗滌2次，干燥，用DMF-乙醇(V:V＝1:5)混合溶劑重結(jié)晶，制得黃色結(jié)晶物式(I-3)產(chǎn)品0.42g，m.p.225～227℃。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ:11.78(s,1H,CH＝N),8.93(s,1H，2-H)，8.44(s,1H,NH),8.37(s,1H,NH),7.88(d,1H，5-H)，4.17(m,1H,CH),3.82(s,3H,OCH₃),3.36～3.14(m,6H，piperazine-H and CH₂)，2.56(m,3H，piperazine-H)，2.33(s,3H，N-CH₃)，1.68～1.06(m,10H,2×CH₃and CH₂CH₂)；MS(m/z)：Calcd.for C₂₃H₃₁FN₆O₂S：474.60[M]⁺；Found：475[M+H]⁺。

實(shí)施例4

1-環(huán)丙基-6-氟-7-(3,4-二甲基-哌嗪-1-基)-8-甲氧基-喹啉-4(1H)-酮-3-醛縮4-異丙氨基硫脲(I-4)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

即式I中的R為異丙基。

該化合物的制備方法為：取式(VI)所示的N-甲基加替沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯(1.0g,2.1mmol)溶于無水正丁醇(20毫升)中，加入異丙胺(0.89g,15.0mmol)后混合反應(yīng)物回流反應(yīng)10小時(shí)，趁熱過濾，固體依次用乙醇洗滌2次，蒸餾水洗滌2次，干燥，用DMF-乙醇(V:V＝1:5)混合溶劑重結(jié)晶，制得黃色結(jié)晶物式(I-4)產(chǎn)品0.48g，m.p.216～218℃。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ:11.78(s,1H,CH＝N),8.90(s,1H，2-H)，8.45(s,1H,NH),8.37(s,1H,NH),7.88(d,1H，5-H)，4.15(m,1H,CH),3.82(s,3H,OCH₃),3.36～3.22(m,5H，piperazine-H and CH)，2.56～2.45(m,3H，piperazine-H)，2.33(s,3H，N-CH₃)，1.36～1.03(m,13H，3×CH₃and CH₂CH₂)；MS(m/z)：Calcd.for C₂₄H₃₃FN₆O₂S：488.63[M]⁺；Found：489[M+H]⁺。

實(shí)施例5

1-環(huán)丙基-6-氟-7-(3,4-二甲基-哌嗪-1-基)-8-甲氧基-喹啉-4(1H)-酮-3-醛縮4-環(huán)丙氨基硫脲(I-5)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

即式I中的R為環(huán)丙基。

該化合物的制備方法為：取式(VI)所示的N-甲基加替沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯(1.0g,2.1mmol)溶于無水正丁醇(20毫升)中，加入環(huán)丙胺(0.91g,16.0mmol)后混合反應(yīng)物回流反應(yīng)12小時(shí)，趁熱過濾，固體依次用乙醇洗滌2次，蒸餾水洗滌2次，干燥，用DMF-乙醇(V:V＝1:5)混合溶劑重結(jié)晶，制得黃色結(jié)晶物式(I-5)產(chǎn)品0.32g，m.p.231～233℃。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ:11.78(s,1H,CH＝N),8.92(s,1H，2-H)，8.54(s,1H,NH),8.46(s,1H,NH),7.88(d,1H，5-H)，4.18(m,1H,CH),3.84(s,3H,OCH₃),3.52～3.35(m,5H，piperazine-H and CH)，2.57(m,3H，piperazine-H)，2.33(s,3H，N-CH₃)，1.36～0.76(m,11H，CH₃and 2×CH₂CH₂)；MS(m/z)：Calcd.for C₂₄H₃₁F₂N₆O₂S：486.62[M]⁺；Found：487[M+H]⁺。

實(shí)施例6

1-環(huán)丙基-6-氟-7-(3,4-二甲基-哌嗪-1-基)-8-甲氧基-喹啉-4(1H)-酮-3-醛縮4-叔丁氨基硫脲(I-6)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

即式I中的R為叔丁基。

該化合物的制備方法為：取式(VI)所示的N-甲基加替沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯(1.0g,2.1mmol)溶于無水正丁醇(20毫升)中，加入叔丁胺(0.88g,12.0mmol)后混合反應(yīng)物回流反應(yīng)10小時(shí)，趁熱過濾，固體依次用乙醇洗滌2次，蒸餾水洗滌2次，干燥，用DMF-乙醇(V:V＝1:5)混合溶劑重結(jié)晶，制得黃色結(jié)晶物式(I-6)產(chǎn)品0.57g，m.p.225～227℃。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ:11.77(s,1H,CH＝N),8.89(s,1H，2-H)，8.46(s,1H,NH),8.38(s,1H,NH),7.88(d,1H，5-H)，4.16(m,1H,CH),3.81(s,3H,OCH₃),3.37(m,4H，piperazine-H)，2.55(m,3H，piperazine-H)，2.33(s,3H，N-CH₃)，1.36～1.03(m,16H，4×CH₃and CH₂CH₂)；MS(m/z)：Calcd.for C₂₅H₃₅FN₆O₂S：502.66[M]⁺；Found：503[M+H]⁺。

實(shí)施例7

1-環(huán)丙基-6-氟-7-(3,4-二甲基-哌嗪-1-基)-8-甲氧基-喹啉-4(1H)-酮-3-醛縮4-正丁基氨基硫脲(I-7)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

即式I中的R為正丁基。

該化合物的制備方法為：取式(VI)所示的N-甲基加替沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯(1.0g,2.1mmol)溶于無水正丁醇(20毫升)中，加入正丁胺(0.88g,12.0mmol)后混合反應(yīng)物回流反應(yīng)10小時(shí)，趁熱過濾，固體依次用乙醇洗滌2次，蒸餾水洗滌2次，干燥，用DMF-乙醇(V:V＝1:5)混合溶劑重結(jié)晶，制得黃色結(jié)晶物式(I-7)產(chǎn)品0.63g，m.p.214～216℃。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ:11.77(s,1H,CH＝N),8.88(s,1H，2-H)，8.45(s,1H,NH),8.36(s,1H,NH),7.88(d,1H，5-H)，4.16(m,1H,CH),3.80(s,3H,OCH₃),3.36～3.23(m,6H，piperazine-H and CH₂)，2.53(m,3H，piperazine-H)，2.33(s,3H，N-CH₃)，1.37～0.72(m,14H，CH₃and CH₂CH₂and CH₂CH₂CH₃)；MS(m/z)：Calcd.for C₂₅H₃₅FN₆O₂S：502.66[M]⁺；Found：503[M+H]⁺。

實(shí)施例8

1-環(huán)丙基-6-氟-7-(3,4-二甲基-哌嗪-1-基)-8-甲氧基-喹啉-4(1H)-酮-3-醛縮4-正戊基氨基硫脲(I-8)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

即式I中的R為正戊基。

該化合物的制備方法為：取式(VI)所示的N-甲基加替沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯(1.0g,2.1mmol)溶于無水正丁醇(20毫升)中，加入正戊胺(0.87g,10.0mmol)后混合反應(yīng)物回流反應(yīng)10小時(shí)，趁熱過濾，固體依次用乙醇洗滌2次，蒸餾水洗滌2次，干燥，用DMF-乙醇(V:V＝1:5)混合溶劑重結(jié)晶，制得黃色結(jié)晶物式(I-8)產(chǎn)品0.73g，m.p.210～212℃。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ:11.76(s,1H,CH＝N),8.88(s,1H，2-H)，8.45(s,1H,NH),8.35(s,1H,NH),7.88(d,1H，5-H)，4.16(m,1H,CH),3.80(s,3H,OCH₃),3.36～3.07(m,6H，piperazine-H and CH₂)，2.55(m,3H，piperazine-H)，2.33(s,3H，N-CH₃)，1.36～0.67(m,16H，CH₃and CH₂CH₂and CH₂CH₂CH₂CH₃)；MS(m/z)：Calcd.for C₂₆H₃₇FN₆O₂S：516.69[M]⁺；Found：517[M+H]⁺。

試驗(yàn)例

一、實(shí)施例1-8提供的N-甲基加替沙星醛縮氨基硫脲類衍生物的體外抗腫瘤活性測定

1、供試樣品

以實(shí)施例1-8提供的N-甲基加替沙星醛縮氨基硫脲類衍生物，及經(jīng)典抗腫瘤TOPO抑制劑10-羥基喜樹堿(HC)和加替沙星(GF)為供試樣品，共10種，其中HC和GF為對(duì)照組，實(shí)施例1-8樣品為實(shí)驗(yàn)組；

實(shí)驗(yàn)癌細(xì)胞株分別為人肝癌Hep-3B細(xì)胞、人胰腺癌Panc-1細(xì)胞和人白血病HL60細(xì)胞株均購買自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。正常細(xì)胞采用VERO非洲綠猴腎細(xì)胞，購買于上海通派生物科技有限公司。

2、測定方法

測定方法的具體步驟為：

1)首先將上述10種供試樣品分別用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配制成1.0×10^-2mol·L^-1濃度的儲(chǔ)備液，之后用質(zhì)量百分比濃度為10％的小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將儲(chǔ)備液稀釋成具有5個(gè)濃度梯度(0.1、1.0、5.0、10.0、50.0μmol·L^-1)的工作液；

2)取對(duì)數(shù)生長期的人肝癌Hep-3B細(xì)胞、人胰腺癌Panc-1細(xì)胞和人白血病HL60細(xì)胞及VERO細(xì)胞株，以每孔6000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，隨后分別加入上述10種樣品的具有5個(gè)濃度梯度的工作液。培養(yǎng)48小時(shí)后每孔加入5g·L–¹MTT(噻唑藍(lán))溶液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后加入100μL質(zhì)量百分比濃度為10％的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液再培養(yǎng)24小時(shí)，然后用酶標(biāo)儀在570nm波長處測定各自的吸光度(OD)值；

3)按下述所示公式計(jì)算不同濃度的供試樣品對(duì)癌細(xì)胞的抑制率，

癌細(xì)胞抑制率＝[(1－實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值]×100％，

然后以供試樣品的各濃度的對(duì)數(shù)值對(duì)各濃度對(duì)應(yīng)的癌細(xì)胞抑制率作線性回歸，得到劑量-效應(yīng)方程，從所得劑量-效應(yīng)方程計(jì)算出各供試樣品對(duì)實(shí)驗(yàn)癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)；每個(gè)數(shù)據(jù)平行測定三次，求其平均值，結(jié)果見表1所示。

表1各供試樣品的抗腫瘤活性(IC₅₀)

從表1的初步體外抗腫瘤活性篩選結(jié)果可以看出，實(shí)施例1-8提供的化合物對(duì)3種實(shí)驗(yàn)癌細(xì)胞的生長抑制活性顯著強(qiáng)于母體化合物加替沙星(GF)的活性，尤其是較小取代基或環(huán)丙基取代的化合物對(duì)人胰腺癌Panc-1細(xì)胞的活性相當(dāng)于對(duì)照羥喜樹堿的抗腫瘤活性，其IC₅₀值已達(dá)到微摩爾濃度。更有意義的是，實(shí)施例1-8提供的化合物正常對(duì)VERO細(xì)胞表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性，表明對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的選擇性，提示該類化合物具有成藥性開發(fā)的潛力和進(jìn)一步新藥開發(fā)研究的價(jià)值。因此，按照藥物開發(fā)的一般途徑是先進(jìn)行常規(guī)的抗腫瘤體外篩選，然后進(jìn)行針對(duì)性的研究，所以本發(fā)明的化合物具有強(qiáng)的抗腫瘤活性和較低的毒性，可通過與人體可接受的酸成鹽或與藥用載體混合制備抗腫瘤藥物。