本發(fā)明涉及一株拮抗枸杞根腐病的萎縮芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

枸杞是一種名貴的中藥，枸杞果實(shí)有較高的營(yíng)養(yǎng)保健和藥用價(jià)值，與瓊珍靈芝、長(zhǎng)白山人參，東阿阿膠并稱為“中藥四寶”。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和社會(huì)的進(jìn)步，人們也越來越認(rèn)識(shí)到枸杞的價(jià)值，促使人們對(duì)枸杞進(jìn)行了廣泛的產(chǎn)品開發(fā)，并取得了重要成果。寧夏枸杞在中國(guó)栽培面積最大，隨著枸杞種植面積不斷擴(kuò)大，老產(chǎn)區(qū)與新產(chǎn)區(qū)枸杞根腐病發(fā)病率連年上升，日益嚴(yán)重，已經(jīng)嚴(yán)重影響到了當(dāng)?shù)剞r(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入，對(duì)整個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈有一定的破壞作用。枸杞根腐病是一種系統(tǒng)感染病害，病株根和根頸部發(fā)生腐爛，莖桿維管束變褐色。潮濕時(shí)病部偶爾長(zhǎng)出白色或粉紅色霉層(病原菌)。由于根腐，葉片變小，缺少光澤，枝條矮化，果實(shí)瘦小；或葉片變黃萎蔫，嚴(yán)重時(shí)植株逐漸枯死。目前人們防治枸杞根腐病主要是噴灑農(nóng)藥，配方施肥，增施磷鉀肥的方式。但這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，很難從根源上有效防治病害的發(fā)生，而且對(duì)環(huán)境污染大，對(duì)人體健康也有一定的傷害，而生物防治方法因其具有專一性和綠色環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，越來越受到人們的關(guān)注。應(yīng)用比較成熟的有芽孢桿菌對(duì)于棉花枯萎病、馬鈴薯瘡痂病、蘋果紅癌病、小麥根腐病等多種植物病害的生防作用，但還沒有枸杞根腐病生物防治方面的報(bào)道，而找到拮抗枸杞根腐病的菌種資源是關(guān)鍵。

萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)是枯草芽孢桿菌的一類變種，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、科研、醫(yī)療和衛(wèi)生領(lǐng)域等都有廣泛的應(yīng)用。在美國(guó)、日本、歐盟等國(guó)家和地區(qū)常將該菌株作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)菌株及殺菌效果評(píng)價(jià)試驗(yàn)指示菌。但該菌應(yīng)用于防治植物病害方面的報(bào)道較少，所涉及的研究主要有：防治苦瓜灰霉病(CN105670964A)、防治馬鈴薯甲蟲幼蟲(CN104164378A)、防治棉鈴疫病(CN102747005A)、防治番茄立枯病、辣椒早疫病、棉花立枯病(CN104531545A)等，但目前還未有防治枸杞根腐病的萎縮芽孢桿菌的報(bào)道。而且，生防微生物與土壤環(huán)境中的微生物群落之間往往存在相互作用，外源拮抗菌的引入可以引起作物根際土壤微生物群落的組成發(fā)生變化，不同植物根際同種細(xì)菌的定植和功能具有較大差異性；而且，生防微生物在土壤環(huán)境中能否存活并且快速生長(zhǎng)也是實(shí)現(xiàn)防治作用的關(guān)鍵。因此，篩選能夠?qū)﹁坭礁【哂蟹乐巫饔玫纳谰昃哂惺种匾膶?shí)際應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一株拮抗枸杞根腐病的萎縮芽孢桿菌及其應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一株拮抗枸杞根腐病的萎縮芽孢桿菌，其分類命名為萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)GQJK17，已于2016年11月10日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO.13254。

該菌株是從枸杞根際土壤中分離得到，該菌株的菌落及菌體特征為：在LB平板上培養(yǎng)24h后菌落呈近圓形，乳白色，菌落扁平狀，邊緣小齒狀，表面干燥，菌落直徑為2.62mm。菌體呈長(zhǎng)桿狀，產(chǎn)芽孢，革蘭氏陽(yáng)性。

該菌株的生理生化特征為：氧化酶實(shí)驗(yàn)陰性，接觸酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，硝酸鹽利用實(shí)驗(yàn)陰性，淀粉水解實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，M-R實(shí)驗(yàn)陰性，V-P實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，蔗糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，麥芽糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陰性，阿拉伯糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，木糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陰性，纖維二糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陰性，乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陰性，山梨醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，甘露醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種生防制劑，其活性成分為上述萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)GQJK17的發(fā)酵產(chǎn)物。

優(yōu)選的，所述生防制劑為液態(tài)菌劑。

進(jìn)一步的，所述生防制劑中萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)GQJK17的含量大于或等于2×10⁸cfu/mL。

本發(fā)明還提供上述生防制劑的制備方法，包括如下步驟：發(fā)酵上述的萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)GQJK17，得到發(fā)酵產(chǎn)物。

上述制備方法中，發(fā)酵采用的培養(yǎng)基為液體豆芽汁培養(yǎng)基，其原料組成為：黃豆芽100g，蔗糖50g，水1000mL，pH自然；

所述液體豆芽汁培養(yǎng)基的制備方法為：黃豆芽沸水蒸煮30min，用四層紗布過濾，加入蔗糖定容到1000mL。

上述制備方法中，發(fā)酵的條件為：35-40℃，恒溫?fù)u床培養(yǎng)20-30h；優(yōu)選為，37℃，恒溫?fù)u床培養(yǎng)24h。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供上述萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)GQJK17和/或生防制劑在防治枸杞根腐病中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述防治枸杞根腐病體現(xiàn)在抑制枸杞根腐病的發(fā)作，降低發(fā)病率。

根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供上述萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)GQJK17和/或生防制劑在促進(jìn)枸杞增產(chǎn)中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種能防治枸杞根腐病，同時(shí)增產(chǎn)的產(chǎn)品，其活性成分為上述的萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)GQJK17或上述生防制劑。

本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明分離得到的萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)GQJK17，該菌株對(duì)枸杞根腐病具有較強(qiáng)拮抗作用，為枸杞根腐病的生物防治提供了新的生防菌，增加了生防制劑的種類。

(2)研究表明，在大田條件下，采用本發(fā)明的萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)GQJK17的菌懸液對(duì)枸杞根腐病發(fā)病嚴(yán)重的地塊的枸杞樹進(jìn)行灌根處理后，能明顯抑制枸杞根腐病的發(fā)作，降低發(fā)病率；本發(fā)明的萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)GQJK17還能改善植株的生長(zhǎng)狀況，提高枸杞的產(chǎn)量，對(duì)枸杞樹平均增產(chǎn)在484％以上。以上研究結(jié)果表明，本發(fā)明的拮抗枸杞根腐病的芽孢桿菌對(duì)寧夏枸杞根腐病具有一定的防治效果。

(3)不同植物的根腐病，其病原菌不同，發(fā)病機(jī)理也會(huì)存在差異。對(duì)其他植物的根腐病有防治效果的芽孢桿菌，并不能直接推知其對(duì)枸杞根腐病有防治效果。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，在平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)中對(duì)植物病原菌有拮抗效果的菌株，但并不能保證其在大田實(shí)驗(yàn)中的效果。大田實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也證明，擁有較好的平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)結(jié)果的菌株，在大田實(shí)驗(yàn)中，對(duì)枸杞根腐病病原菌也未必?fù)碛忻黠@的抑制效果。因此，對(duì)其他植物的根腐病有防治效果的芽孢桿菌而言，由于寧夏地區(qū)惡劣的生存環(huán)境，菌株能否存活并且快速生長(zhǎng)成為關(guān)鍵問題，因此未必對(duì)枸杞根腐病有防治效果。

附圖說明

圖1：萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)GQJK17的菌落形態(tài)圖；

圖2：萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)GQJK17的系統(tǒng)進(jìn)化樹圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)方法等。

實(shí)施例1：菌株的分離、篩選

(1)菌種的分離

從寧夏省中寧縣石啦叭村采集健康、垂死、已死枸杞樹根際土壤樣品5個(gè)。稱取10.0克枸杞根際土，按每10克土加90mL無菌水的比例放入事先準(zhǔn)備好的裝有玻璃珠的三角瓶中，置于37℃恒溫?fù)u床上180rpm震蕩20-30min。梯度稀釋法，將土壤懸液稀釋成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6等不同梯度。吸取合適稀釋度的土壤溶液0.1mL置于LB平板培養(yǎng)基中，涂布均勻(本實(shí)驗(yàn)選取10^-4、10^-5、10^-6三個(gè)梯度進(jìn)行涂布)。37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，挑取單菌落。將獲取的菌株用三區(qū)劃線的方法進(jìn)行純化，直至獲得單一菌落，并對(duì)菌株進(jìn)行編號(hào)，保存于4℃冰箱備用。

(2)拮抗菌的篩選

利用平板對(duì)峙法對(duì)拮抗菌進(jìn)行初選。將保存的菌株活化，備用。將保存在斜面上的枸杞根腐病病原菌采用劃線方法活化于PDA平板，28℃培養(yǎng)至長(zhǎng)滿平板，用滅菌的藍(lán)槍頭或打孔器豎直切下上述病原菌菌塊，用鑷子轉(zhuǎn)接到PDA平板的中間部位，置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)一天。用牙簽挑取活化好的拮抗菌接種到距病原菌邊緣2cm處，置于28℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2-5天，觀察是否有抑菌帶的出現(xiàn)，測(cè)量抑菌帶的寬度。同時(shí)測(cè)量抑菌直徑，計(jì)算抑菌率。

抑菌率(％)＝(菌落直徑D-抑菌直徑d)/菌落直徑D×100％。

2.試驗(yàn)結(jié)果：

選擇一株抑菌效果最好的菌株，菌株編號(hào)為GQJK17，其平板對(duì)峙試驗(yàn)的結(jié)果見表1。

表1：抑菌率測(cè)定結(jié)果

由表1可以看出：菌株GQJK17對(duì)枸杞根腐病的病原菌具有較好的抑菌作用。

2.菌株GQJK17的形態(tài)及生理生化特征測(cè)定

(1)菌落特征及菌體形態(tài)

該菌株的菌落及菌體特征為：在LB平板上培養(yǎng)24h后菌落呈近圓形，乳白色，菌落扁平狀，邊緣小齒狀，表面干燥，菌落直徑為2.62mm。菌體呈長(zhǎng)桿狀，產(chǎn)芽孢，革蘭氏陽(yáng)性。

(2)生理生化特征

該菌株的生理生化特征為：氧化酶實(shí)驗(yàn)陰性，接觸酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，硝酸鹽利用實(shí)驗(yàn)陰性，淀粉水解實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，M-R實(shí)驗(yàn)陰性，V-P實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，蔗糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，麥芽糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陰性，阿拉伯糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，木糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陰性，纖維二糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陰性，乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陰性，山梨醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，甘露醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。

3.菌株GQJK17的16S rDNA測(cè)定與分析

菌株GQJK17的16S rDNA基因序列，如核苷酸序列表中SEQ ID NO.1所示。將所測(cè)16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列比對(duì)，結(jié)果表明：GQJK17與Bacillus atrophaeus(JCM 9070)同處于一個(gè)最小分支上，其16S rRNA基因序列與Bacillus atrophaeus(NBRC 15539)的菌株序列相似度為99％，結(jié)合上述生理生化特征結(jié)果，鑒定GQJK17為萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)。

該菌株GQJK17，分類命名為萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)GQJK17，已于2016年11月10日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO.13254。

實(shí)施例2：菌株GQJK17生防制劑的制備

具體制備方法如下：

將斜面保存的拮抗枸杞根腐病的萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)GQJK17轉(zhuǎn)接到裝有5mL豆芽汁液體培養(yǎng)基的試管中，放于37℃、180rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12h。然后按1％的接種量接種到100mL/250mL的液體豆芽汁培養(yǎng)基中，放于37℃、180rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24h，制成濃度為2×10⁸cfu/mL的菌懸液。

液體豆芽汁培養(yǎng)基，其原料組成為：黃豆芽100g，蔗糖50g，水1000mL，pH自然；

制備方法為：黃豆芽沸水蒸煮30min，用四層紗布過濾，加入蔗糖定容到1000mL。

實(shí)施例3：田間試驗(yàn)

1.試驗(yàn)方法：

選擇枸杞根腐病發(fā)病嚴(yán)重的地塊，設(shè)計(jì)兩個(gè)處理，分別為處理1：GQJK17菌液(實(shí)施例2制備)，每棵枸杞樹用量為25mL；處理2：用等量的清水作對(duì)照。

每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)選擇20棵枸杞樹。

具體試驗(yàn)方法：用清水將菌液稀釋200倍后對(duì)枸杞樹進(jìn)行灌根。對(duì)照用等量的清水灌根。

2.試驗(yàn)結(jié)果：

(1)菌株GQJK17對(duì)枸杞根腐病的防治效果

結(jié)果如表2所示。

表2：大田實(shí)驗(yàn)中枸杞樹發(fā)病統(tǒng)計(jì)結(jié)果

由表2可以看出：

①發(fā)病率：在大田試驗(yàn)中，對(duì)照的發(fā)病率為90％，用萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)GQJK17菌液處理的枸杞樹發(fā)病率為41.67％，與對(duì)照相比，用GQJK17處理的枸杞樹的發(fā)病率降低了48.33個(gè)百分點(diǎn)。

②相對(duì)防效：萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)GQJK17對(duì)枸杞根腐病的相對(duì)防效達(dá)63％。

(2)菌株GQJK17對(duì)枸杞樹的增產(chǎn)效果

結(jié)果見表3。

表3：萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)GQJK17對(duì)枸杞樹的增產(chǎn)效果

由表3可以看出：對(duì)照處理的枸杞樹平均產(chǎn)量為0.5kg/棵，用萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)GQJK17菌液處理的產(chǎn)量為2.92kg/棵，與對(duì)照相比，用GQJK17處理的枸杞樹平均增產(chǎn)484％。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一株拮抗枸杞根腐病的萎縮芽孢桿菌及其應(yīng)用

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1421

<212> DNA

<213> 菌株GQJK17

<400> 1

cttcggcggc tggctcataa aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg 60

tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga 120

ttactagcga ttccagcttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa ctgagaacag 180

atttgtggga ttggcttaac ctcgcggtct cgctgccctt tgttctgtcc attgtagcac 240

gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt 300

ttgtcaccgg cagtcacctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag atcaagggtt 360

gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc 420

acctgtcact ctgcccccga aggggaagcc ctatctctag gggtgtcaga ggatgtcaag 480

acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg 540

cccccgtcaa ttcctttgag tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg gagtgcttaa 600

tgcgttagct gcagcactaa ggggcggaaa ccccctaaca cttagcactc atcgtttacg 660

gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc ctcagcgtca 720

gttacagacc agagagtcgc cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta cgcatttcac 780

cgctacacgt ggaattccac tctcctcttc tgcactcaag ttccccagtt tccaatgacc 840

ctccccggtt gagccggggg ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc gagcccttta 900

cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag 960

ttagccgtgg ctttctggtt aggtaccgtc aaggtgccgc cctatttgaa cggcacttgt 1020

tcttccctaa caacagagct ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc ggcgttgctc 1080

cgtcagactt tcgtccattg cggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc 1140

cgtgtctcag tcccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat cgttgccttg 1200

gtgagccatt acctcaccaa ctagctaatg cgccgcgggt ccatctgtaa gtggtagccg 1260

aagccacctt ttatgtttga accatgcggt tcaaacaagc atccggtatt agccccggtt 1320

tcccggagtt atcccagtct tacaggcagg ttacccacgt gttactcacc cgtccgccgc 1380

taacatcagg gagcaagctc ccatctgtcc gctcgactgc a 1421