本發(fā)明涉及生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，具體涉及一株高效轉(zhuǎn)化甘草酸生產(chǎn)GAMG的東鄉(xiāng)野生稻內(nèi)生真菌及其在轉(zhuǎn)化甘草酸生產(chǎn)GAMG中的應(yīng)用方法。

背景技術(shù)：

甘草酸(Glycyrrhizitic acid,GL)，又名甘草皂苷，是藥用甘草中的主要活性成分之一。甘草皂苷是由一分子的五環(huán)三萜類皂苷通過糖苷鍵與兩分子的葡萄糖醛酸連接而成。甘草酸經(jīng)β-D-葡萄糖醛酸苷酶水解作用后，除去遠(yuǎn)端的一個(gè)葡萄糖醛酸基就生成單葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)。

單葡萄糖醛酸基甘草次酸(Glycyrrhetinic acid mono-Glucuronide,GAMG)，又稱甘草次苷，是一種天然的甜味劑，不僅具有高甜度、低熱量的優(yōu)良特性，還能增加食品原有的風(fēng)味，被作為甜味劑和食品添加劑，廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)。GAMG具有和甘草酸相似的抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗消化道潰瘍、抗過敏、保肝、降血脂和鎮(zhèn)咳祛痰等藥理作用，并且GAMG具有更好的吸收率和生物利用度?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，GL和GAMG在體內(nèi)具有相同的代謝途徑。因此，GAMG可以發(fā)揮與GL相似的藥理學(xué)作用，作為甘草酸類藥物更有效的替代品，GAMG具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。

目前，生產(chǎn)GAMG的方法主要包括兩大類，分別是化學(xué)法和生物法。應(yīng)用傳統(tǒng)的化學(xué)方法生產(chǎn)GAMG，具有鍵的選擇性低、可調(diào)控性差、反應(yīng)路線長、收率低等缺點(diǎn)，且對(duì)設(shè)備的要求高，很難實(shí)現(xiàn)真正的工業(yè)化生產(chǎn)。與傳統(tǒng)的化學(xué)方法相比，生物轉(zhuǎn)化的方法具有操作簡單、反應(yīng)條件溫和、鍵的選擇性強(qiáng)、反應(yīng)速率快、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)。因此，應(yīng)用微生物轉(zhuǎn)化方法生產(chǎn)GAMG，不僅能夠節(jié)約成本，而且還能實(shí)現(xiàn)GAMG的定向合成，提高GAMG的產(chǎn)率。根據(jù)一系列相關(guān)的研究報(bào)道可知，用于生物轉(zhuǎn)化合成GAMG的菌株主要集中于青霉屬、曲霉屬、木霉屬、根霉屬等，利用內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化GL成GAMG的報(bào)道不多。專利ZL201410225800.3報(bào)道利用內(nèi)生真菌DX-SES3(Microsphaeropsis arundinis)將甘草轉(zhuǎn)化成甘草次苷，轉(zhuǎn)化率為80.5％，但其生成甘草次苷吸附在菌體表面，利用乙醇洗滌就能獲得純度為89.4％的成品，該專利的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)物的分離簡單，綠色環(huán)保。專利201410057606.9報(bào)道內(nèi)生真菌Aspergillus flavus DX-SEL2高效轉(zhuǎn)化甘草變成甘草次苷，轉(zhuǎn)化率90.5％，甘草次苷產(chǎn)率為85.3％，該工藝轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)物也比較容易純化。如何從豐富的真菌資源中發(fā)現(xiàn)更多具有專一性、高效性轉(zhuǎn)化的菌株，是響應(yīng)可持續(xù)發(fā)展的生產(chǎn)要求，也是實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的重要前題。本發(fā)明從禾本科植物東鄉(xiāng)野生稻抽穗期的莖組織中分離篩選出能高效轉(zhuǎn)化甘草酸生產(chǎn)GAMG的球毛殼菌Chaetomium globosum DX-THS3，以期為實(shí)現(xiàn)GAMG的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一株高效轉(zhuǎn)化甘草酸生產(chǎn)GAMG的東鄉(xiāng)野生稻內(nèi)生真菌，并利用該菌株高效轉(zhuǎn)化甘草酸生產(chǎn)GAMG，以實(shí)現(xiàn)GAMG的高效定向轉(zhuǎn)化、副產(chǎn)物少、低耗能、高產(chǎn)物得率的可持續(xù)生產(chǎn)要求。

本發(fā)明中，高效轉(zhuǎn)化甘草酸生產(chǎn)GAMG的東鄉(xiāng)野生稻內(nèi)生真菌，其分類命名為球毛殼菌Chaetomium globosum DX-THS3，是從東鄉(xiāng)野生稻抽穗期活體的莖組織中采用內(nèi)生真菌分離純化技術(shù)分離獲得，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為湖北省武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2016年1月4日，保藏號(hào)為CCTCC NO:M 2016005。

所述的球毛殼菌Chaetomium globosum DX-THS3的形態(tài)特征為：在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)3天，菌落直徑為40～43mm，5天菌落直徑為71～72mm，7天長滿整個(gè)培養(yǎng)皿；菌絲初期為白色，呈絲狀，不易挑?。痪涓稍?，不透明，與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，邊緣不平整，成熟后為絨氈狀，黑色，菌體產(chǎn)生的色素部分分泌在培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基背面呈黑色，菌落以接種塊為中心在培養(yǎng)基上以黑色同心圓分布。在光學(xué)顯微鏡下，可觀察到該菌株的菌絲，菌絲豐富且為有隔菌絲，未觀察到孢子結(jié)構(gòu)(如圖1、圖2所示)。

所述的球毛殼菌Chaetomium globosum DX-THS3的基因登錄號(hào)為KF558876，它的ITS堿基序列：

TTCCGTAGGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACAGAGTTGCAAAACTCCCTAAACCATTGTGAACGTTACCTATACCGTTGCTTCGGCGGGCGGCCCCGGGGTTTACCCCCCGGGCGCCCCTGGGCCCCACCGCGGGCGCCCGCCGGAGGTCACCAAACTCTTGATAATTTATGGCCTCTCTGAGTCTTCTGTACTGAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCT GTTCGAGCGTCATTTCAACCATCAAGCCCCCGGGCTTGTTGTGTTGGGGACCTGCGGCTGCCGCAGGCCCTGAAAAGCAGTGGCGGGCTCGCTGTCGCACCGAGTAGCATACATCTCGCTCTGGTCGCGCCGCGGGTTCCGGCCGTTAAACCACCTTTTAACCCAAGGTGACCTCGGATCAGGTAGGAAGACCCGCTGAACTTACGCATATCAATAAGCGAGGGA

所述的球毛殼菌Chaetomium globosum DX-THS3可以應(yīng)用于生產(chǎn)GAMG，其應(yīng)用方法包括以下步驟：

步驟一、將球毛殼菌Chaetomium globosum DX-THS3接種到PDA斜面培養(yǎng)基上活化5～7天，再用接種環(huán)挑取一環(huán)斜面種子接入到已滅菌的搖瓶種子培養(yǎng)基中，置于溫度為28～30℃、轉(zhuǎn)速為120～160r/min的搖床中，連續(xù)培養(yǎng)3～5天，即至菌體的對(duì)數(shù)生長期；

步驟二、按照1～10％(w/v)的接種量把上述培養(yǎng)好的種子接種至含甘草酸的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GAMG至含量基本恒定；

步驟三、從發(fā)酵液中分離純化GAMG。

優(yōu)選的是，步驟一中種子培養(yǎng)基的成分及配比為：葡萄糖5.0～20g/L，KH₂PO₄ 1.2～3.2g/L，NH₄NO₃ 2.0～5.0g/L，NaCl 0.5～1.0g/L，酵母粉0.05～0.3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25～0.5g/L，CaCl₂ 0.011～0.11g/L，ZnSO₄·7H₂O 2.87mg/L，MnSO₄·H₂O 1.69mg/L，H₃BO₃ 0.03mg/L，純水1000mL，調(diào)節(jié)pH 5.0～7.0，121℃高壓蒸汽下滅菌30min。

優(yōu)選的是，步驟二中轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的成分及配比為：甘草酸(甘草酸鹽或甘草提取物)1～5g/L，KH₂PO₄ 1.2～3.2g/L，蛋白胨2.0～5.0g/L，NaCl 0.5～1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25～0.5g/L，CaCl₂ 0.011～0.11g/L，ZnSO₄·7H₂O 2.87mg/L，MnSO₄·H₂O 1.69mg/L，H₃BO₃ 0.03mg/L，純水1000mL，調(diào)節(jié)pH 5.0～7.0，121℃高壓蒸汽下滅菌30min；其中甘草酸(甘草酸鹽或甘草提取物)是菌體產(chǎn)β-D-葡萄糖醛酸苷酶的誘導(dǎo)劑。

優(yōu)選的是，步驟二中培養(yǎng)條件為：溫度28～36℃、轉(zhuǎn)速120～180r/min。

優(yōu)選的是，步驟三中GAMG的分離純化包含以下步驟：

布氏漏斗抽濾，收集發(fā)酵液，用石油醚等體積萃取兩次，每次2小時(shí)，水相用氯仿等體積萃取兩次，每次2小時(shí)，水相繼續(xù)用乙酸乙酯等體積的萃取兩次，每次2小時(shí)。得到的乙酸乙酯相減壓濃縮即為GAMG粗品，然后再用反相硅膠柱層析及制備液相等方法進(jìn)一步分離純化得到GAMG。

本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：公開了一株高效轉(zhuǎn)化甘草酸生產(chǎn)GAMG的東鄉(xiāng)野生稻內(nèi)生真菌，該高效轉(zhuǎn)化甘草酸生產(chǎn)GAMG的東鄉(xiāng)野生稻內(nèi)生真菌可以用來轉(zhuǎn)化甘草酸生產(chǎn)GAMG；在本發(fā)明的應(yīng)用方法中，用微生物菌體所合成的β-D-葡萄糖醛酸苷酶作為該水解反應(yīng)的催化劑，具有操作簡單、專一性強(qiáng)、產(chǎn)率高、副產(chǎn)物少、低能耗等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述球毛殼菌Chaetomium globosum DX-THS3的菌落形態(tài)；

圖2為本發(fā)明所述球毛殼菌Chaetomium globosum DX-THS3在光學(xué)顯微鏡下的菌絲形態(tài)；

圖3為本發(fā)明所述球毛殼菌Chaetomium globosum DX-THS3轉(zhuǎn)化甘草酸轉(zhuǎn)化液的HPLC檢測(cè)；

圖4為分離純化后的GAMG的HPLC液相圖；

圖5為本發(fā)明所述球毛殼菌Chaetomium globosum DX-THS3轉(zhuǎn)化甘草酸所得的GAMG分離純化后經(jīng)ESI-MS檢測(cè)所得的譜圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

本發(fā)明所述球毛殼菌Chaetomium globosum DX-THS3的分離：

(1)采集完整的東鄉(xiāng)野生稻，回到實(shí)驗(yàn)室立即處理。根部、莖部和葉子均采用75％的酒精浸泡5min，進(jìn)行初步滅菌，再用0.1％升汞浸泡8min，接著用無菌水漂洗組織表面的滅菌方式。

(2)將上述處理好的莖用用已滅菌的剪刀將其兩頭都減掉，再將去掉兩頭的莖縱剖，一分為二，再剪成0.1cm×0.5cm的小塊。將它們分別置于外加60μg/L鏈霉素和0.5g/L重鉻酸鉀的PDA培養(yǎng)基上，置于28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為了檢查表面滅菌的效果，設(shè)置對(duì)照組檢驗(yàn)滅菌的效果。對(duì)照Ⅰ：將已滅菌的根、莖和葉子不減去兩頭和邊緣，然后將它們的表面與固體平板接觸后取出，并將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；對(duì)照Ⅱ：最后一次洗滌用無菌水接入培養(yǎng)基中。每個(gè)處理重復(fù)3次。

(3)發(fā)現(xiàn)接種組織長出的菌落，用接種針前端挑取菌絲前端，再接種到另一個(gè)培養(yǎng)基上。每天觀察一次，如果長出菌落，立即挑出。

(4)挑出的真菌形成菌落后，用接種針挑取菌絲前端，再接種到另一個(gè)培養(yǎng)基上，如此反復(fù)純化4次，將菌種接種到斜面培養(yǎng)基上4℃保存。

實(shí)施例2

本發(fā)明所述球毛殼菌Chaetomium globosum DX-THS3的篩選：

(1)平板初篩：將上述分離純化得到的東鄉(xiāng)野生稻內(nèi)生真菌活化，之后接種到甘草酸(甘草酸鹽或甘草提取物)作為唯一碳源的固體篩選培養(yǎng)基中，對(duì)照組用葡萄糖作為唯一碳源。置于28℃的培養(yǎng)箱中，連續(xù)培養(yǎng)7天，篩選出能在甘草酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長良好的菌株。

所述固體篩選培養(yǎng)基的組成及配比為：甘草酸氨鹽1.0g/L，KH₂PO₄ 2.2g/L，NH₄NO₃3.0g/L，NaCl 0.5g/L，酵母粉0.05g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，CaCl₂ 0.011g/L，ZnSO₄·7H₂O 2.87mg/L，MnSO₄·H₂O 1.69mg/L，H₃BO₃ 0.03mg/L，瓊脂粉20g/L，純水1000mL，調(diào)節(jié)pH 5.0～7.0，121℃高壓蒸汽下滅菌30min。

(2)搖瓶復(fù)篩：將上述平板初篩出來的菌株接種到搖瓶種子培養(yǎng)基中，置于溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為120r/min的搖床中，連續(xù)培養(yǎng)3～5天。然后，按1％(w/v)的接種量把上述培養(yǎng)好的種子接種至甘草酸為唯一碳源的搖瓶篩選培養(yǎng)基中，并設(shè)置兩個(gè)對(duì)照組：一是液體篩選培養(yǎng)基中不接入菌種(以檢測(cè)甘草酸再培養(yǎng)基中是否會(huì)發(fā)生分解)，二是將菌種轉(zhuǎn)接到以葡萄糖為唯一碳源的液體篩選培養(yǎng)基中。置于溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為120r/min的搖床中，連續(xù)培養(yǎng)5天，過濾，收集發(fā)酵液，用TLC、HPLC的方法檢測(cè)發(fā)酵液中的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

搖瓶種子培養(yǎng)基組成：葡萄糖20g/L，KH₂PO₄ 2.2g/L，NH₄NO₃ 3.0g/L，NaCl 0.5g/L，酵母粉0.05g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，CaCl₂ 0.011g/L，ZnSO₄·7H₂O 2.87mg/L，MnSO₄·H₂O 1.69mg/L，H₃BO₃ 0.03mg/L，純水1000mL，調(diào)節(jié)pH 5.0～7.0，121℃高壓蒸汽下滅菌30min。

搖瓶篩選培養(yǎng)基組成：甘草酸氨鹽1.0g/L，KH₂PO₄ 2.2g/L，NH₄NO₃ 3.0g/L，NaCl 0.5g/L，酵母粉0.05g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，CaCl₂ 0.011g/L，ZnSO₄·7H₂O 2.87mg/L，MnSO₄·H₂O 1.69mg/L，H₃BO₃ 0.03mg/L，純水1000mL，調(diào)節(jié)pH 5.0～7.0，121℃高壓蒸汽下滅菌30min。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：球毛殼菌Chaetomium globosum DX-THS3能高效轉(zhuǎn)化甘草酸生產(chǎn)GAMG(如圖3)，甘草酸的轉(zhuǎn)化率[(起始GL的摩爾濃度－轉(zhuǎn)化后GL的摩爾濃度)/起始GL的摩爾濃度×100％]為88.7％，GAMG的轉(zhuǎn)化率[轉(zhuǎn)化后GAMG的摩爾濃度/起始GL的摩爾濃度×100％]為86.4％。

實(shí)施例3

球毛殼菌Chaetomium globosum DX-THS3轉(zhuǎn)化甘草提取物生產(chǎn)GAMG：

將活化后的球毛殼菌Chaetomium globosum DX-THS3接種到種子培養(yǎng)基中，置于溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為120r/min的搖床中，連續(xù)培養(yǎng)3天，按照1～10％(w/v)的接種量把上述培養(yǎng)好的種子接種至含甘草酸的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，置于溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為120r/min的搖床中，連續(xù)培養(yǎng)7天。離心除去菌體，收集發(fā)酵液，并用0.22μm的微孔濾頭，最后經(jīng)HPLC檢測(cè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

所述種子培養(yǎng)基的組成及配比為：葡萄糖20g/L，KH₂PO₄ 1.2～3.2g/L，NH₄NO₃ 2.0～5.0g/L，NaCl 0.5～1.0g/L，酵母粉0.05～0.3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25～0.5g/L，CaCl₂0.011～0.11g/L，ZnSO₄·7H₂O 2.87mg/L，MnSO₄·H₂O 1.69mg/L，H₃BO₃ 0.03mg/L，純水1000mL，調(diào)節(jié)pH 5.0～6.0。

所述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的組成及配比為：甘草提取物5g/L，KH₂PO₄ 1.2～3.2g/L，蛋白胨2.0～5.0g/L，NaCl 0.5～1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25～0.5g/L，CaCl₂ 0.011～0.11g/L，ZnSO₄·7H₂O 2.87mg/L，MnSO₄·H₂O 1.69～2.50mg/L，H₃BO₃ 0.03～0.05mg/L，純水1000mL，調(diào)節(jié)pH 5.0～6.0。

轉(zhuǎn)化結(jié)束后，抽濾除去菌體得濾液并檢測(cè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，由檢測(cè)結(jié)果可知，甘草酸的轉(zhuǎn)化率為：88.7％，GAMG的轉(zhuǎn)化率為：86.4％。

所得濾液用等體積的石油醚除去發(fā)酵液中脂溶性成分，接著用等體積的氯仿除去極性較小的雜質(zhì)，水相繼續(xù)用等體積的乙酸乙酯萃取3次，得到的乙酸乙酯相減壓濃縮即得GAMG的粗品。再利用中壓柱層析對(duì)GAMG粗品進(jìn)行進(jìn)一步地分離，得到GAMG的純品，其純度為99.4％(如圖4)。

實(shí)施例4

球毛殼菌Chaetomium globosum DX-THS3轉(zhuǎn)化甘草酸鉀鹽生產(chǎn)GAMG：

將活化后的球毛殼菌Chaetomium globosum DX-THS3接種到培養(yǎng)基中，置于溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為120r/min的搖床中，連續(xù)培養(yǎng)5天。

所述培養(yǎng)基的組成及配比為：葡萄糖10g/L，KH₂PO₄ 1.2～3.2g/L，NH₄NO₃ 2.0～5.0g/L，NaCl 0.5～1.0g/L，酵母粉0.05～0.3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25～0.5g/L，CaCl₂0.011～0.11g/L，ZnSO₄·7H₂O 2.87mg/L，MnSO₄·H₂O 1.69mg/L，H₃BO₃ 0.03mg/L，純水1000mL，調(diào)節(jié)pH 5.0～6.0。

向連續(xù)培養(yǎng)5天后的培養(yǎng)液中添加甘草酸鉀鹽至3g/L，置于溫度28℃、轉(zhuǎn)速為120r/min的搖床中，連續(xù)培養(yǎng)7天。離心除去菌體，收集發(fā)酵液，并用0.22μm的微孔濾頭，最后經(jīng)HPLC檢測(cè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

轉(zhuǎn)化結(jié)束后，抽濾除去菌體得濾液并檢測(cè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，由檢測(cè)結(jié)果可知，甘草酸的轉(zhuǎn)化率為：85.4％，GAMG的轉(zhuǎn)化率為：84.9％。

實(shí)施例5

球毛殼菌Chaetomium globosum DX-THS3轉(zhuǎn)化甘草酸鈉鹽生產(chǎn)GAMG。

將活化后的球毛殼菌Chaetomium globosum DX-THS3接種到培養(yǎng)基中，置于溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為135r/min的搖床中，連續(xù)培養(yǎng)4天。

所述培養(yǎng)基的組成及配比為：葡萄糖10g/L，KH₂PO₄ 1.2～3.2g/L，NH₄NO₃ 2.0～5.0g/L，NaCl 0.5～1.0g/L，酵母粉0.05～0.3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25～0.5g/L，CaCl₂0.011～0.11g/L，ZnSO₄·7H₂O 2.87mg/L，MnSO₄·H₂O 1.69mg/L，H₃BO₃ 0.03mg/L，純水1000mL，調(diào)節(jié)pH 5.0～6.0。

向連續(xù)培養(yǎng)4天后的培養(yǎng)液中添加甘草酸鈉鹽至2g/L，置于溫度30℃、轉(zhuǎn)速為135r/min的搖床中，連續(xù)培養(yǎng)6天。離心除去菌體，收集發(fā)酵液，并用0.22μm的微孔濾頭，最后經(jīng)HPLC檢測(cè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

轉(zhuǎn)化結(jié)束后，抽濾除去菌體得濾液并檢測(cè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，由檢測(cè)結(jié)果可知，甘草酸的轉(zhuǎn)化率為：80.3％，GAMG的轉(zhuǎn)化率為：75.9％。

SEQUENCE LISTING

<110> 江西科技師范大學(xué)

<120> 一株高效轉(zhuǎn)化甘草酸生產(chǎn)GAMG的東鄉(xiāng)野生稻內(nèi)生真菌及其應(yīng)用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 574

<212> DNA

<213> 球毛殼菌DX-THS3 (Chaetomium globosum DX-THS3)

<400> 1

ttccgtaggg tgaacctgcg gagggatcat tacagagttg caaaactccc taaaccattg 60

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