本發(fā)明涉及真菌培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種產(chǎn)玫瑰香味真菌的培育方法。

背景技術(shù)：

微生物技術(shù)是目前最有前途的生產(chǎn)天然食品、化妝品等香料方法之一(Najla_Ben_Akachaa_etal2015；Gatfield_I.L.1999；趙麗青2006)，受到世界各國研究者和生產(chǎn)商的重視，進行產(chǎn)香微生物技術(shù)研究是順應(yīng)香料工業(yè)和生物技術(shù)發(fā)展的大趨勢，與動植物提取法相比大大降低成本和生產(chǎn)周期，具有安全、環(huán)保的特點。

目前已報道的產(chǎn)香微生物主要包含真菌(酵母菌、綠色木霉、尖孢鐮刀菌等)、細菌(芽孢桿菌、惡臭假單胞菌等)(李倩等，2009；羅建超，謝和，2012)，美國Ginkgo Bioworks公司完成B輪融資4500萬美元，用于包括開發(fā)產(chǎn)香酵母提取香精香料。本發(fā)明提出的一株產(chǎn)生玫瑰香味的根串珠霉真菌，利用GC-MS聯(lián)用技術(shù)鑒定其揮發(fā)性香氣物質(zhì)組成。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點，而提出的一種產(chǎn)玫瑰香味真菌的培育方法。

一種產(chǎn)玫瑰香味的真菌，由本發(fā)明人員從七彩竹芋上分離得到，具有濃郁玫瑰香味的菌株，菌株編號為QCZY15，所述產(chǎn)玫瑰香味的真菌為根串珠霉Thielavioides thielavioides，Genebank注冊號：KT963166.1，所述產(chǎn)玫瑰香味的真菌培育方法，包括以下步驟：

S1、將菌株QCZY15接種在PSA培養(yǎng)基上，并置于25℃下恒溫培養(yǎng)14d；

S2、將步驟S1中的培養(yǎng)基切碎，裝入固相微萃取瓶中，將平衡后的DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭插入萃取瓶中，壓下活塞使纖維頭伸出，暴露于樣品上層空氣中，40℃條件下固相微萃取1小時，提取香氣成分。

優(yōu)選的，所述步驟S1中的PSA培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯200g、瓊脂粉17g、蔗糖20g和水1000ml。

優(yōu)選的，所述產(chǎn)玫瑰香味的真菌揮發(fā)性物質(zhì)組成包括：乙酸異丁酯含量47.57％；乙酸乙酯13.45％；苯乙烯4.55％；香茅醇2.50％；乙酸香茅酯1.10％。

本發(fā)明提出的一種產(chǎn)玫瑰香味真菌的培育方法，操作簡單，操作成本低、周期短，安全環(huán)保的特點，本發(fā)明培育的產(chǎn)玫瑰香味的真菌為根串珠霉，Genebank注冊號：KT963166.1，其產(chǎn)生的香氣代謝產(chǎn)物中，乙酸乙酯具有類似于果香和酒香的味道，乙酸異丁酯有水果味道，苯乙烯、苯乙醇具有類似于玫瑰香的味道，香茅醇、乙酸香茅酯均具有花香的味道。

附圖說明

圖1為菌株QCZY15總離子流色譜圖；

圖2為菌株QCZY15真菌形態(tài)圖。

具體實施方式

參照圖1-2，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步解說。

實施例一

本發(fā)明提出的一種產(chǎn)玫瑰香味的真菌，由本發(fā)明人員從七彩竹芋上分離得到，具有濃郁玫瑰香味的菌株，菌株編號為QCZY15，所述產(chǎn)玫瑰香味的真菌為根串珠霉Thielavioides thielavioides，Genebank注冊號：KT963166.1，所述產(chǎn)玫瑰香味的真菌培育方法，包括以下步驟：

S1、將菌株QCZY15接種在PSA培養(yǎng)基上，并置于25℃下恒溫培養(yǎng)14d，其中PSA培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯200g、瓊脂粉17g、蔗糖20g和水1000ml；

S2、將步驟S1中的培養(yǎng)基切碎，裝入固相微萃取瓶中，將平衡后的DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭插入萃取瓶中，壓下活塞使纖維頭伸出，暴露于樣品上層空氣中，40℃條件下固相微萃取1小時，提取香氣成分。

產(chǎn)玫瑰香味的真菌揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS分析條件為：色譜條件：色譜柱為DB-wax石英毛細管色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm)，程序升溫，柱初溫40℃，保持5min，以5℃的升溫速率升至200℃，再以10℃的升溫速率升至240℃，保持5min；載氣為高純氦氣，流速1.0mL/min；進樣模式為分流進樣，分流比為10:1；質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70eV，掃描范圍33-350amu(如圖1)。

產(chǎn)香真菌揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS分析結(jié)果：產(chǎn)香真菌在PSA培養(yǎng)基上第5天開始產(chǎn)香，14天左右香氣濃度達到最大；利用GC-MS技術(shù)，從該菌揮發(fā)性成分中鑒定出14種主要化合物；分別為乙酸異丁酯含量47.57％；乙酸乙酯13.45％；苯乙烯4.55％；香茅醇2.50％；乙酸香茅酯1.10％。乙酸乙酯(Ethyl Acetate)與乙酸異丁酯(Isobutyl acetate)二者之和占揮發(fā)性物質(zhì)總量61.02％；其中乙酸乙酯具有類似于果香和酒香的味道，乙酸異丁酯有水果味道。苯乙烯、苯乙醇具有類似于玫瑰香的味道，香茅醇、乙酸香茅酯均具有花香的味道。

菌株QCZY15定性分析結(jié)果如下：

菌株QCZY15香氣成分表如下：

實施例二

本發(fā)明提出的一種產(chǎn)玫瑰香味的真菌，由本發(fā)明人員從七彩竹芋上分離得到，具有濃郁玫瑰香味的菌株，菌株編號為QCZY15，所述產(chǎn)玫瑰香味的真菌為根串珠霉Thielavioides thielavioides，Genebank注冊號：KT963166.1，其分子鑒定實驗，包括以下步驟：

S1、病原菌DNA的提?。夯蚪MDNA提取采用chelex-100法快速提取真菌DNA，并置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

S2、核糖體rDNA-ITS區(qū)段擴增：以病菌基因組rDNA為模板進行PCR擴增，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，擴增循環(huán)反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性95s；94℃變性35s，52℃退火60s，72℃延伸60s；35個循環(huán)；最終72℃延伸15min，4℃保存，ITS-PCR擴增反應(yīng)在25μL反應(yīng)體系中進行(見下表)：

引物：ITS1F 5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′

ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′

S3、取2μL PCR擴增產(chǎn)物和3μL核酸染料混合，于1.2％的瓊脂糖凝膠上電泳檢測，電泳緩沖液為0.5x TBE，在120V電壓下進行45min，置于UPV紫外成像系統(tǒng)上觀察成像，并拍照；

S4、PCR產(chǎn)物測序和序列分析：將PCR擴增產(chǎn)物送華大基因公司進行正反雙向測序，測序結(jié)果在GenBank(http://www.ncbi.nih.gov)中進行BLAST比對分析。

rDNA-ITS產(chǎn)物測序結(jié)果：基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)引物對(ITS1F和ITS4)擴增到600bp左右的基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)及核糖體RNA基因片段。由北京三博遠志生物技術(shù)有限公司對rDNA–ITS擴增產(chǎn)物進行了雙向測序。結(jié)果在NCBI上進行對比，結(jié)果表明所擴增的片段與GenBank中已發(fā)表的根串珠霉Thielavioides thielavioides基因AF275486、AF275487的同源性達到了100％。從分子水平證明該真菌就是根串珠霉Thielavioides thielavioides。Genebank注冊號：KT963166.1。

實施例三

本發(fā)明提出的一種產(chǎn)玫瑰香味的真菌，由本發(fā)明人員從七彩竹芋上分離得到，具有濃郁玫瑰香味的菌株，菌株編號為QCZY15，所述產(chǎn)玫瑰香味的真菌為根串珠霉Thielavioides thielavioides，Genebank注冊號：KT963166.1，其形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果為：在PSA培養(yǎng)基上恒溫培養(yǎng)14d后，直徑為64mm，菌絲初為白色，后變?yōu)榈G色，最后白化為菌落表面白色；圓柱狀分生孢子(25.5-54.1)μm×(4.3-5.5)μm，圓筒狀分生孢子直徑為(5.1-6.4)μm；厚垣孢子為厚壁橢圓形棕褐色，其大小為(13.6-15.8)μm×(10.7-12.3)μm(如圖2)。

本發(fā)明提出的一種產(chǎn)玫瑰香味真菌的培育方法，操作簡單，操作成本低、周期短，安全環(huán)保的特點，本發(fā)明培育的產(chǎn)玫瑰香味的真菌為根串珠霉Thielavioides thielavioides，Genebank注冊號：KT963166.1，其產(chǎn)生的香氣代謝產(chǎn)物中，乙酸乙酯具有類似于果香和酒香的味道，乙酸異丁酯有水果味道，苯乙烯、苯乙醇具有類似于玫瑰香的味道，香茅醇、乙酸香茅酯均具有花香的味道。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。