本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一株大花綠絨蒿內(nèi)生真菌DH24及其在發(fā)酵生產(chǎn)Pyrrocidines類化合物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

青藏高原地區(qū)由于其高寒高海拔的獨(dú)特環(huán)境，造就了生長(zhǎng)在高原的獨(dú)特藏藥材。大花綠絨蒿（Meconopsis grandis Prain）是罌粟科綠絨蒿屬植物，在海拔高度為3000～5500 m的高寒地帶，是西藏特有植物，素有高原美人之稱。大花綠絨蒿是重要藏藥毛瓣綠絨蒿的代用藥，全草入藥，具有清熱解毒、利尿、消炎、止痛、鎮(zhèn)咳功效，用于肺炎、肝炎、咳喘等疾病的治療。

因人工種植不易，大花綠絨蒿作為毛瓣綠絨蒿代用藥成為了瀕危植物。為了研究?jī)?nèi)生真菌在瀕危植物保護(hù)中的生態(tài)學(xué)意義，探討內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)瀕危藏藥的保護(hù)及對(duì)瀕危藏藥次級(jí)代謝生物合成的互惠關(guān)系，并尋找新的藥物先導(dǎo)化合物，課題組對(duì)多種瀕危藏藥進(jìn)行了內(nèi)生真菌的系統(tǒng)分離研究，從原生態(tài)大花綠絨蒿活株中分離得到了40多株內(nèi)生真菌，大都具有很好的應(yīng)用前景。因此，大花綠絨蒿是一種豐富的功能內(nèi)生真菌來源。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一株青藏高原藏藥材大花綠絨蒿內(nèi)生真菌DH24。

本發(fā)明另一目的是提供上述大花綠絨蒿內(nèi)生真菌DH24在發(fā)酵生產(chǎn)Pyrrocidines類化合物中的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一株青藏高原藏藥材大花綠絨蒿內(nèi)生真菌DH24，該菌株于2016年9月23日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為GDMCC No：60081，保藏地址為廣州市先烈中路100號(hào)大院59號(hào)樓5樓。

本發(fā)明上述的大花綠絨蒿內(nèi)生真菌DH24，分離自西藏高原特色藏藥材大花綠絨蒿（Meconopsis grandis Prain）根部，經(jīng)ITS rRNA鑒定為新叢赤殼菌屬（Neonectria sp.）真菌（該菌株的ITS rDNA序列如SEQ ID NO.1所示）。

該菌株的生物學(xué)特性為：在PDA培養(yǎng)基上，20～25℃恒溫培養(yǎng)時(shí)，菌落表面為土黃色短絨毛狀，背面為黃褐色，擴(kuò)散性生長(zhǎng)，有孢子生成。為好氧型真菌。

該菌株在不同發(fā)酵方法中，能夠用于生產(chǎn)Pyrrocidines 系列化合物。所生產(chǎn)的Pyrrocidines系列化合物具有明顯的抗多種腫瘤細(xì)胞株的活性。本發(fā)明生產(chǎn)方便，成本低，節(jié)能環(huán)保，是開發(fā)天然藥物的一種理想載體。

因此，本發(fā)明所述大花綠絨蒿內(nèi)生真菌DH24在發(fā)酵生產(chǎn)Pyrrocidines類化合物中的應(yīng)用，也應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

所述Pyrrocidines類化合物是指pyrrocidine A化合物和/或pyrrocidine B化合物等。

本發(fā)明具有以下有益效果：

（1）本發(fā)明的西藏藏藥材內(nèi)生真菌DH24能產(chǎn)生獨(dú)特結(jié)構(gòu)的Pyrrocidines類化合物，經(jīng)測(cè)試該化合物有體外抗腫瘤、體外抗真菌等活性。

（2）本發(fā)明真菌DH24發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)活性化合物的成本低，節(jié)能環(huán)保，是開發(fā)新型天然藥物的理想載體。

（3）本發(fā)明真菌DH24發(fā)酵和生產(chǎn)活性化合物的周期短，分離制備較簡(jiǎn)單，易于擴(kuò)大生產(chǎn)，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。

附圖說明

圖1 為本發(fā)明pyrrocidine A化合物的核磁共振氫譜。

圖2 為本發(fā)明pyrrocidine A化合物的核磁共振碳譜。

圖3 為本發(fā)明pyrrocidine A化合物的H,H-cosy二維譜。

圖4 為本發(fā)明pyrrocidine A化合物的HSQC二維譜。

圖5 為本發(fā)明pyrrocidine A化合物的HMBC二維譜。

圖6 為本發(fā)明pyrrocidine B化合物的核磁共振氫譜。

圖7 為本發(fā)明pyrrocidine B化合物的核磁共振碳譜。

圖8 為本發(fā)明pyrrocidine B化合物的H,H-cosy二維譜。

圖9 為本發(fā)明pyrrocidine B化合物的HSQC二維譜。

圖10 為本發(fā)明pyrrocidine B化合物的HMBC二維譜。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購(gòu)。

實(shí)施例1 大花綠絨蒿內(nèi)生真菌DH24的分離鑒定

1、菌株的分離

藏藥材大花綠絨蒿：由西藏自治區(qū)高原生物研究所陳彬等人采集于西藏自治區(qū)山南地區(qū)錯(cuò)那縣。

通過對(duì)新鮮的藏藥材大花綠絨蒿根部消毒，并削去外層根皮，切成小塊狀，無菌條件下接種到PDA培養(yǎng)基、Martin培養(yǎng)基或查氏培養(yǎng)基，室溫培養(yǎng)（15～25℃）以下培養(yǎng)5～20天，得到單菌落。

所得到的單菌落采用普通PDA培養(yǎng)基斜面4℃保藏。DH24菌落形態(tài)為土黃色短絨毛狀菌絲，背面為黃褐色，有孢子生成。

2、菌株的分離

采用CTAB法提取上述分離到的藏藥材內(nèi)生真菌單菌落的純培養(yǎng)的DNA，采用ITS間隔區(qū)的一對(duì)引物ITS1F和ITS4通過PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增ITS-rRNA基因片段，反應(yīng)體系為50 uL，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min,94℃變性40 s，52℃退火40 s，72℃延伸1 min，重復(fù)變性、退火和延伸三個(gè)步驟30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸補(bǔ)齊10 min。

通過葡聚糖凝膠電泳檢測(cè)確定目標(biāo)片段在600 bp左右，通過測(cè)序得出菌株的ITS-rRNA基因片段序列（如SEQ ID NO.1所示），在GenBank上通過BLAST在線比對(duì)搜索引擎對(duì)序列進(jìn)行相似性分析，得到最大相似度為99%的菌株，確定該菌株為Neonectria sp. 屬的真菌，命名為Neonectria sp.DH24，并于2016年9月23日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為GDMCC No：60081，保藏地址為廣州市先烈中路100號(hào)大院59號(hào)樓5樓。

實(shí)施例2 菌株DH24的發(fā)酵和Pyrrocidines類化合物的提取、分離純化

1、方案1：

采用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，在盛有已消毒的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的三角瓶中接入藏藥材內(nèi)生真菌DH24菌株的菌種，20～25℃靜置培養(yǎng)1個(gè)月，終止發(fā)酵。往每瓶發(fā)酵液中加入乙酸乙酯200 mL，將菌體殺死，用紗布過濾，分離菌體和發(fā)酵液，發(fā)酵液用乙酸乙酯（乙酸乙酯：發(fā)酵液（v/v）2:1）萃取3遍，旋蒸濃縮；菌體經(jīng)風(fēng)扇吹干后用甲醇浸提3～4遍，浸提液經(jīng)旋蒸濃縮后與發(fā)酵液的乙酸乙酯提取液合并。采用普通硅膠柱層析技術(shù)，用乙酸乙酯—石油醚體系（1:20,1:10,1:5,1:4,1:3,1:2,1:1,2:1,3:1,4:1）進(jìn)行洗脫，得到的1:1的組分，經(jīng)石油醚—乙酸乙酯重結(jié)晶，得到化合物Pyrrocidine B；母液經(jīng)HPLC純化，得到Bispyrrocidine；得到的1:2組分，經(jīng)進(jìn)一步分離純化，得到化合物Pyrrocidine A。

2、方案2：

采用大米固體培養(yǎng)基，在盛有大米固體培養(yǎng)基的三角瓶中接入藏藥材內(nèi)生真菌DH24菌株的菌種，20～25℃靜置培養(yǎng)1個(gè)月。往三角瓶中加入甲醇-乙酸乙酯-氯仿（v/v/v = 1:1:1）混合溶劑200 mL，浸提3～4遍，旋蒸濃縮浸提液。得到的浸膏經(jīng)普通硅膠柱層析技術(shù)，用乙酸乙酯—石油醚體系（1:20,1:10,1:5,1:4,1:3,1:2,1:1,2:1,3:1,4:1）進(jìn)行洗脫，得到的1:1的組分，經(jīng)石油醚—乙酸乙酯重結(jié)晶，得到化合物Pyrrocidine B；得到的1:2組分，經(jīng)進(jìn)一步分離純化，得到化合物Pyrrocidine A。

3、化合物的鑒定

化合物經(jīng)核磁共振氫譜、碳譜、HSQC、HMBC、HHCosy分析確定，與文獻(xiàn)比對(duì)（Haiyin He, Hui Y. Yang, Ramunas Bigelis, Eric H. Solum, Michael Greenstein and Guy T. Carter，Pyrrocidines A and B, new antibiotics produced by afilamentous fungus，Tetrahedron Letters 43 (2002) 1633–1636）確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)為pyrrocidine A，pyrrocidine B。其結(jié)構(gòu)如下式（I，II）所示，具體數(shù)據(jù)見圖1～10。

4、化合物活性測(cè)試

化合物的抗癌活性測(cè)試采用的是MTT法（方法參考：T. Mosmann. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of immunological methods.Journal of Immunological Methods 1983, 65, 55-63.）。

1、材料

（1）四脞鹽（MTT）：用0.01mol/L 的磷酸鹽緩沖液（PBS） 溶解MTT〔3，4,5-dimethythiazol-z-yl）2,5-diphenytetrazolium bromide,SIGMA〕終濃度5mg/ml，過濾除菌，分裝后4 ℃避光保存。

（2）MTT裂解液的配制：80g的十二烷基磺酸鈉溶解在200ml的N-N－二甲基甲酰胺中，水浴加熱助溶，加入200ml蒸餾水，用80%乙酸與1N鹽酸（1：1）混合調(diào)pH至4.7。

（3）細(xì)胞株選用：MDA-MB-435，HepG2，A549，HCT-116，A549 ，Calu-3腫瘤細(xì)胞株。于37 ℃下5%的CO₂含量的空氣中保藏。

2、操作步驟：

（1）單細(xì)胞懸液接種于96孔板（用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至1′10⁴/ml，每孔加入200ml稀釋好的細(xì)胞），37 ℃，5%CO₂，飽和濕度下培養(yǎng)24小時(shí)，（每組五個(gè)平行樣）；

（2）去除培養(yǎng)基，取新配制培養(yǎng)基按系列濃度制備A16藥物溶液，每孔200ml，培養(yǎng)48小時(shí)；

（3）每孔加入2mg/ml的MTT 20ml，孵育4小時(shí)；

（4）盡量完全的吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入DMSO液（150ml/孔），振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解；

（5）酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值，（l=570nm）；

（6）以吸收液對(duì)藥物濃度對(duì)數(shù)作圖，求出IC₅₀值。

2、結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表1所示：結(jié)果顯示，本發(fā)明提取得到的化合物pyrrocidine A和pyrrocidine B均具有明顯的抗腫瘤細(xì)胞活性。

表1

SEQUENCE LISTING

<110> 西藏自治區(qū)高原生物研究所，中山大學(xué)

<120> 一株大花綠絨蒿內(nèi)生真菌DH24及其生產(chǎn)Pyrrocidines類化合物的應(yīng)用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 549

<212> DNA

<213> 菌株DH24的ITS rDNA序列

<400> 1

gtgatctcgt tggtgaccag cggagggtca ttaccgagtt tacaactccc aaacccctgt 60

gaacatacct atcgttgcct cggcggtgcc cgctccggcg gcccgccaga ggacccccaa 120

actcttgttt tatacagtat cttctgagta acacgattaa ataaatcaaa actttcaaca 180

acggatctct tggttctggc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa 240

ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacat tgcgcccgcc agtattctgg 300

cgggcatgcc tgttcgagcg tcatttcaac cctcaagccc ccgggcttgg tgttggggat 360

cggcgtgccc tcgcggcgcg ccgtccccta aatctagtgg cggtctcgct gtagcttcct 420

ctgcgtagta gcaacactcg cactggatcg cagcgcggcc acgccgttaa accccccact 480

tctgaaagtt tgacctcgga tcaggtagga atacccgctg aacttaagca tatcaataag 540

gcggaggaa 549