本發(fā)明涉及微藻藻渣的回收利用和微藻培養(yǎng)，具體的說是通過水熱處理將微藻藻渣中的氮源、碳源等營養(yǎng)物質回收并通過適當稀釋用于螺旋藻培養(yǎng)生產富含多糖的生物質。可用于廢棄物資源化利用、廢水處理、螺旋藻培養(yǎng)及其生物質的生產以及以螺旋藻多糖為原料的食品、醫(yī)藥、能源等相關領域。

背景技術：

螺旋藻多糖是螺旋藻細胞內的一種水溶性多糖，具有抗腫瘤、抗輻射、抗突變等生物活性，能提高機體細胞和體液的免疫功能，抵制癌細胞增殖，減輕輻射所引起的遺傳損傷等，在防癌、抗衰老、增強機體免疫力等方面具有廣闊的應用前景。此外，螺旋藻多糖主要由葡萄糖殘基連接而成，經過水解后可用于發(fā)酵法生產生物乙醇、生物丁醇、生物氫、甲烷等生物能源，因此在微藻生物能源領域具有潛在應用價值。然而螺旋藻培養(yǎng)需要消耗大量營養(yǎng)鹽，而營養(yǎng)鹽的生產本身會消耗大量能量并釋放溫室氣體CO₂，造成環(huán)境污染。此外，大量的營養(yǎng)鹽需求(尤其是氮源)將使得微藻培養(yǎng)與農業(yè)生產形成營養(yǎng)鹽競爭，不利于微藻培養(yǎng)的可持續(xù)性。

微藻經過熱水提取水溶性活性物質或經過有機溶劑萃取提取油類物質作為生物能源原料后的藻渣含有不溶性蛋白質、多糖等有機物質和鐵、鎂、硫、磷等營養(yǎng)元素，經過進一步水熱處理得到氨基酸、多肽、氨氮、碳水化合物和礦物元素等物質可以作為微藻生長所需的氮源、碳源和微量元素來源。利用水熱處理液進行微藻培養(yǎng)，不僅回收利用了碳氮磷及礦物質等營養(yǎng)物質，降低營養(yǎng)鹽的消耗成本，同時也能減少廢物排放量，降低因直接排放而導致水體富營養(yǎng)化的風險，具有良好的經濟和環(huán)境效益。

藻渣水熱處理的方法主要有酸熱液化(Hydrothermal acid liquefaction)、中性水熱液化(Hydrothermal liquefaction)和水熱碳化(Hydrothermal carbonization，HTC)。酸熱水解液化所需溫度為100～110℃，常壓下進行回流即可，但需要加入鹽酸、硫酸或有機酸等，對設備耐腐蝕要求較高，不宜規(guī)模放大。水熱液化通常在250～400℃下進行，溫度較高，壓力較大，對能量輸入和設備要求較高。水熱碳化通常在150～225℃下進行，溫度和壓力均較適中，有利于工業(yè)放大。水熱碳化的固相殘渣中含有豐富的油脂和水熱碳，可以作為生物柴油和生物碳的原料。水熱碳化處理液中含有少量氨氮和大量有機氮源如氨基酸等，同時含有糖類、有機酸等碳源，在氮限制下大量有機氮源可以減慢螺旋藻對氮的吸收速率而積累大量多糖。因此HTC處理液是理想的螺旋藻多糖生產的營養(yǎng)來源。

技術實現要素：

本發(fā)明旨在提供一種回收利用微藻藻渣中的氮源、碳源和其他營養(yǎng)元素生產富含多糖螺旋藻的方法。為了實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為：

利用水熱碳化回收微藻藻渣中的營養(yǎng)物質至水熱碳化液，藻渣中75％以上的氮被回收；利用水熱碳化液回收的氮源、碳源和其他營養(yǎng)元素，完全替代常規(guī)的營養(yǎng)鹽(如硝酸鈉、尿素等)生產富含多糖的螺旋藻，其生物質中多糖含量達到65％以上，比常規(guī)的培養(yǎng)基提高15％～56％，多糖產率比常規(guī)的培養(yǎng)基提高23％到3.5倍；同時利用螺旋藻生產多糖的過程可以清除水熱碳化液中80％以上的無機氮和45％以上的有機氮。可按如下步驟具體操作：

1)藻渣的水熱碳化

將微藻藻渣與水充分混合攪拌浸潤后，調節(jié)固液質量比1:8～1:30置于不銹鋼高壓反應釜中，密封，通入氮氣吹掃2min以保持惰性氛圍；以1～3℃/min的速度加熱反應釜從室溫至195℃～210℃，恒溫2h～4h；用冷卻循環(huán)水以2～6℃/min的速度冷卻反應釜至室溫，打開放氣閥釋放殘余氣體，將反應液與固相殘渣分離，用0.01-2倍反應液體積的水清洗固相殘渣，并收集合并固液分離后的反應液和清洗液，得到水熱碳化液；

步驟1)所述的微藻藻渣可以為冷凍干燥、噴霧干燥或太陽下自然曬干的干燥固體，也可以為濕藻渣漿；微藻藻渣來自于下述方法中的一種或二種以上混合：1)微藻經過水浸提后固液分離得到的固體藻渣；2)微藻經過有機溶劑萃取后固液分離得到的固體藻渣；3)微藻先經過水浸提后固液分離得到的固體A、固體A再經過有機溶劑萃取后固液分離得到的固體藻渣；4)微藻先經過有機溶劑萃取和固液分離得到的固體A，固體A再經過水浸提后固液分離得到的固體藻渣；所述有機溶劑為氯仿、正己烷、甲醇和乙醇中的一種或二種以上；所述微藻為螺旋藻、集胞藻、聚球藻、湛江等鞭金藻、亞心形四爿藻、微擬球藻、三角褐指藻、萊茵衣藻、小球藻、雨生紅球藻、柵藻、綠球藻中的一種或二種以上；

步驟1)所述與微藻藻渣混合的水和清洗反應固相殘渣的水可以為自來水、地下水、純凈水或蒸餾水，也可以為微藻培養(yǎng)收獲后的廢水、水提分離純化水溶性活性物質和生物能源原料后的殘余廢水中的一種或二種以上的混合。

步驟1)所述的反應液與固相殘渣分離的方法為重力過濾、膜過濾、離心中的一種或二種以上的組合。

2)水熱碳化液作為營養(yǎng)液培養(yǎng)螺旋藻

將螺旋藻藻種液經離心或過濾洗滌后得到的藻泥接入無機鹽培養(yǎng)基中，并調整初始接種密度OD₅₆₀為0.3～0.5；或原螺旋藻藻種液經無機鹽培養(yǎng)基直接稀釋至初始接種密度OD₅₆₀為0.3～0.5；向接種后的藻液中添加水熱碳化液，使藻液培養(yǎng)基中的初始總氮濃度控制在10～30mg/L；溫度20～35℃，pH值8～12，自然條件下光照或人工光暗比12h:12h～24h:0h光照，培養(yǎng)液受光面光照強度30～3000μmol/(m²·s)，培養(yǎng)至對數生長后期或穩(wěn)定期收獲螺旋藻細胞。

步驟2)所述無機鹽培養(yǎng)基中每升水體含：NaHCO₃ 3～20g，NaNO₃ 0～18mg，KCl 0～1g，MgSO₄·7H₂O 0～0.1g，CaCl₂·2H₂O 0～0.1g，H₃PO₄(85％w/w)0～0.1g，FeSO₄·7H₂O 0～0.05g，H₃BO₃ 0～3mg，MnCl₂·4H₂O 0～2mg， Na₂MoO₄·2H₂O 0～0.5mg，ZnSO₄·7H₂O 0～0.3mg，CuSO₄·5H₂O 0～0.3mg。

步驟2)所述螺旋藻藻種液為采用上述無機鹽培養(yǎng)基或Zarrouk培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的螺旋藻液，也可以是經過步驟2)所述的培養(yǎng)至對數生長后期或穩(wěn)定期收獲的螺旋藻液，螺旋藻液中的螺旋藻其蛋白質含量占干重的20％～70％，碳水化合物含量占干重的5％～70％，其余成分主要為脂質、核酸和灰分。

步驟2)所述無機鹽培養(yǎng)基的水體來源為天然鹽堿水、地下水、自來水或經步驟2)所述的藻細胞收獲后的廢水中的一種或二種以上的混合。

本發(fā)明與現有技術相比具有如下優(yōu)點：

1.提高氮源利用率，節(jié)約螺旋藻培養(yǎng)成本：利用水熱碳化回收微藻藻渣中的營養(yǎng)物質，氮回收率達到75％以上；以水熱碳化液作為螺旋藻培養(yǎng)的氮源、碳源和其他營養(yǎng)元素，可以完全替代常規(guī)的營養(yǎng)鹽供給(如硝酸鈉、尿素等)，降低營養(yǎng)鹽消耗成本，提高單位營養(yǎng)鹽投入的產品產出；同時將藻渣進行廢物資源化循環(huán)利用，有利于提高元素的利用效率，實現“原子經濟”。

2.螺旋藻多糖產率和含量明顯提高：利用添加了適當稀釋的水熱碳化液的培養(yǎng)基培養(yǎng)螺旋藻，生物質中多糖含量比常規(guī)的培養(yǎng)基(如添加硝酸鈉)提高15％～56％，多糖產率提高23％到3.5倍。

3.螺旋藻生產的可持續(xù)性好：利用天然鹽堿水培養(yǎng)并循環(huán)利用采收廢水，可以節(jié)約淡水資源，減少污水排放，降低因直接排放而導致水體富營養(yǎng)化的風險，同時可以在不適合糧食種植和人類居住的堿湖附近進行培養(yǎng)，不占用耕地，具有良好的經濟和環(huán)境效益。

4.實現含氮廢水的高效處理：本發(fā)明涉及的螺旋藻培養(yǎng)過程可以清除培養(yǎng)水體中80％的氨氮和硝態(tài)氮以及超過45％的有機氮，在廢水處理領域具有廣泛的應用前景。

總之，本發(fā)明實現了廢物的資源化利用，減少了營養(yǎng)鹽消耗，在提升螺旋藻多糖產率和品質的同時節(jié)約了生產成本，同時有利于簡化下游加工操作，促進螺旋藻的產業(yè)化生產，可廣泛應用于以螺旋藻多糖為原料的食品、醫(yī)藥、能源等相關領域。

附圖說明

圖1為以高蛋白質低碳水化合物含量(蛋白質含量42％、碳水化合物含量16％)的螺旋藻為藻種，利用水熱碳化液作為氮源和部分碳源在氮限制條件下培養(yǎng)螺旋藻所獲得的多糖含量和產量。

圖2為以低蛋白質高碳水化合物含量(蛋白質含量22％、碳水化合物含量53％)的螺旋藻為藻種，利用水熱碳化液作為氮源和部分碳源在氮限制條件下培養(yǎng)螺旋藻所獲得的多糖含量、產量和氮清除效率。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明的方法和結果進行說明。本發(fā)明將經過水提或有機溶劑萃取后的微藻藻渣進行水熱碳化，得到的水熱碳化液(HTC aqueous phase,HTCAP)經過適當稀釋得到一定總氮濃度的培養(yǎng)基，用于螺旋藻的培養(yǎng) 并生產富含多糖的生物質。

實施例1

以高蛋白質低碳水化合物含量(蛋白質含量42％、碳水化合物含量16％)的螺旋藻為藻種，利用水熱碳化液作為氮源和部分碳源在氮限制條件下培養(yǎng)螺旋藻，生產富含多糖的生物質。

1)在2L不銹鋼高壓反應釜內，加入1.8L去離子水，將在80℃熱水下提取4h后的高糖螺旋藻(碳水化合物含量44％)藻渣180g緩慢加入反應器中，得到固液質量比為1:10的均勻藻漿。密封反應器，通入氮氣吹掃2min以保持惰性氛圍。以1.5℃/min的速度加熱反應釜至200℃，恒溫3h。用冷卻循環(huán)水以3℃/min的速度冷卻反應釜至室溫。打開放氣閥釋放殘余氣體，將反應液用300目的尼龍纖維布過濾，并用300mL去離子水清洗反應器和濾餅，收集濾液得到HTCAP，其總氮濃度達到5741mg/L，氮回收率為78％，-20℃凍存。

2)螺旋藻藻種細胞在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基(Zarrouk)中培養(yǎng)，培養(yǎng)基用去離子水配制，每升水體含：NaHCO₃ 16.8g，K₂HPO₄ 0.5g，NaNO₃ 2.5g，K₂SO₄ 1g，NaCl 1g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，CaCl₂·2H₂O 0.04g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，H₃BO₃2.86mg，MnCl₂·4H₂O 1.86mg，ZnSO₄·7H₂O 0.22mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.39mg，CuSO₄·5H₂O 0.08mg。初始接種密度OD₅₆₀為0.3，培養(yǎng)溫度26～30℃，人工光暗比14h:10h，培養(yǎng)液受光面光照強度40μmol/(m²·s)，培養(yǎng)6天至對數生長期，用300目的尼龍纖維布過濾得到藻泥，用50mL無機鹽培養(yǎng)基(MSM，去離子水配制，每升水體含：NaHCO₃ 6g，KCl 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.03g，CaCl₂·2H₂O 0.04g，H₃PO₄(85％w/w)0.03g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，H₃BO₃ 2.86mg，MnCl₂·4H₂O 1.86mg，ZnSO₄·7H₂O 0.22mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.39mg，CuSO₄·5H₂O 0.08mg)洗滌2次后重懸于MSM中，調整初始接種密度OD₅₆₀為0.3，向藻液中加入水熱碳化液，控制初始總氮濃度在15mg/L，并以相同總氮濃度的NaNO₃為對照；溫度25℃，pH值8～9，人工光暗比14h:10h，培養(yǎng)液受光面光照強度40μmol/(m²·s)，培養(yǎng)至第6天收獲。

由圖1可以看出，利用稀釋后的HTCAP作為氮源和部分碳源，在氮限制的條件下進行混合營養(yǎng)(mixotrophic)培養(yǎng)螺旋藻，6天內多糖平均含量和產率分別達到73％和81mg/L/d，比常規(guī)用NaNO₃作為氮源進行光合自養(yǎng)(photoautotrophic)培養(yǎng)分別提高15％和23％。

此實施例說明，利用HTC回收熱水提取后的螺旋藻藻渣中的氮源和碳源，在氮限制條件下利用HTCAP完全替代常規(guī)硝態(tài)氮源，以高蛋白質低碳水化合物含量的螺旋藻為藻種進行培養(yǎng)，其多糖含量和產率均明顯提高。

實施例2

以低蛋白質高碳水化合物含量(蛋白質含量22％、碳水化合物含量53％)的螺旋藻為藻種，利用水熱碳化液作為氮源和部分碳源在氮限制條件下培養(yǎng)螺旋藻，生產富含多糖的生物質，同時清除培養(yǎng)基中的大部分氨氮和部分有機氮。

1)水熱碳化回收藻渣中的營養(yǎng)物質過程與實施例1相同。

2)螺旋藻藻種螺旋藻藻種細胞在營養(yǎng)脅迫的無機鹽培養(yǎng)基(MSM)中培養(yǎng)，控制初始NaNO₃濃度為85mg/L，初始接種密度OD₅₆₀為0.3，培養(yǎng)溫度26～30℃，人工光暗比14h:10h，培養(yǎng)液受光面光照強度40μmol/(m²·s)，培養(yǎng)6天后藻細胞處于氮饑餓狀態(tài)，用300目的尼龍纖維布過濾得到藻泥，用50mL無機鹽培養(yǎng)基(MSM)洗滌2次后重懸于MSM中，調整初始接種密度OD₅₆₀為0.3，向藻液中加入水熱碳化液，控制初始總氮濃度在15mg/L，并以相同總氮濃度的NaNO₃為對照；溫度25℃，pH值8～9，人工光暗比14h:10h，培養(yǎng)液受光面光照強度40μmol/(m²·s)，培養(yǎng)至第3天收獲。

由圖2可以看出，利用稀釋后的HTCAP作為氮源和部分碳源，在氮限制的條件下進行混合營養(yǎng)(mixotrophic)培養(yǎng)螺旋藻，3天內多糖平均含量和產率分別達到65％和58mg/L/d，比常規(guī)用NaNO₃作為氮源進行光合自養(yǎng)(photoautotrophic)培養(yǎng)分別提高56％和3.6倍。氨氮的清除率達到總氮(TN)的80.4％，有機氮的清除率達到47.0％。

此實施例說明，利用HTC回收熱水提取后的螺旋藻藻渣中的氮源和碳源，在氮限制條件下利用HTCAP完全替代常規(guī)硝態(tài)氮源，以低蛋白質高碳水化合物含量的螺旋藻為藻種進行培養(yǎng)，其多糖含量和產率均明顯提高的同時可以清除80％以上的氨氮和45％以上的有機氮，在廢水處理領域具有廣泛的應用前景。