本發(fā)明涉及微生物
技術領域：
，尤其涉及一種解淀粉芽孢桿菌菌株、菌劑及菌劑的制備方法。
背景技術：
：隨著人們肉食結構的改變和生活水平的不斷提高，牛肉越來越受到消費者的青睞，而牛肉的嫩度是影響消費者評定牛肉質量最重要的一個因素，所以肉類嫩化的相關研究逐漸成為人們關注的熱點之一。在中國部分役用牛、水牛和山區(qū)放養(yǎng)的老齡黃牛也被適時地作為肉用，這類牛肉的質構特性相對較差，但對中國肉食結構的改善是重要的補充。特別是在欠發(fā)達地區(qū)和中檔以下的餐廳具有較大的市場，所以采取科學、有效、安全的技術措施，改善這類牛肉的品質，具有重要的現(xiàn)實意義。牛肉嫩度主要受宰前和宰后因素的影響，宰前因素主要包括牛的種類、性別、年齡、肌肉部位和營養(yǎng)狀況等，不同品種的牛，生產出的牛肉的嫩度也不一致。牛的年齡越大，牛肉的肌原纖維就會變得越粗，肉質就會越老。肌肉的部位不同，其嫩度也會有差異，其中背最長肌的嫩度就沒有腰大肌的好。宰后因素主要是采用所特定的技術手段來破壞肌原纖維結構、使結締組織性質發(fā)生改變，從而來改善牛肉的嫩度。目前國內外對宰后嫩化的研究比較多，主要包括物理嫩化法、化學嫩化法、酶嫩化法等。物理嫩化法主要有高壓嫩化法，高壓嫩化法具有效果明顯、作用均一的優(yōu)點，不會增加微生物污染的機會，還可以起到殺菌的效果；有機酸、氯化鈣、磷酸鹽對改善牛肉的嫩度也有一定的影響；酶法嫩化是最近研究的熱點，使用方便，效果顯著，該方法主要的酶是蛋白酶，從植物提取和微生物培養(yǎng)，植物中提取的主要有木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶和菠蘿蛋白酶，可降解肌原纖維，從而提高肉的嫩度，但是這類蛋白酶由于受到原料的限制，實際應用因成本問題有一定的困難。微生物源的蛋白酶對肉品嫩化效果不一，難以實現(xiàn)標準化控制。而隨著肉品加工業(yè)的不斷發(fā)展，特別是肉類中式菜肴的工業(yè)化生產，就希望有安全、高效、可控的優(yōu)質肉類嫩化劑來保障菜肴工業(yè)化生產過程中的標準化。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種解淀粉芽孢桿菌菌株，可以產蛋白酶，用于牛肉制品的嫩化效果明顯。本發(fā)明還提供了一種解淀粉芽孢桿菌菌劑，具有安全、可控等優(yōu)勢。本發(fā)明還提供了解淀粉芽孢桿菌菌劑的制備方法，方法簡單、可大規(guī)模生產。為解決上述技術問題，提供了一種解淀粉芽孢桿菌菌株，所述解淀粉芽孢桿菌菌株為解淀粉芽孢桿菌D7(Bacillusamyloliquefaciens)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏時間為：2016年11月10日，保藏編號為CGMCCNo.13250。作為一個總的技術構思，本發(fā)明還提供了一種解淀粉芽孢桿菌菌劑，所述解淀粉芽孢桿菌菌劑由上述的解淀粉芽孢桿菌菌株經活化、發(fā)酵培養(yǎng)制備得到。作為一個總的技術構思，本發(fā)明還提供了一種上述的解淀粉芽孢桿菌菌劑的制備方法，包括以下步驟：S1、將解淀粉芽孢桿菌菌株接種到肉湯培養(yǎng)基中活化得到活化液；S2、將所述活化液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)得到解淀粉芽孢桿菌菌劑。上述的制備方法，優(yōu)選的，所述S1步驟中，所述活化具體為：在37℃下，以220r/min搖床培養(yǎng)12h～14h。上述的制備方法，優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分包括：10～20g/L的葡萄糖、10～20g/L的酵母浸出汁、1～3g/L的NaCl、2g/L的CaCl、5g/L的磷酸氫二鉀、1.25g/L的磷酸二氫鉀、0.01g/L的硫酸鎂、0.001g/L的硫酸鐵；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7.0～7.66。上述的制備方法，優(yōu)選的，所述S2步驟中，所述活化液的接種量為3％。上述的制備方法，優(yōu)選的，所述S2步驟中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的具體過程為：在30℃～37℃下以220r/min轉速搖床培養(yǎng)47h～49.2h。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：(1)本發(fā)明提供了一種解淀粉芽孢桿菌D7，該菌株分離自貴州傳統(tǒng)豆豉和甜酒曲中，可產生透明圈，這就說明此菌株具有產蛋白酶的能力，對牛肉能花效果明顯，具有較高的食用安全性。(2)本發(fā)明提供了一種解淀粉芽孢桿菌劑，有較大的潛力開發(fā)成商業(yè)化的食品嫩化劑，將牛肉制品浸漬于該菌劑中，在水浴鍋27℃酶解50min后，測定其質構特性，其硬度值相對于浸泡在水中顯著下降。(3)本發(fā)明提供了一種解淀粉芽孢桿菌菌劑的制備方法，制備方法簡單，條件可控，適用于工業(yè)化生產。解淀粉芽孢桿菌D7(Bacillusamyloliquefaciens)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.13250，保藏日期：2016年11月10日；保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。附圖說明為使本發(fā)明實施例的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整的描述。圖1為實施例1的解淀粉芽孢桿菌菌株電子顯微鏡下的革蘭氏染色特征圖。圖2為實施例1的解淀粉芽孢桿菌菌株平板培養(yǎng)菌落圖以及斜面特征圖。具體實施方式以下結合說明書附圖和具體優(yōu)選的實施例對本發(fā)明作進一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護范圍。實施例以下實施例中所采用的材料和儀器均為市售。其中解淀粉芽孢桿菌D7(Bacillusamyloliquefaciens)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.13250，保藏日期：2016年11月10日；保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。實施例1：一種解淀粉芽孢桿菌菌株，發(fā)明人從貴州傳統(tǒng)豆豉和甜酒曲中分離得到。對該菌進行形態(tài)特征的研究后，將其作用于牛肉制品中，顯示出該菌株作為肉品專用嫩化劑的優(yōu)勢，有較大的潛力開發(fā)成商業(yè)化的食品嫩化劑。產蛋白酶的細菌22株，從中篩選出1株酶活較高的菌株，命名為解淀粉芽孢桿菌D7，酶活達71.68U/g。解淀粉芽孢桿菌D7，在分離培養(yǎng)基上，菌株D7呈白色，光滑濕潤菌落，稍隆起，菌落中間有褶皺，為有芽孢革蘭氏陽性桿菌，圖1為解淀粉芽孢桿菌菌株電子顯微鏡下的革蘭氏染色特征圖。解淀粉芽孢桿菌D7在斜面上呈薄膜狀，表面白色。該菌株具有產蛋白酶的能力，對牛肉制品的嫩度有一定的影響，且周邊會產生清晰可見的透明圈，取解淀粉芽孢桿菌D7，用分離培養(yǎng)基，對解淀粉芽孢桿菌進行純培養(yǎng)，37℃生化培養(yǎng)基箱培養(yǎng)24h，菌落周邊清晰可見透明圈，菌落圖參見圖2。而后將其進行斜面(分離培養(yǎng)基)保存。分離培養(yǎng)基配方：蛋白胨：10g、葡萄糖：1g、NaCl：5g、CaCl：0.1g、L-酪氨酸：0.1g、瓊脂：15g、干酪素：5g、蒸餾水：1000mL；pH值：7.2～7.4。實施例2一種解淀粉芽孢桿菌菌劑，采用以下制備方法制備得到：(1)挑取實施例1斜面培養(yǎng)基中解淀粉芽孢桿菌菌株，接種到肉湯培養(yǎng)基中，在37℃下，以220r/min搖床培養(yǎng)12h，活化得到活化液。(2)將活化液按照接種量為3％接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃下以220r/min搖床培養(yǎng)48h，得到解淀粉芽孢桿菌菌劑。發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖：16.8g、酵母浸出汁：20g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氫二鉀：5g、磷酸二氫鉀：1.25g、硫酸鎂：0.01g、硫酸鐵：0.001g、蒸餾水：1000mL、pH值：7.66。將實施例2的解淀粉芽孢桿菌菌劑應用于牛肉嫩化，具體步驟為：將牛肉浸漬于發(fā)酵液中30min、50min、70min、90min、110min后，測定其硬度值，其結果見下表1。表1：不同時間點解淀粉芽孢桿菌菌劑對牛肉嫩化效果組別0min30min50min硬度15159.24±476.92a13212.39±619.1b9920.63±453.48d組別70min90min110min硬度10872.49±197.98cd12745.5±622.5bc13445.28±264.99b表1中a、b、c、d表示差異顯著(p<0.05)。從表1的結果可知：將牛肉浸泡在實施例2的解淀粉芽孢桿菌菌劑中，當浸泡時間在50min以后，其牛肉的嫩化效果明顯，相比于不浸泡的牛肉，其硬度降低了34.6％。實施例3一種解淀粉芽孢桿菌菌劑的制備方法，包括以下步驟：(1)從貴州傳統(tǒng)豆豉和甜酒曲中分離解淀粉芽孢桿菌。該菌株呈白色，光滑濕潤菌落，稍隆起，菌落中間有褶皺，為有芽孢革蘭氏陽性桿菌，且周邊會產生清晰可見的透明圈。在斜面上呈薄膜狀，表面白色。(2)將菌株用分離培養(yǎng)基進行純培養(yǎng)，37℃生化培養(yǎng)基箱培養(yǎng)24h，而后將其進行斜面保存。分離培養(yǎng)基配方：蛋白胨：10g、葡萄糖：1g、NaCl：5g、CaCl：0.1g、L-酪氨酸：0.1g、瓊脂：15g、干酪素：5g、蒸餾水：1000mL；pH值：7.2～7.4。(3)挑取斜面培養(yǎng)基中解淀粉芽孢桿菌菌株，接種到肉湯培養(yǎng)基中，在37℃下，以220r/min搖床培養(yǎng)12h，活化得到活化液。(4)將活化液按照接種量為3％接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃下以220r/min搖床培養(yǎng)48h，使酶活達到101.26U/g。發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖：20g、酵母浸出汁：10g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氫二鉀：5g、磷酸二氫鉀：1.25g、硫酸鎂：0.01g、硫酸鐵：0.001g、蒸餾水：1000mL、pH值：7.0。實施例4一種解淀粉芽孢桿菌菌劑的制備方法，其中發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖：10g、酵母浸出汁：15g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氫二鉀：5g、磷酸二氫鉀：1.25g、硫酸鎂：0.01g、硫酸鐵：0.001g、蒸餾水：1000mL、pH值：7.0。其余步驟與實施例3相同，培養(yǎng)后的發(fā)酵液酶活為108.29U/g。實施例5一種解淀粉芽孢桿菌菌劑的制備方法，其中發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖：20g、酵母浸出汁：10g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氫二鉀：5g、磷酸二氫鉀：1.25g、硫酸鎂：0.01g、硫酸鐵：0.001g、蒸餾水：1000mL、pH值：7.5。其余步驟與實施例3相同，培養(yǎng)后的發(fā)酵液酶活為93.21U/g。實施例6一種解淀粉芽孢桿菌菌劑的制備方法，其中發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖：16.8g、酵母浸出汁：20g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氫二鉀：5g、磷酸二氫鉀：1.25g、硫酸鎂：0.01g、硫酸鐵：0.001g、蒸餾水：1000mL、pH值：7.66。其余步驟與實施例3相同，培養(yǎng)后的發(fā)酵液酶活為111.96U/g。分別將牛肉浸泡在實施例3～6的解淀粉芽孢桿菌菌劑中，并以蒸餾水作為對比，測定牛肉的硬度值，測定結果參見表1。表1：不同培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的解淀粉芽孢桿菌菌劑對牛肉硬度值的影響組別蒸餾水組實施例3實施例4實施例5實施例6硬度12392.6±651.18712.0±143.28380.3±186.88848.2±700.77537.0±339.86從表1的結果可知：實施例3至6的解淀粉芽孢桿菌菌劑可顯著降低牛肉的硬度，其中實施例3中牛肉的硬度相對于蒸餾水組下降了29.7％、實施例4下降了32.4％、實施例5下降了28.6％、實施例6下降了38.8％。實施例7一種解淀粉芽孢桿菌菌劑的制備方法，包括以下步驟：(1)挑取實施例1斜面培養(yǎng)基中解淀粉芽孢桿菌菌株，接種到肉湯培養(yǎng)基中，在37℃下，以220r/min搖床培養(yǎng)12h，活化得到活化液。(2)將活化液按照接種量為3％接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中得到混合液，取50mL上述混合液于250mL的錐形瓶中(即裝液量為50mL)，在31℃下以220r/min搖床培養(yǎng)48h得到解淀粉芽孢桿菌菌劑。該解淀粉芽孢桿菌菌劑的酶活達到100.72U/g。發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖：20g、酵母浸出汁：10g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氫二鉀：5g、磷酸二氫鉀：1.25g、硫酸鎂：0.01g、硫酸鐵：0.001g、蒸餾水：1000mL、pH值：7.0。實施例8一種解淀粉芽孢桿菌菌劑的制備方法，其中步驟(2)的搖床培養(yǎng)條件是：接種量3％、轉速220r/min、裝液量50mL、時間48h、溫度37℃，其余步驟與實施例7一致。培養(yǎng)后的發(fā)酵液酶活為88.34U/g。實施例9一種解淀粉芽孢桿菌菌劑的制備方法，其中步驟(2)的搖床培養(yǎng)條件是：接種量3％、轉速220r/min、裝液量70mL、時間48h、溫度37℃，其余步驟與實施例7一致。培養(yǎng)后的發(fā)酵液酶活為89.7U/g。實施例10一種解淀粉芽孢桿菌菌劑的制備方法，其中步驟(2)的搖床培養(yǎng)條件是：接種量3％、轉速220r/min、裝液量71.3mL、時間49.2h、溫度30.8℃，其余步驟與實施例7一致。培養(yǎng)后的發(fā)酵液酶活為125.55U/g。分別牛肉浸泡在實施例7～10的解淀粉芽孢桿菌菌劑中，并以蒸餾水作為對比，測定牛肉的硬度值，測定結果參見表2。表2：不同培養(yǎng)條件得到的解淀粉芽孢桿菌菌劑對牛肉硬度值的影響組別蒸餾水組實施例7實施例8實施例9實施例10硬度13209.7±142.99058.7±121.69501.6±736.49091.4±199.57299.83±522.1從表2的結果可知：實施例7至10的解淀粉芽孢桿菌菌劑可顯著降低牛肉的硬度，其中實施例7中牛肉的硬度相對于蒸餾水組下降了31.4％、實施例8下降了28.1％、實施例9下降了31.2％、實施例10下降了45.9％。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制。雖然本發(fā)明已以較佳實施例揭示如上，然而并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉本領域的技術人員，在不脫離本發(fā)明的精神實質和技術方案的情況下，都可利用上述揭示的方法和技術內容對本發(fā)明技術方案做出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實施例。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術方案的內容，依據(jù)本發(fā)明的技術實質對以上實施例所做的任何簡單修改、等同替換、等效變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術方案保護的范圍內。當前第1頁1 2 3