本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，主要是涉及一種在酵母菌中實(shí)現(xiàn)高準(zhǔn)確率定點(diǎn)基因敲除的方法。
背景技術(shù)：
酵母菌是真菌界中的一類單細(xì)胞真核微生物的統(tǒng)稱，目前已鑒定種有1500多個，約占已鑒定真菌種類數(shù)的1％左右。酵母菌細(xì)胞直徑約2～6μm，長度5～30μm，有的則更長，個體形態(tài)有球狀、卵圓、橢圓、柱狀和香腸狀等，在自然界分布廣泛。多數(shù)酵母可以分離于富含糖類的環(huán)境中，比如一些水果表面、發(fā)酵谷物、植物分泌物、甚至昆蟲體內(nèi)。多數(shù)酵母喜歡在偏酸性的潮濕的含糖環(huán)境中生長，在有氧和無氧環(huán)境下都能生存，屬于兼性厭氧菌。
酵母菌是人類文明史中被應(yīng)用的最早的微生物，以釀酒酵母為代表的酵母菌在食品、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)均有廣泛應(yīng)用。同時(shí)由于酵母與同為真核生物的動物和植物細(xì)胞具有很多相同的結(jié)構(gòu)，又容易培養(yǎng)，因此酵母被用作研究真核生物的模式生物，也是目前被人們了解最多的生物之一。自1996年釀酒酵母基因組測序工作完成以來，酵母菌作為模式生物被廣泛采用，在遺傳學(xué)、功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)加工以及遺傳性疾病研究等方面發(fā)揮了巨大的作用。
定點(diǎn)基因敲除是酵母功能基因研究中常采用的技術(shù)手段，基于基因同源重組原理實(shí)現(xiàn)，在酵母功能基因研究中被廣泛采用。目前在進(jìn)行酵母定點(diǎn)基因敲除時(shí)，通常采用線型雙鏈DNA作為外源DNA，其兩個末端可為平端、短5’突出粘端(常見為4bp突出粘端)、或短3’突出粘端(常見為4bp突出粘端)。由于通常細(xì)胞中非同源重組效率遠(yuǎn)高于同源重組，因此在酵母中實(shí)現(xiàn)高準(zhǔn)確率定點(diǎn)基因敲除并非易事。采用常見線型雙鏈DNA進(jìn)行同源基因克隆時(shí)，同源基因克隆準(zhǔn)確率通常低于50％。以釀酒酵母BY4743菌株為例，當(dāng)外源DNA為平端結(jié)構(gòu)、同源序列長度為500bp時(shí)，同源基因克隆準(zhǔn)確率為20％左右；當(dāng)采用抑制非同源重組突變體BY4743Δyku70時(shí)，克隆準(zhǔn)確率提高到40％左右。因此，如能建立新的高效方法，將定點(diǎn)基因敲除準(zhǔn)確率提高到80％以上，則針對每個克隆試驗(yàn)隨機(jī)挑選2-3個轉(zhuǎn)化子即可有效獲得目標(biāo)基因克隆，篩選工作量將大幅降低。本發(fā)明針對高準(zhǔn)確率定點(diǎn)基因敲除問題，公開一種新型DNA結(jié)構(gòu)及其介導(dǎo)的高準(zhǔn)確率酵母定點(diǎn)基因敲除方法。該方法可有效提高酵母定點(diǎn)基因敲除準(zhǔn)確率，為酵母遺傳學(xué)研究、功能基因研究及基因工程菌株培育提供高效技術(shù)手段。本發(fā)明設(shè)計(jì)關(guān)鍵創(chuàng)新點(diǎn)-“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”結(jié)構(gòu)及其應(yīng)用尚未見報(bào)道
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種在酵母菌中實(shí)現(xiàn)高準(zhǔn)確率定點(diǎn)基因敲除的技術(shù)方法。酵母定點(diǎn)基因敲除基于基因同源重組原理，通過外源DNA在基因組中的定點(diǎn)插入實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)基因敲除。在定點(diǎn)基因敲除過程中，外源DNA的3’單鏈末端對目標(biāo)DNA區(qū)段的入侵是實(shí)現(xiàn)同源基因克隆的分子基礎(chǔ)。當(dāng)以平端或短粘端線型雙鏈DNA為外源DNA時(shí)，進(jìn)入細(xì)胞后需經(jīng)胞內(nèi)核酸酶處理形成3’端長單鏈末端，然后發(fā)生單鏈入侵，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因同源重組。由于外源DNA在細(xì)胞內(nèi)形成3’端長單鏈末端的效率低下，導(dǎo)致定點(diǎn)基因敲除效率低下，進(jìn)而導(dǎo)致定點(diǎn)基因敲除準(zhǔn)確率低下。本發(fā)明在體外制備了攜帶3’端長單鏈末端的外源DNA，即“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”，解決了細(xì)胞內(nèi)形成攜帶3’端長單鏈末端效率低下的問題，從而實(shí)現(xiàn)了高準(zhǔn)確率定點(diǎn)基因敲除，具體表現(xiàn)為酵母中的高準(zhǔn)確率定點(diǎn)基因敲除。
在酵母菌中實(shí)現(xiàn)高準(zhǔn)確率定點(diǎn)基因敲除的方法，其特征在于，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或全基因合成的方法獲得目標(biāo)敲除基因上下游序列后，將上下游序列按與原基因相反方向連接，并插入到載體質(zhì)粒上構(gòu)建環(huán)狀克隆載體，對環(huán)狀克隆載體進(jìn)行線性化處理得到線型雙鏈DNA，將線型雙鏈DNA經(jīng)由5’→3’核酸外切酶處理，形成線型3’突出長粘端雙鏈DNA后轉(zhuǎn)化酵母菌細(xì)胞。
進(jìn)一步地，所述線型3’突出長粘端雙鏈DNA兩端各攜帶1段與目標(biāo)敲除基因上游或下游序列相同的同源序列。
所述同源序列的長度為100-1000bp，經(jīng)核酸酶處理后3’端單鏈粘端長度為100-1000nt。
本發(fā)明中“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”的制備方法為：兩端各攜帶長度為100-1000bp目標(biāo)基因上游或下游同源序列的線型雙鏈DNA，經(jīng)5’→3’核酸外切酶消化處理后形成，酶用量為50-5000U/nmol線型雙鏈DNA載體，處理溫度25-60℃，處理時(shí)間為1min-1h。所述5’→3’核酸外切酶是T5核酸外切酶、T7核酸外切酶或λ核酸外切酶，也可以是任何具有5’→3’外切活性的核酸酶。
所述線型3’突出長粘端雙鏈DNA的兩個3’突出粘端的延伸方向均指向目標(biāo)基因的編碼區(qū)，即兩個3’突出粘端相向而行共同指向目標(biāo)敲除基因區(qū)段。
線型3’突出長粘端雙鏈DNA轉(zhuǎn)化酵母菌細(xì)胞的方法是電擊介導(dǎo)法、聚乙二醇介導(dǎo)法、氯化鋰介導(dǎo)法、醋酸鋰介導(dǎo)法、或原生質(zhì)體介導(dǎo)法，也可以是其他任何可以介導(dǎo)外源DNA進(jìn)入酵母菌細(xì)胞的方法。
本發(fā)明將“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”進(jìn)入酵母細(xì)胞后高準(zhǔn)確率介導(dǎo)定點(diǎn)基因敲除，最終實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)基因敲除準(zhǔn)確率(即酵母菌轉(zhuǎn)化子中正確克隆的百分比)，準(zhǔn)確率達(dá)到45～92％。
本發(fā)明以“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”為核心創(chuàng)新點(diǎn)的高準(zhǔn)確率酵母定點(diǎn)基因敲除方法，包括以下步驟：
第一步，目標(biāo)敲除基因上下游序列克?。翰捎镁酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)或全基因合成的方法獲得?？寺⌒蛄袨槟繕?biāo)敲除基因的上游序列和下游序列，為便于陳述，上游序列稱為“序列A”，下游序列稱為“序列B”，二者長度均為100～1000bp。
第二步，環(huán)狀克隆載體構(gòu)建：將序列A和序列B按與原基因相反方向連接(即，反向插入)，并插入到載體質(zhì)粒上，獲得環(huán)狀克隆載體，同時(shí)在序列A和B之間設(shè)計(jì)單酶切位點(diǎn)，便于后續(xù)線性化處理。
第三步，環(huán)狀克隆載體線性化：以序列A和B之間單酶切限制性內(nèi)切酶，對環(huán)狀克隆載體進(jìn)行線性化處理，參照說明書進(jìn)行酶切過夜，確保酶切徹底，并用回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收?？刹捎媚z電泳后回收目標(biāo)片段，也可采用乙醇或異丙醇沉淀法，以及試劑盒回收法進(jìn)行線性化質(zhì)?；厥?。
第四步，核酸外切酶處理形成“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”：將第三步回收酶切產(chǎn)物進(jìn)行定量測定，并按照100ng/μL的濃度稀釋到酶切反應(yīng)緩沖液中，然后于冰浴上添加5’→3’核酸外切酶，酶用量為50-5000U/nmol線型雙鏈DNA載體，處理溫度25-60℃，處理時(shí)間為1min-1h。處理產(chǎn)物即為“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”。所述5’→3’核酸外切酶可以是T5核酸外切酶、T7核酸外切酶、λ核酸外切酶中任何一種，但不局限于上述幾種，其他具有5’→3’外切活性的核酸酶均適用。
第五步，“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”轉(zhuǎn)化酵母菌細(xì)胞：根據(jù)不同酵母菌生理特性選擇合適的轉(zhuǎn)化方法，將“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”轉(zhuǎn)入到酵母菌細(xì)胞中。酵母菌轉(zhuǎn)化方法可以是菌落轉(zhuǎn)化法、聚乙二醇介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、氯化鋰介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、醋酸鋰介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、電擊轉(zhuǎn)化法等中任何一種，但不局限于上述幾種，其他能將外源DNA導(dǎo)入酵母菌中的方法均適用。
第六步，轉(zhuǎn)化子篩選與鑒定：挑取擬轉(zhuǎn)化子，經(jīng)放大培養(yǎng)后，提取基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定和DNA測序分析，最終獲得正確定點(diǎn)基因敲除轉(zhuǎn)化子。定點(diǎn)基因敲除準(zhǔn)確率(即酵母菌轉(zhuǎn)化子中正確克隆的百分比)可達(dá)到45～92％。
有益效果
本發(fā)明技術(shù)方法簡便、易操作，配套試劑采購容易，能夠在酵母菌中實(shí)現(xiàn)高準(zhǔn)確率定點(diǎn)基因敲除，在提高酵母菌定點(diǎn)基因敲除工作效率，減少勞動力和物力支出等方面具有顯著意義。
附圖說明
圖1外源DNA(“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”)結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。本發(fā)明適用于已知的常見酵母菌，如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、畢赤酵母(Pichia pastoris)、假絲酵母(Candida spp.)等，但不局限于上述酵母。為敘述實(shí)施例方便，本發(fā)明以釀酒酵母gim2.198菌株為例進(jìn)行詳細(xì)實(shí)施方式和具體操作過程介紹。釀酒酵母gim2.198，分類命名：釀酒酵母，拉丁學(xué)名：Saccharomyces cerevisiae，保藏號：gim2.198，基因敲除菌株，G418抗性陽性，尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型，保藏單位為：廣東省微生物菌種保藏中心。定點(diǎn)基因敲除載體采用釀酒酵母低拷貝質(zhì)粒YCplac33(全長5603bp，攜帶ura3基因，可恢復(fù)尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型)，由東華大學(xué)黃志偉博士饋贈。目標(biāo)敲除基因?yàn)獒劸平湍副仨毣騮or2基因，兩個同源片段(序列A和序列B)分別為tor2基因上游啟動子附近區(qū)和下游終止子區(qū)域，在YCplac33上的插入位點(diǎn)為HindⅢ酶切位點(diǎn)。序列A和序列B之間連接點(diǎn)酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)為NotⅠ酶切位點(diǎn)。序列A和序列B的獲取方式為PCR擴(kuò)增克隆，序列A和序列B與YCplac33在HindⅢ酶切位點(diǎn)和NotⅠ酶切位點(diǎn)連接上采用諾唯贊多片段無縫克隆試劑盒“MultiS One Step Cloning Kit”完成。攜帶序列A和序列B的新載體命名為YCplac33-AB，YCplac33-AB經(jīng)NotI酶切線性化后又經(jīng)T5核酸外切酶處理形成的“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”命名為YCplac33-AB-T5。釀酒酵母轉(zhuǎn)化方法為聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。以SC-ura-固體平板為篩選培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)化子鑒定采用PCR擴(kuò)增和DNA測序法進(jìn)行。
具體實(shí)施例陳述如下：
實(shí)施例1
步驟1：tor2基因上游(序列A1)和下游(序列B1)各1000bp同源序列克隆。
采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR)克隆，所用DNA聚合酶為NEB生產(chǎn)的高保真DNA聚合酶(Phusion DNA Polymerase)，擴(kuò)增模板為釀酒酵母gim2.198基因組DNA，引物為根據(jù)釀酒酵母S228C序列設(shè)計(jì)合成的寡核苷酸,PPF1、PPR1、PTF1和PTR1，序列信息如下：
PPF1:5’-GACCATGATTACGCCAAGCTTGC TTTTCATATGGGGAAAGTAA-3’
PPR1:5’-GAAGATGCGGCCGCTGTTAC AAGAAAGCGGAGGGAGAAGA-3’
PTF1:5’-GTAACAGCGGCCGCATCTTC CTCTTCCGCAATTCCAGCAG-3’
PTR1:5’-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGG TTTTAATGTATTGAAAATCA-3’
引物PPF1和PPR1用于克隆tor2上游1kb區(qū)，PTF1和PTR1用于克隆tor2下游1kb區(qū)，PCR反應(yīng)體系如下：
5×HF反應(yīng)緩沖液(Mg2+濃度為7.5mM)10μL，ddH2O 31.5μL，dNTP mix(每種10mM)1.0μL，上游引物(10μM)2.5μL，下游引物(10μM)2.5μL，模板DNA(500ng/μL)2.0μL，Phusion DNA polymerase(DNA聚合酶,2U/μL)0.5μL。
PCR擴(kuò)增條件為：(1)預(yù)變性98℃1min，(2)變性98℃10sec，(3)退火55℃20sec，(4)延伸72℃45sec，(5)最后延伸72℃7min，(6)反應(yīng)結(jié)束4℃保持。
上述步驟(2)到(4)循環(huán)35次，反應(yīng)終了即可獲得分別含有tor2基因上游(序列A)和下游(序列B)的PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物以AxyPrepTMPCR Cleanup Kit試劑盒純化獲得目標(biāo)片段，調(diào)節(jié)濃度到20ng/μL，于-20℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>
步驟2：攜帶序列A1和序列B1的環(huán)狀克隆載體YCplac33-AB-1的構(gòu)建。
將質(zhì)粒YCplac33以限制性內(nèi)切酶HindⅢ酶切過夜，并以AxyPrepTMPCR Cleanup Kit試劑盒純化獲得YCplac33酶切產(chǎn)物，調(diào)節(jié)濃度到50ng/μL，并于-20℃下凍存?zhèn)溆?。采用諾唯贊多片段無縫克隆試劑盒“MultiS One Step Cloning Kit”進(jìn)行序列A、序列B與YCplac33酶切產(chǎn)物的連接反應(yīng)，插入方向與其在原基因組上方向相反(即，反向插入)。反應(yīng)體系如下：
5×反應(yīng)緩沖液4.0μL，ddH2O 11.0μL，YCplac33酶切產(chǎn)物(約50ng/μL)1.0μL，序列A1(約20ng/μL)1.0μL，序列B1(約20ng/μL)1.0μL，重組酶MultiS 2.0μL。
將上述組分混合均勻，于37℃下反應(yīng)30min，反應(yīng)完成后立即于冰水浴中冷卻5min。取連接產(chǎn)物10μL與100μL大腸桿菌DH-5α化學(xué)法感受態(tài)細(xì)胞混合均勻，冰浴處理30min后，于42℃水浴熱激90sec，然后加入900μL液體LB培養(yǎng)基(酵母抽提物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L)在37℃下震蕩培養(yǎng)45min(180轉(zhuǎn)/min)，取200μL涂布到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上(氨芐青霉素濃度為75μg/mL)，37℃下倒置培養(yǎng)過夜，最后挑取單克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證獲得正確克隆YCplac33-AB-1，并凍存于-80℃。
步驟3：“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”-YCplac33-AB-T5-1的制備。
提取正確克隆YCplac33-AB-1的質(zhì)粒，并以限制性內(nèi)切酶NotI，按1U/μg酶量37℃下酶切過夜。采用與步驟1相同的PCR cleanup回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收，并以T5核酸外切酶處理，以獲得“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”-YCplac33-AB-T5-1：酶反應(yīng)緩沖液為配套的10×緩沖液，酶用量為1.15U/μg YCplac33-AB-1酶切產(chǎn)物(相當(dāng)于5000U/nmolYCplac33-AB-1酶切產(chǎn)物)，處理溫度為60℃，處理時(shí)間為24h，所得3’端單鏈粘端長度為100bp。該處理產(chǎn)物編號為YCplac33-AB-T5-1，可直接用于后續(xù)酵母轉(zhuǎn)化。
步驟4：轉(zhuǎn)化釀酒酵母。
(1)酵母感受態(tài)制備：用接種環(huán)蘸取-80℃凍存gim2.198菌種，涂布于YPDA培養(yǎng)基上，于28℃下培養(yǎng)48h，然后挑取1個單克隆于5.0mL液體YPDA培養(yǎng)基中30℃下180轉(zhuǎn)/min震蕩培養(yǎng)過夜。然后吸取0.5mL過夜培養(yǎng)菌種接種到25.0mL新鮮YPDA液體培養(yǎng)基中，于30℃下180轉(zhuǎn)/min繼續(xù)震蕩4h。然后以2000×g離心力離心收集菌體，以25.0mL冰浴預(yù)冷的無菌超純水(電阻為18.2MΩ)輕柔震蕩重懸細(xì)胞。重復(fù)2000×g離心收集菌體，并以25.0mL濃度為0.1M的無菌醋酸鋰溶液重懸細(xì)胞1次，將細(xì)胞懸液分裝到24個無菌離心管中，于2000×g下離心收集菌體并置于冰上待用，即為釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞。
(2)外源DNA轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞：
向釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞中依次加入質(zhì)量百分比濃度為50％的聚乙二醇(PEG3350)溶液，240μL；1mol/L醋酸鋰溶液，36μL；鮭魚精DNA(2mg/mL，100℃加熱10min，然后于冰浴冷卻2min后使用)，20μL；外源DNA YCplac33-AB-T5-1，14μL；ddH2O，50.0μL?；旌暇鶆蚝笥?0℃下孵育30min，繼續(xù)加入30μL分析純二甲基亞砜并立即混合均勻，在42℃下孵育13min，然后于2000×g下離心30sec收集細(xì)胞，最后涂布到選擇培養(yǎng)基SC-ura-上(無尿嘧啶SC培養(yǎng)基)，并于30℃下倒置培養(yǎng)2d獲得再生克隆。
篩選培養(yǎng)基SC-ura-的配制方法為(1L)：無氨基氮源(含硫酸銨)6.7g，腺嘌呤硫酸鹽0.02g，纈氨酸0.15g，異亮氨酸0.03g，精氨酸0.02g，組氨酸0.02g，亮氨酸0.1g，賴氨酸0.03g，甲硫氨酸0.02g，苯丙氨酸0.05g，蘇氨酸0.02g，色氨酸0.02g，酪氨酸0.03g，天冬氨酸0.04g，絲氨酸0.04g，谷氨酸0.01g，葡萄糖20.0g，F(xiàn)e(NH4)2(SO4)2 3μg，瓊脂20.0g。121℃滅菌30min，葡萄糖單獨(dú)滅菌后加入，絲氨酸、谷氨酸和Fe(NH4)2(SO4)2各自單獨(dú)過濾滅菌。
步驟5：轉(zhuǎn)化子鑒定。
(1)菌落PCR鑒定：隨機(jī)挑取100個菌落進(jìn)行PCR鑒定，聚合酶為EX Taq，引物為PF1和PR1通用引物，序列如下:
PF1:5’-TCGCAGTTGTTATCAGCCTCAGAC-3’和PR1:5’-CTGGAACAACTCTAGATGATAACAC-3’。
PCR反應(yīng)體系如下：
10×EX Taq反應(yīng)緩沖液(Mg2+濃度為7.5mM)5μL，ddH2O 26.5μL，dNTP mix(每種10mM)1.0μL，PF1引物(10μM)2.5μL，PR1引物(10μM)2.5μL，酵母菌落懸液2.0μL，EX Taq(DNA聚合酶,5U/μL)0.5μL。
PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94℃5min，變性94℃30sec，退火55℃30sec，延伸72℃10min，最后延伸72℃10min，反應(yīng)結(jié)束4℃保持。變性-退火-延伸循環(huán)25次，反應(yīng)終了采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物檢測。
(2)陽性轉(zhuǎn)化子鑒定：將(1)中PCR鑒定陽性克隆的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序，測序表明為tor2序列缺失的菌株即為基因敲除菌株。
步驟6：獲得定點(diǎn)基因敲除轉(zhuǎn)化子，統(tǒng)計(jì)定點(diǎn)基因敲除準(zhǔn)確率。
步驟5中測序結(jié)果表明攜帶YCplac33載體序列，缺失tor2基因編碼區(qū)序列的克隆即為正確克隆。正確克隆數(shù)與100的比值即為基因敲除準(zhǔn)確率。本實(shí)施例中基因敲除準(zhǔn)確率為45％。實(shí)施例2
步驟1：tor2基因上游(序列A2)和下游(序列B2)各100bp同源序列克隆。
克隆方法同實(shí)施例1，引物為PPF2、PPR1、PTF1和PTR2，序列信息如下：
PPF1:5’-GACCATGATTACGCCAAGCTTGC TTTTCATATGGGGAAAGTAA-3’
PPR2:5’-GAAGATGCGGCCGCTGTTAC AAAGGGAAAA TATACCGGGT-3’
PTF2:5’-GTAACAGCGGCCGCATCTTC GTAACGTCACGCTCGGAACT-3’
PTR1:5’-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGG TTTTAATGTATTGAAAATCA-3’
引物PPF1和PPR2用于克隆tor2上游100bp區(qū)，PTF2和PTR1用于克隆tor2下游100bp區(qū)，PCR反應(yīng)體系除引物PPR2替換PPR1，PPF2替換PPF1外，各相應(yīng)組分用量同實(shí)施例1。PCR擴(kuò)增條件除延伸時(shí)間改為20sec外，余皆同實(shí)施例1，PCR產(chǎn)物純化方法同實(shí)施例1。
步驟2：攜帶序列A2和序列B2的環(huán)狀克隆載體YCplac33-AB-2的構(gòu)建。
質(zhì)粒YCplac33的HindⅢ酶切反應(yīng)及產(chǎn)物純化方法同實(shí)施例1。序列A2、序列B2與YCplac33酶切產(chǎn)物的連接反應(yīng)方法同實(shí)施例1，最后獲得正確克隆YCplac33-AB-2(A2和B2的插入方向均為反向插入)，并凍存于-80℃。
步驟3：“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”-YCplac33-AB-T5-2的制備。
提取正確克隆YCplac33-AB-2的質(zhì)粒，并進(jìn)行NotI，酶切方法同實(shí)施例1。采用與步驟1相同的PCR cleanup回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收，并以T5核酸外切酶處理，以獲得“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”-YCplac33-AB-T5-2：酶反應(yīng)緩沖液為配套的10×緩沖液，酶用量為0.01U/μg YCplac33-AB-2酶切產(chǎn)物(相當(dāng)于50U/nmol YCplac33-AB-2酶切產(chǎn)物)，處理溫度為25℃，處理時(shí)間為1min，所得3’端單鏈粘端長度為100bp。該處理產(chǎn)物編號為YCplac33-AB-T5-2，可直接用于后續(xù)酵母轉(zhuǎn)化。
步驟4：轉(zhuǎn)化釀酒酵母。
(1)酵母感受態(tài)制備：同實(shí)施例1。
(2)外源DNA轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞：除外源DNA替換為YCplac33-AB-T5-2外，其余操作均與實(shí)施例1相同。
步驟5：轉(zhuǎn)化子鑒定。
(1)菌落PCR鑒定：鑒定方法同實(shí)施例1。
(2)陽性轉(zhuǎn)化子鑒定：同實(shí)施例1。
步驟6：獲得同源克隆轉(zhuǎn)化子，統(tǒng)計(jì)同源基因克隆準(zhǔn)確率。
步驟5中測序結(jié)果表明攜帶YCplac33載體序列，缺失tor2基因編碼區(qū)序列的克隆即為正確克隆。正確克隆數(shù)與100的比值即為基因敲除準(zhǔn)確率。本實(shí)施例中基因敲除準(zhǔn)確率為64％。實(shí)施例3
步驟1：tor2基因上游(序列A3)和下游(序列B3)各500bp同源序列克隆。
克隆方法同實(shí)施例1，引物為PPF3、PPR1、PTF1和PTR3，序列信息如下：
PPF1:5’-GACCATGATTACGCCAAGCTTGC TTTTCATATGGGGAAAGTAA-3’
PPR3:5’-GAAGATGCGGCCGCTGTTAC TATATATTTA TTACCGTCAT-3’
PTF3:5’-GTAACAGCGGCCGCATCTTC CGGTAACAGGACAACAGCCA-3’
PTR1:5’-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGG TTTTAATGTATTGAAAATCA-3’
引物PPF1和PPR3用于克隆tor2上游500bp區(qū)，PTF3和PTR1用于克隆tor2下游500bp區(qū)，PCR反應(yīng)體系除引物PPR3替換PPR1，PPF3替換PPF1外，各相應(yīng)組分用量同實(shí)施例1。PCR擴(kuò)增條件除延伸時(shí)間改為30sec外，余皆同實(shí)施例1，PCR產(chǎn)物純化方法同實(shí)施例1。
步驟2：攜帶序列A3和序列B3的環(huán)狀克隆載體YCplac33-AB-3的構(gòu)建。
質(zhì)粒YCplac33的HindⅢ酶切反應(yīng)及產(chǎn)物純化方法同實(shí)施例1。序列A3、序列B3與YCplac33酶切產(chǎn)物的連接反應(yīng)方法同實(shí)施例1，最后獲得正確克隆YCplac33-AB-3(A3和B3均為反向插入)，并凍存于-80℃。
步驟3：“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”-YCplac33-AB-T5-3的制備。
提取正確克隆YCplac33-AB-3的質(zhì)粒，并進(jìn)行NotI，酶切方法同實(shí)施例1。采用與步驟1相同的PCR cleanup回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收，并以T5核酸外切酶處理，以獲得“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”-YCplac33-AB-T5-3：酶反應(yīng)緩沖液為配套的10×緩沖液，酶用量為0.5U/μg YCplac33-AB-3酶切產(chǎn)物(相當(dāng)于2500U/nmol YCplac33-AB-3酶切產(chǎn)物)，處理溫度為42.5℃，處理時(shí)間為30min，所得3’端單鏈粘端長度為1000bp。該處理產(chǎn)物編號為YCplac33-AB-T5-3，可直接用于后續(xù)酵母轉(zhuǎn)化。
步驟4：轉(zhuǎn)化釀酒酵母。
(1)酵母感受態(tài)制備：同實(shí)施例1。
(2)外源DNA轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞：除外源DNA替換為YCplac33-AB-T5-3外，其余操作均與實(shí)施例1相同。
步驟5：轉(zhuǎn)化子鑒定。
(1)菌落PCR鑒定：鑒定方法同實(shí)施例1。
(2)陽性轉(zhuǎn)化子鑒定：同實(shí)施例1。
步驟6：獲得同源克隆轉(zhuǎn)化子，統(tǒng)計(jì)同源基因克隆準(zhǔn)確率。
步驟5中測序結(jié)果表明攜帶YCplac33載體序列，缺失tor2基因編碼區(qū)序列的克隆即為正確克隆。正確克隆數(shù)與100的比值即為基因敲除準(zhǔn)確率。本實(shí)施例中基因敲除準(zhǔn)確率為89％。
實(shí)施例4
步驟1：tor2基因上游(序列A3)和下游(序列B3)各500bp同源序列克隆。
克隆方法同實(shí)施例3。
步驟2：攜帶序列A3和序列B3的環(huán)狀克隆載體YCplac33-AB-4的構(gòu)建。
質(zhì)粒YCplac33的HindⅢ酶切反應(yīng)及產(chǎn)物純化方法同實(shí)施例1。序列A3、序列B3與YCplac33酶切產(chǎn)物的連接反應(yīng)方法同實(shí)施例3，最后獲得正確克隆YCplac33-AB-4，并凍存于-80℃。
步驟3：“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”-YCplac33-AB-T5-4的制備。
提取正確克隆YCplac33-AB-4的質(zhì)粒，并進(jìn)行NotI，酶切方法同實(shí)施例1。采用與步驟1相同的PCR cleanup回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收，并以T5核酸外切酶處理，以獲得“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”-YCplac33-AB-T5-4：酶反應(yīng)緩沖液為配套的10×緩沖液，酶用量為0.8U/μg YCplac33-AB-4酶切產(chǎn)物(相當(dāng)于400U/nmol YCplac33-AB-4酶切產(chǎn)物)，處理溫度為50℃，處理時(shí)間為10min，所得3’端單鏈粘端長度為450bp。該處理產(chǎn)物編號為YCplac33-AB-T5-4，可直接用于后續(xù)酵母轉(zhuǎn)化。
步驟4：轉(zhuǎn)化釀酒酵母。
(1)酵母感受態(tài)制備：同實(shí)施例1。
(2)外源DNA轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞：除外源DNA替換為YCplac33-AB-T5-4外，其余操作均與實(shí)施例1相同。
步驟5：轉(zhuǎn)化子鑒定。
(1)菌落PCR鑒定：鑒定方法同實(shí)施例1。
(2)陽性轉(zhuǎn)化子鑒定：同實(shí)施例1。
步驟6：獲得同源克隆轉(zhuǎn)化子，統(tǒng)計(jì)同源基因克隆準(zhǔn)確率。
步驟5中測序結(jié)果表明攜帶YCplac33載體序列，缺失tor2基因編碼區(qū)序列的克隆即為正確克隆。正確克隆數(shù)與94的比值即為基因敲除準(zhǔn)確率。本實(shí)施例中基因敲除準(zhǔn)確率為92％。實(shí)施例5
步驟1：tor2基因上游(序列A3)和下游(序列B3)各500bp同源序列克隆。
克隆方法同實(shí)施例3。
步驟2：攜帶序列A3和序列B3的環(huán)狀克隆載體YCplac33-AB-5的構(gòu)建。
質(zhì)粒YCplac33的HindⅢ酶切反應(yīng)及產(chǎn)物純化方法同實(shí)施例1。序列A3、序列B3與YCplac33酶切產(chǎn)物的連接反應(yīng)方法同實(shí)施例3，最后獲得正確克隆YCplac33-AB-5，并凍存于-80℃。
步驟3：“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”-YCplac33-AB-T5-5的制備。
提取正確克隆YCplac33-AB-4的質(zhì)粒，并進(jìn)行NotI，酶切方法同實(shí)施例1。采用與步驟1相同的PCR cleanup回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收，并以T5核酸外切酶處理，以獲得“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”-YCplac33-AB-T5-4：酶反應(yīng)緩沖液為配套的10×緩沖液，酶用量為0.8U/μg YCplac33-AB-5酶切產(chǎn)物(相當(dāng)于400U/nmol YCplac33-AB-5酶切產(chǎn)物)，處理溫度為55℃，處理時(shí)間為5min，所得3’端單鏈粘端長度為300bp。該處理產(chǎn)物編號為YCplac33-AB-T5-5，可直接用于后續(xù)酵母轉(zhuǎn)化。
步驟4：轉(zhuǎn)化釀酒酵母。
(1)酵母感受態(tài)制備：同實(shí)施例1。
(2)外源DNA轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞：除外源DNA替換為YCplac33-AB-T5-5外，其余操作均與實(shí)施例1相同。
步驟5：轉(zhuǎn)化子鑒定。
(1)菌落PCR鑒定：鑒定方法同實(shí)施例1。
(2)陽性轉(zhuǎn)化子鑒定：同實(shí)施例1。
步驟6：獲得同源克隆轉(zhuǎn)化子，統(tǒng)計(jì)同源基因克隆準(zhǔn)確率。
步驟5中測序結(jié)果表明攜帶YCplac33載體序列，缺失tor2基因編碼區(qū)序列的克隆即為正確克隆。正確克隆數(shù)與100的比值即為基因敲除準(zhǔn)確率。本實(shí)施例中基因敲除準(zhǔn)確率為91％。實(shí)施例6
步驟1：tor2基因上游(序列A3)和下游(序列B3)各500bp同源序列克隆。
克隆方法同實(shí)施例3。
步驟2：攜帶序列A3和序列B3的環(huán)狀克隆載體YCplac33-AB-6的構(gòu)建。
質(zhì)粒YCplac33的HindⅢ酶切反應(yīng)及產(chǎn)物純化方法同實(shí)施例1。序列A3、序列B3與YCplac33酶切產(chǎn)物的連接反應(yīng)方法同實(shí)施例3，最后獲得正確克隆YCplac33-AB-6，并凍存于-80℃。
步驟3：“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”-YCplac33-AB-T5-6的制備。
提取正確克隆YCplac33-AB-4的質(zhì)粒，并進(jìn)行NotI，酶切方法同實(shí)施例1。采用與步驟1相同的PCR cleanup回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收，并以T5核酸外切酶處理，以獲得“線型3’突出長粘端雙鏈DNA”-YCplac33-AB-T5-6：酶反應(yīng)緩沖液為配套的10×緩沖液，酶用量為0.4U/μg YCplac33-AB-6酶切產(chǎn)物(相當(dāng)于400U/nmol YCplac33-AB-6酶切產(chǎn)物)，處理溫度為55℃，處理時(shí)間為10min，所得3’端單鏈粘端長度為300bp。該處理產(chǎn)物編號為YCplac33-AB-T5-6，可直接用于后續(xù)酵母轉(zhuǎn)化。
步驟4：轉(zhuǎn)化釀酒酵母。
(1)酵母感受態(tài)制備：同實(shí)施例1。
(2)外源DNA轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞：除外源DNA替換為YCplac33-AB-T5-5外，其余操作均與實(shí)施例1相同。
步驟5：轉(zhuǎn)化子鑒定。
(1)菌落PCR鑒定：鑒定方法同實(shí)施例1。
(2)陽性轉(zhuǎn)化子鑒定：同實(shí)施例1。
步驟6：獲得同源克隆轉(zhuǎn)化子，統(tǒng)計(jì)同源基因克隆準(zhǔn)確率。
步驟5中測序結(jié)果表明攜帶YCplac33載體序列，缺失tor2基因編碼區(qū)序列的克隆即為正確克隆。正確克隆數(shù)與100的比值即為基因敲除準(zhǔn)確率。本實(shí)施例中基因敲除準(zhǔn)確率為78％。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江科技學(xué)院
<120> 在酵母菌中實(shí)現(xiàn)高準(zhǔn)確率定點(diǎn)基因敲除的方法
<130>
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaccatgatt acgccaagct tgcttttcat atggggaaag taa 43
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gaagatgcgg ccgctgttac aagaaagcgg agggagaaga 40
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<212> DNA
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gaagatgcgg ccgctgttac aaagggaaaa tataccgggt 40
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gtaacagcgg ccgcatcttc gtaacgtcac gctcggaact 40
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<213> 人工序列
<400> 9
gaagatgcgg ccgctgttac tatatattta ttaccgtcat 40
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gtaacagcgg ccgcatcttc cggtaacagg acaacagcca 40