本發(fā)明涉及蛋白酶，還涉及產(chǎn)蛋白酶細菌及應用。

背景技術：

蛋白酶是催化蛋白質水解的一類酶，已成為目前應用最廣泛的酶類，也是目前需求量最大的酶類，廣泛存在于動物、植物及微生物中，約占所有蛋白質的2％，執(zhí)行著許多不同的功能，它在洗滌、皮革、銀洗、醫(yī)藥、食品、飼料、化工等方面廣為應用，約占酶制劑市場的60％。傳統(tǒng)動植物來源的蛋白酶具有生長周期長、生產(chǎn)成本高、不易于控制管理、易受土地和季節(jié)限制等缺點，微生物日益成為工業(yè)酶制劑的主要來源。而我國產(chǎn)蛋白酶微生物來源有限，目前國內(nèi)進入蛋白酶生產(chǎn)的微生物大多數(shù)來源于陸地或淡水環(huán)境，因而，尋找并開發(fā)海洋來源的產(chǎn)蛋白酶微生物資源，進一步掌握新型蛋白酶的相關特性具有重要的科研、應用以及商業(yè)價值。

地球表面的2/3以上由海洋沉積物覆蓋，這些沉積物里廣泛存在著大量的具有代謝活性的微生物，包括細菌和古菌。這些微生物將海洋中懸浮顆粒有機氮降解為高分子量的溶解有機氮，溶解有機氮再被分解、氨化(礦化)、硝化和反硝化，最終參與海底沉積物中氮循環(huán)，蛋白質是沉積物中顆粒有機氮和溶解有機氮的重要組成部分，因此產(chǎn)蛋白酶細菌在他們的降解過程中起著重要作用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種高效產(chǎn)蛋白酶細菌及其應用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為：

一種高效產(chǎn)蛋白酶細菌，為芽孢桿菌BH70049(Bacillus sp)，已于2016年5月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，其保藏編號為CGMCC No.12490。

所述產(chǎn)蛋白酶細菌BH70049從渤海海底沉積物中分離篩選獲得，對該菌進行16SrRNA基因序列分析，并通過在GenBank中比對發(fā)現(xiàn)其與Bacillus altitudinis strain 41KF2b^T(登錄號：NR042337)相似性最高，為99％。從而將分離出來的細菌命名為Bacillus altitudinis BH70049。

已于2016年5月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，其保藏編號為CGMCC No.12490。

一種高效產(chǎn)蛋白酶細菌的應用，所述細菌在生產(chǎn)蛋白酶中的應用。

所述細菌Bacillus altitudinis BH70049在生產(chǎn)蛋白酶中的應用。

進一步的說，將所述細菌Bacillus altitudinis BH70049于酪蛋白明膠產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得蛋白酶。

更進一步的說，將所述Bacillus altitudinis BH70049在pH＝8、酪素濃度為3g/L、明膠濃度為5g/L、酵母粉濃度為2g/L的酪蛋白明膠產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得蛋白酶。產(chǎn)酶培養(yǎng)基中酶活最強，經(jīng)蛋白酶對酪蛋白酶活測定其酶活達到53.09U/mL.

本發(fā)明所具有的優(yōu)點：

1.本發(fā)明的細菌BH70049具有產(chǎn)蛋白酶酶活高的特性，該菌能夠降解酪蛋白、明膠和彈性蛋白，其在酪蛋白平板、明膠平板和彈性蛋白平板上的水解圈直徑/菌落直徑依次為4.8、5.42、1.32，在發(fā)酵培養(yǎng)基中酶活較高，其產(chǎn)生蛋白酶對酪蛋白酶活測定酶活達到53.09U/mL。

2.經(jīng)本發(fā)明優(yōu)化后，該菌產(chǎn)酶能力明顯提高，酶活達到85.98U/mL。.

3.本發(fā)明菌株分離自渤海海底表面沉積物中，屬于Bacillus菌株，因而無毒無害，未經(jīng)遺傳改造，可放心應用到在食品、醫(yī)藥、制革、洗滌劑、化妝品、紡織、動植物蛋白及廢物處理等行業(yè)中。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例提供的產(chǎn)蛋白酶菌株BH70049在酪蛋白平板上產(chǎn)生水解圈照片。

圖2為本發(fā)明實施例提供的產(chǎn)蛋白酶菌株BH70049在明膠平板上產(chǎn)生水解圈照片。

圖3為本發(fā)明實施例提供的產(chǎn)蛋白酶菌株BH70049在彈性蛋白平板上產(chǎn)生水解圈照片。

圖4為本發(fā)明實施例提供的產(chǎn)蛋白酶菌株BH70049培養(yǎng)條件優(yōu)化前后蛋白酶酶活。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進行舉例描述，而非以任何形式對本發(fā)明進行限制。

1.菌株BH70049的分離、純化和保存。

從渤海海底表層無污染沉積物中采集樣品，稱取1g沉積物，用無菌海水10倍梯度稀釋至10^-6，混勻后取0.1mL(10^-2-10^-6)的稀釋樣品涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，28℃倒置培養(yǎng)3-5天，分別挑取不同菌落形態(tài)的產(chǎn)透明水解圈的單菌落，接至2216E培養(yǎng)基平板上，采用連續(xù)劃線平板的方法純化菌株，之后轉接至2216E培養(yǎng)基斜面。將純化后的菌株分別轉接至酪蛋白明膠固體培養(yǎng)基(3g/L酪素,5g/L明膠，2g/L酵母粉，15g/L瓊脂粉,人工海水)，培養(yǎng)4天，測定菌落和水解圈直徑，并計算水解圈和菌落直徑的比值，其比值可以作為定性試驗，直接反映了菌株降解蛋白質的能力。因此，本研究選取了水解圈和菌落直徑比值最大的菌株BH70049作為研究對象。

發(fā)酵培養(yǎng)基(用于菌株的代謝產(chǎn)酶):3g/L酪素，5g/L明膠，2g/L酵母粉，人工海水，pH8.0。配制方法：稱取0.3g酪素,用少許1MNaOH浸潤,加少許去離子水,加熱至溶解；稱取0.5g明膠加少許去離子水,加熱至溶解；上述溶解的酪素和明膠混合,用去離子水定容至20mL,調(diào)pH為8.0；在80mL人工海水中加入0.2g酵母粉,調(diào)pH為8.0；分裝至每瓶40mL,分別滅菌,121℃,20min。接種時，每瓶培養(yǎng)基中加入10mL的酪蛋白明膠混合溶液。

篩選培養(yǎng)基(酪蛋白明膠固體培養(yǎng)基)：在80mL人工海水中加入0.2g酵母粉，加入1.5g瓊脂粉，調(diào)pH為8.0；分別滅菌，121℃，30min.滅菌結束后，冷卻到45－50℃時，而后與酪蛋白明膠混合物混勻后倒平板；其中，酪蛋白明膠混合物為稱取0.3g酪素，用少許1M NaOH浸潤，加少許去離子水，加熱至溶解；稱取0.5明膠加少許去離子水，加熱至溶解；上述溶解得酪素和明膠混合，用去離子水定容至20mL調(diào)pH為8.0；

2216E培養(yǎng)基：酵母粉2.5g/L、蛋白胨5g/L、人工海水、瓊脂粉1.5g/L。(自然pH值,于121℃，0.11Mpa下滅菌30備用)。

人工海水(Smibert and Krieg,1994):NaCl 2.75％、MgCl₂ 0.5％、MgSO₄0.2％、CaCl₂ 0.05％、KC1 0.1％、FeS0₄ 0.0001％,去離子水配制。

所述菌株短期保藏方式為：將純化的菌株接種至2216E固體斜面，待菌落長好后保藏于4℃冰箱；長期保藏方式為：將純化的菌株培養(yǎng)至生長期的對數(shù)后期或穩(wěn)定期，加入終濃度為20％的甘油混勻，做成甘油管于-80℃冰箱中冷凍長期保藏。

菌株鑒定

將2216E斜面上的菌株在2216E平板劃線進行活化，28℃培養(yǎng)24h后對平板上產(chǎn)生的單菌落觀察，菌落呈圓形，黃色，不透明，邊緣較整齊，表面光滑，易挑取，具有典型細菌的表型特征,初步鑒定為細菌。

分子鑒定：為了進一步確定本實施細菌菌株BH70049的系統(tǒng)進化地位，對其16SrRNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析。PCR反應采用通用引物(正向引物27F和反向引物1492R)，反應體系為：反應體系50μL體積，反應液組成：1μL DNA模板，25μL2×MastarMix，1μL 27F，1μL 1492R，超純水補足至50μL。PCR反應條件為：95℃預變性5min，94℃變性45s，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。用NCBI的Nucleotide BLAST將測序得到的16SrDNA序列進行比對分析，經(jīng)過比對，本實施菌株與參比菌株Bacillus altitudinis strain 41KF2b^T相似度為99％，因此，可以判定這株菌株為芽孢桿菌屬。

Bacillus altitudinis BH70049 16S rRNA基因拼接序列：

ACCGTCACTTCGGCGGCTGGCTCCAATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTGCAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTAAACCTTGCGGTCTCGCAGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCGAAGGGAAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCAAGCAGTTACTCTTGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGACAGCCGAAACCGTCTTTCATCCTTGAACCATGCGGTTCAAGGAACTATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCCGGGAGCAAGCTCCCTTCTGTCCGCTCGACTGCATGTATAGGCCGCCGC

綜合以上鑒定結果，將該菌株命名為Bacillus altitudinis BH70049；已于2016年5月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏號為CGMCC No.12490,簡稱菌株BH70049。

2.高效產(chǎn)蛋白酶菌株BH70049水解蛋白質的能力分析

(1)高效產(chǎn)蛋白酶菌株BH70049在不同蛋白質底物平板上產(chǎn)生水解圈測定

將斜面高效菌株BH70049在2216E固體平板上劃線活化，倒置于28℃培養(yǎng)24h，然后挑取2216E平板菌落分別接種至酪蛋白平板、明膠平板和 彈性蛋白平板上，室溫培養(yǎng)5天，測定菌落和水解圈直徑。由于酪蛋白平板、明膠平板培養(yǎng)基顏色是透明的，菌株產(chǎn)生水解圈不易觀察，所以加入酸性汞試劑(HgCl₂ 15g、濃鹽酸20mL、定容至100mL蒸餾水)后,可觀察到明顯的水解圈。測定三種平板上水解圈和菌落直徑，并計算其比值。最終測得菌株BH70049在酪蛋白平板、明膠平板和彈性蛋白平板上水解圈直徑/菌落直徑依次為4.8、5.42、1.32(參見圖片1，2，3)，因此，初步鑒定該菌株具有降解蛋白質的能力，并且對不同蛋白質具有不同的降解能力。

(2)高效產(chǎn)蛋白酶菌株BH70049產(chǎn)蛋白酶酶活測定

酶活力的測定方法參考輕工業(yè)標準QBT 1803-1993進行，具體如下：

1)酪氨酸標準曲線制作

精確稱取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,用50mMTris-HCl(pH 8.0)配成1mg/mL酪氨酸標準溶液，再用50mMTris-HCl(pH 8.0)逐步稀釋成10、20、30、40、50、60、70、80、90、100|μg/mL的酪氨酸溶液,各取100μL,加入500μL 0.4M Na₂CO₃溶液,再加入100μL Folin-phenol，40℃顯色10min,于660nm測吸光度,制作標準曲線。

2)菌株BH70049產(chǎn)蛋白酶對酪蛋白酶活的測定

①將菌株接種到50mL(100mL三角瓶)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃、180r/min搖床培養(yǎng)，3d后取適量發(fā)酵液，13000r/min離心1min,上清即為粗酶液，取100μL上清于1.5離心管。

②向離心管中加入已于40℃預熱的2％酪素溶液(50mMTris-HCl(pH 8.0)配制)，40℃水浴中保溫10min。

③加入200μL0.4MTCA終止反應，40℃保溫10min。

④13000r/min離心3min,取100μL上清，加入500μL0.4M Na2CO3,再加100μL Folin-phenol，40℃顯色10min,于660nm測吸光度。對照組將步驟②、③顛倒，以變性失活的酶為對照。

酶活力單位U定義為：在以上條件下，每毫升液體酶水解酪蛋白每分鐘釋放1μg酪氨酸所需要的酶量。

依據(jù)上述制作出來的酪蛋白標準曲線和測出來的吸光值，得出菌株BH70049有較高的酶活，為53.09U/mL(參見圖片4)。

3.產(chǎn)蛋白酶菌株BH70049發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

蛋白酶的產(chǎn)生和分泌能力與菌株發(fā)酵條件(如溫度、pH，發(fā)酵時間、裝液量等)有很大關系，本發(fā)明對發(fā)酵產(chǎn)酶過程中溫度、pH、發(fā)酵時間、裝液量進行了優(yōu)化，最終使產(chǎn)酶能力顯著提高。

優(yōu)化前的發(fā)酵條件是：溫度28℃、pH8.0、裝液量50mL(100mL三角瓶)、發(fā)酵72h，菌株BH70049在這個基礎發(fā)酵條件下產(chǎn)酶能力較強(酶活為53.09U/mL),但這可能不是菌株BH70049產(chǎn)蛋白酶的最優(yōu)發(fā)酵條件，因此，本發(fā)明對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，分別設置了溫度為25℃，30℃，34℃，37℃；設置pH＝5，6，7，9，10；設置裝液量為20mL，30mL，40mL，60mL；設置發(fā)酵時間為48h,60h,84h,96h等一系列的培養(yǎng)條件，對這些設置發(fā)酵條件進行正交試驗，結果表明溫度為30℃、pH＝9、裝液量為30mL(100mL三角瓶)、發(fā)酵時間60h時蛋白酶酶活最高，產(chǎn)酶能力最強。發(fā)酵條件優(yōu)化后，測得菌株BH70049產(chǎn)蛋白酶酶活達85.98U/mL(參見圖片4)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國科學院煙臺海岸帶研究所

<120> 產(chǎn)蛋白酶細菌及應用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1445

<212> DNA

<213> 產(chǎn)蛋白酶細菌(Bacillus altitudinis)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1445)

<223>

<400> 1

accgtcactt cggcggctgg ctccaataaa ggttacctca ccgacttcgg gtgttgcaaa 60

ctctcgtggt gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct 120

gatccgcgat tactagcgat tccagcttca cgcagtcgag ttgcagactg cgatccgaac 180

tgagaacaga tttgtgggat tggctaaacc ttgcggtctc gcagcccttt gttctgtcca 240

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ttcctccggt ttgtcaccgg cagtcacctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag 360

atcaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca 420

accatgcacc acctgtcact ctgtccccga agggaaagcc ctatctctag ggttgtcaga 480

ggatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg 540

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ctcagcgtca gttacagacc agagagtcgc cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta 780

cgcatttcac cgctacacgt ggaattccac tctcctcttc tgcactcaag tttcccagtt 840

tccaatgacc ctccccggtt gagccggggg ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc 900

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tggcacgtag ttagccgtgg ctttctggtt aggtaccgtc aaggtgcaag cagttactct 1020

tgcacttgtt cttccctaac aacagagctt tacgatccga aaaccttcat cactcacgcg 1080

gcgttgctcc gtcagacttt cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg 1140

agtctgggcc gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc 1200

gtcgccttgg tgagccgtta cctcaccaac tagctaatgc gccgcgggtc catctgtaag 1260

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gtccgccgct aacatccggg agcaagctcc cttctgtccg ctcgactgca tgtataggcc 1440

gccgc 1445