本發(fā)明屬于環(huán)境微生物領(lǐng)域，具體涉及一株熒光假單胞菌菌株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

化學(xué)農(nóng)藥具有適用范圍廣、防治對(duì)象多、生產(chǎn)成本低、防治效果好以及經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)，其廣泛適用極大地促進(jìn)了現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的勞動(dòng)效率和機(jī)械化程度。但是不可避免地，大量使用農(nóng)藥殺傷昆蟲(chóng)天敵和有益微生物、使有害生物產(chǎn)生抗性、造成人、畜中毒、易對(duì)植物產(chǎn)生藥害等問(wèn)題，進(jìn)入環(huán)境中的化學(xué)農(nóng)藥，一部分可通過(guò)陽(yáng)光照射、土壤中微生物等的作用，而逐步降解失效；另一部分最終會(huì)通過(guò)“食物鏈”的作用，進(jìn)入人體，對(duì)人造成長(zhǎng)期危害。各類化學(xué)農(nóng)藥目前已廣泛進(jìn)入全球空氣及大氣沉降物、水體、土壤、底泥級(jí)生物體等自然環(huán)境中，成為環(huán)境中無(wú)所不在的污染物，因此探索對(duì)農(nóng)藥殘留進(jìn)行

有效降解的方法成為研究人員長(zhǎng)期努力的一個(gè)重要研究方向。而在該領(lǐng)域研究中，近年來(lái)廣泛興起的使用微生物對(duì)農(nóng)藥殘留進(jìn)行生物降解成為熱點(diǎn)領(lǐng)域，通過(guò)微生物作用將農(nóng)藥大分子分解成小分子化合物，并使其喪失活性。由于微生物個(gè)體小、繁殖迅速、比表面大等特點(diǎn)。它們較之其它生物更易適應(yīng)環(huán)境，并可通過(guò)自然突變產(chǎn)生新菌種，產(chǎn)生新的酶系統(tǒng)，具有新的代謝功能，從而可參與對(duì)人工新合成化合物的降解與轉(zhuǎn)化作用，因此微生物對(duì)降解農(nóng)藥殘留具有巨大潛力。

假單胞菌科的1屬。專性需氧的革蘭氏染色陰性無(wú)芽胞、無(wú)莢膜桿菌，呈桿狀或略彎。菌體大小(0.5～1)×(1.5～4)微米。具端鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。有些株產(chǎn)生熒光色素或(和)紅、藍(lán)、黃、綠等水溶性色素，不發(fā)酵糖類。大多數(shù)菌的適溫為30℃。DNA中的G+C克分子含量為58～70％。熒光假單胞菌(P.fluorescens)屬于假單胞菌屬rRNA I群熒光DNA同源組,是植物根際最普遍的微生物類群具有分布廣、數(shù)量多、營(yíng)養(yǎng)需要簡(jiǎn)單、繁殖快、競(jìng)爭(zhēng)定殖力強(qiáng)的特點(diǎn)。世界許多國(guó)家均有人報(bào)道分離到抗植物病害的熒光假單胞菌，而且許多菌株能產(chǎn)生幾種活性物質(zhì)，抗多種植物病害。其作用機(jī)制包括：抗生素的作用、噬鐵素對(duì)鐵的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、有效的根際定殖等。隨著分子生物學(xué)的廣泛滲入，通過(guò)對(duì)這些作用機(jī)制的遺傳性狀進(jìn)行分析，采用遺傳工程加以改良，使得熒光假單胞菌具有更誘人的生防效果。因此獲得對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的高效降解菌株并運(yùn)用于實(shí)踐，對(duì)降低農(nóng)藥殘留對(duì)環(huán)境的危害具有現(xiàn)實(shí)意義。

目前尚無(wú)利用熒光假單胞菌(P.fluorescens)降解甲霜靈農(nóng)藥殘留研究的文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一株熒光假單胞菌菌株及其在高濃度甲霜靈農(nóng)藥殘留降解中的應(yīng)用，該菌株具有在水體農(nóng)藥殘留及表面殘留的甲霜靈的生物降解的工業(yè)化應(yīng)用前景。

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一株熒光假單胞菌菌株，該菌株命名為熒光假單胞菌，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期是2015年12月2日，保藏編號(hào)為PFpE1501。

進(jìn)一步的，所述菌株為具有以下主要特征的菌株：

菌株為桿狀，0.3μm～0.8μm×1.0μm～1.1μm，革蘭氏染色陰性，無(wú)芽孢，單極生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，在KMB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后可形成1.2mm菌落，菌落可產(chǎn)生橙色色素，圓形，表面凸起，光滑，較粘稠，易挑起，邊緣整齊，為化能異養(yǎng)型，能夠利用植物根分泌的大部分養(yǎng)分迅速定殖于植物的根部，是最有潛力的促進(jìn)植物生長(zhǎng)的根圍細(xì)菌之一。

一種熒光假單胞菌菌株在降解甲霜靈農(nóng)藥殘留的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，以熒光假單胞菌為菌種，以殺菌劑為補(bǔ)充碳源，降解甲霜靈。

進(jìn)一步的，所述熒光假單胞菌菌株的培養(yǎng)過(guò)程包括以下步驟:

1)將所述的熒光假單胞菌菌株菌絲體接種到直徑60毫米平皿培養(yǎng)基上；

2)在28-30℃，平皿培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3-5天；

3)解剖刀刮取菌體，接入液體培養(yǎng)基中，2個(gè)培養(yǎng)皿刮取的菌絲接種到100ml培養(yǎng)液中；

4)于28-30℃和140rmp/min轉(zhuǎn)速的條件下振蕩培養(yǎng)3-5天，獲得包含其分泌的胞外降解酶的培養(yǎng)液，其為菌絲及菌液的混合菌劑。

進(jìn)一步的，所述的平皿LB培養(yǎng)基組成為:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，瓊脂粉15g，蒸餾水1000ml，pH7.5；所述的液體LB培養(yǎng)基組成為:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，蒸餾水1000ml，pH7.5。

進(jìn)一步的，在經(jīng)過(guò)步驟3)培養(yǎng)的培養(yǎng)液100ml中時(shí)，加入最終濃度5-10mg/L的甲霜靈農(nóng)藥，于28-30℃、轉(zhuǎn)速240-260rmp/min，搖床震蕩培養(yǎng)，以未經(jīng)接種的培養(yǎng)液中加入相等濃度的甲霜靈農(nóng)藥作為對(duì)照組，每隔12h取樣一次，取2-3ml樣品置于50mL塑料離心管中，加入乙睛10-12ml,振蕩20-30min，離心，取出上清液，重復(fù)3次，合并上清液，提取培養(yǎng)液中的甲霜靈農(nóng)藥殘留，經(jīng)佛羅里硅土固相萃取柱凈化，在38-40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，-20℃下冷凍干燥，再用少量乙睛溶解，進(jìn)行氣相色譜分析，計(jì)算降解率。

進(jìn)一步的，降解率(％)＝(A-B)/A×100，其中:A為對(duì)照組甲霜靈農(nóng)藥殘留值，B為經(jīng)降解菌劑降解后的甲霜靈農(nóng)藥殘留值。

本技術(shù)是從煙草根部土壤中分離得到的一株高效降解卵菌殺菌劑—甲霜靈的熒光假單胞菌(P.fluorescens)，實(shí)驗(yàn)表明該菌能夠在LB培養(yǎng)基中利用甲霜靈作為唯一碳源和能源而生長(zhǎng)，并使甲霜靈降解；在添加外源營(yíng)養(yǎng)物的液體培養(yǎng)條件下，該菌48h能夠?qū)⒒烊肱囵B(yǎng)基中5mg/L的高濃度甲霜靈降解90％以上，并且在較寬的pH范圍內(nèi)均有較好的降解效果；充分說(shuō)明該菌可以用于水體及表面殘留的甲霜靈的生物降解。

本發(fā)明的有益效果為：從煙草根部土壤中分離得到的一株高效降解卵菌殺菌劑—甲霜靈的熒光假單胞菌(P.fluorescens)，該熒光假單胞菌(P.fluorescens)是一株具有極高活力，其培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)速度快，不易變異，實(shí)驗(yàn)表明該菌能夠在LB培養(yǎng)基中利用甲霜靈作為唯一碳源和能源而生長(zhǎng)，并使甲霜靈降解；在添加外源營(yíng)養(yǎng)物的液體培養(yǎng)條件下，該菌48h能夠?qū)⒒烊肱囵B(yǎng)基中5mg/L的甲霜靈降解90％以上，并且在較寬的pH范圍內(nèi)均有較好的降解效果，充分說(shuō)明該菌可以用于水體及表面殘留的甲霜靈的生物降解，具有農(nóng)藥殘留生物降解的工業(yè)化應(yīng)用前景，也可以作為研究熒光假單胞菌(P.fluorescens)對(duì)甲霜靈農(nóng)藥殘留降解機(jī)制的模式菌株。

具體實(shí)施方式

為使對(duì)本發(fā)明的結(jié)構(gòu)特征及所達(dá)成的功效有更進(jìn)一步的了解與認(rèn)識(shí)，用以較佳的實(shí)施例配合詳細(xì)的說(shuō)明，說(shuō)明如下：

1.培養(yǎng)基配制:

1)菌種保藏培養(yǎng)基(固體，1L):胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，瓊脂粉15g，蒸餾水1000ml，pH7.5，加水定容至IL；

2)菌種活化培養(yǎng)基(固體，1L):胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，瓊脂粉15g，蒸餾水1000ml，pH7.5，加水定容至IL；

3)液體培養(yǎng)基(液體，IL):胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，蒸餾水1000ml，pH7.5，加水定容至IL。

以上培養(yǎng)基均在高壓鍋中121℃滅菌25分鐘。

2.菌種活化:挑去降解菌的菌絲，接種于加有菌種保藏培養(yǎng)基的60ml培養(yǎng)皿中，于28℃，培養(yǎng)4天，然后用手術(shù)刀刮取培養(yǎng)基表面菌絲，接菌入液體培養(yǎng)基中，于30℃，240轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速條件下振蕩培養(yǎng)4-5天，獲得包含其分泌的胞外降解酶的培養(yǎng)液；由本發(fā)明技術(shù)方案生產(chǎn)的菌劑能夠有效降解甲霜靈農(nóng)藥殘留。

實(shí)施例1

菌體的培養(yǎng):用接種針挑取熒光假單胞菌(P.fluorescens)的菌絲接種到上述菌種活化培養(yǎng)基平皿中，在溫度為28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，菌株為桿狀，0.3μm～0.8μm×1.0μm～1.1μm，革蘭氏染色陰性，無(wú)芽孢，單極生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)；用手術(shù)刀刮取菌體，接種到裝有500ml經(jīng)121℃、0.1MPa下高壓滅菌20min的培養(yǎng)液的錐形瓶中；再置于30℃，轉(zhuǎn)速240rmp/min，搖床震蕩培養(yǎng)4天，獲得菌絲及菌液混合菌劑。

實(shí)施例2

補(bǔ)充碳源固態(tài)培養(yǎng)基中甲霜靈殘留的降解:在菌種活化培養(yǎng)基滅菌降溫到40℃時(shí)，混入經(jīng)過(guò)紫外滅菌30分鐘的甲霜靈農(nóng)藥，濃度為5mg/L，充分混勻后，倒入直徑60ml的培養(yǎng)皿中，每培養(yǎng)皿3mL培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基呈粉紅色。將實(shí)施例1中培養(yǎng)好的菌絲沿菌落邊緣用6mm沒(méi)直徑的打孔器打成小片；待混有甲霜靈農(nóng)藥的培養(yǎng)基冷凝后，接入菌絲小片，菌絲向下緊貼培養(yǎng)基表面。置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天，培養(yǎng)基中的粉紅色已褪去，甲霜靈農(nóng)藥的分子結(jié)構(gòu)被降解，培養(yǎng)基呈奶油色半透明狀。

實(shí)施例3

降解菌菌劑對(duì)高濃度甲霜靈農(nóng)藥殘留的降解：

1)在經(jīng)過(guò)權(quán)利要求3培養(yǎng)的培養(yǎng)液100ml中，加入5mg/L的甲霜靈農(nóng)藥，于30℃，轉(zhuǎn)速240rmp/min，搖床震蕩培養(yǎng)，以未經(jīng)接種的培養(yǎng)液中加入相等濃度的甲霜靈農(nóng)藥作為對(duì)照組；

2)每隔12h取樣一次，取3ml樣品置于5OmL塑料離心管中，加入乙睛1OmL，在振蕩器上振蕩30min，3000rmp/min下離心，取出上清液，重復(fù)3次，合并上清液，提取培養(yǎng)液中的甲霜靈農(nóng)藥殘留后，在固相萃取裝置中經(jīng)佛羅里硅土固相萃取柱(規(guī)格:500mg3ml)凈化，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(40℃以下)，-20℃下冷凍干燥，再用少量乙睛溶解提取到的農(nóng)藥殘留，對(duì)其進(jìn)行氣相色譜分析；計(jì)算降解率:降解率(％)＝(A-B)/A×100，其中A為對(duì)照組甲霜靈農(nóng)藥殘留值(48小時(shí)后殘留值為4.7mg/L)，B為經(jīng)降解菌劑降解后的甲霜靈農(nóng)藥殘留值(48小時(shí)后殘留值為0.5mg/L)。在該培養(yǎng)條件下，熒光假單胞菌(P.fluorescens)對(duì)高濃度甲霜靈農(nóng)藥殘留的降解率48小時(shí)內(nèi)可達(dá)90％以上。

本發(fā)明的有益效果為：從煙草根部土壤中分離得到的一株高效降解卵菌殺菌劑—甲霜靈的熒光假單胞菌(P.fluorescens)，該熒光假單胞菌(P.fluorescens)是一株具有極高活力，其培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)速度快，不易變異，實(shí)驗(yàn)表明該菌能夠在LB培養(yǎng)基中利用甲霜靈作為唯一碳源和能源而生長(zhǎng)，并使甲霜靈降解；在添加外源營(yíng)養(yǎng)物的液體培養(yǎng)條件下，該菌48h能夠?qū)⒒烊肱囵B(yǎng)基中5mg/L的甲霜靈降解90％以上，并且在較寬的pH范圍內(nèi)均有較好的降解效果，充分說(shuō)明該菌可以用于水體及表面殘留的甲霜靈的生物降解，具有農(nóng)藥殘留生物降解的工業(yè)化應(yīng)用前景，也可以作為研究熒光假單胞菌(P.fluorescens)對(duì)甲霜靈農(nóng)藥殘留降解機(jī)制的模式菌株。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何不經(jīng)過(guò)創(chuàng)造性勞動(dòng)想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。