本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

類芽孢桿菌屬的很多微生物對(duì)植物具有防病作用和促生作用，因此在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有很好的應(yīng)用潛力。類芽孢桿菌可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，如酶、抗菌物質(zhì)、植物激素以及絮凝劑等，這些活性物質(zhì)大多為蛋白質(zhì)、多糖、多肽等。

多粘類芽孢桿菌由于其具植物防病和植物促生作用，對(duì)人畜安全和無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)而受到重視，美國(guó)環(huán)保署(EPA)將其列為可在商業(yè)上應(yīng)用的微生物之一。多粘類芽孢桿菌代謝產(chǎn)物中含有多種可利用的生物活性物質(zhì)。這些活性物質(zhì)按其結(jié)構(gòu)分為多糖、多肽和蛋白質(zhì)等，此外還有糖蛋白、核苷類似物、吡嗪類、醇醛酸等。按其功能劃分，主要是抗生素、酶類、植物激素和絮凝劑等，另外還產(chǎn)生具有抗氧化、刺激免疫等功能的物質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中缺少能夠產(chǎn)生高效抑菌物質(zhì)的多粘類芽孢桿菌這一問題，提供了一種多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用。本發(fā)明多粘類芽孢桿菌能夠產(chǎn)生具有廣譜、高抑菌效果的抑菌物質(zhì)，并且對(duì)酸堿和溫度不敏感，且在堿性條件下抑菌活性大于酸性，對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌具有明顯的抑制作用。

本發(fā)明技術(shù)方案之一：一種多粘類芽孢桿菌，其保藏編號(hào)為CGMCC No.10062。

本發(fā)明中，所述多粘類芽孢桿菌已于2014年11月26日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編：100101，保藏編號(hào)為：CGMCC No.10062，培養(yǎng)物名稱是BD3736，分類命名是Paenibacillus polymyxa。

本發(fā)明技術(shù)方案之二：一種培養(yǎng)多粘類芽孢桿菌CGMCC No.10062的方法，其包括下述步驟：將多粘類芽孢桿菌CGMCC No.10062接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

本發(fā)明中，所述培養(yǎng)可以是各種微生物的培養(yǎng)方式，包括液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)、半固體培養(yǎng)等，可以是振蕩培養(yǎng)，也可以是發(fā)酵罐深層發(fā)酵，較佳地為振蕩培養(yǎng)。所述振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速可以為本領(lǐng)域常規(guī)的轉(zhuǎn)速，較佳地為180轉(zhuǎn)/分鐘。

本發(fā)明中，所述培養(yǎng)的溫度可以為本領(lǐng)域常規(guī)的溫度，較佳地為25-35℃，更佳地為30℃。

本發(fā)明中，所述培養(yǎng)的時(shí)間可以為本領(lǐng)域常規(guī)的時(shí)長(zhǎng)，較佳地為1-7天，更佳地為4-6天，最佳地為5天。

本發(fā)明中，所述培養(yǎng)基可以為本領(lǐng)域培養(yǎng)類芽孢桿菌的常規(guī)的培養(yǎng)基，包括液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，較佳地為選自PDA培養(yǎng)基、TYC培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基和牛乳中的一種，更佳地為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。所述牛乳可以為本領(lǐng)域常規(guī)的牛乳，較佳地為全脂牛乳和/或脫脂牛乳，更佳地為脫脂牛乳。所述牛乳的固形物含量可以為本領(lǐng)域常規(guī)的含量，較佳地為2-15％，更佳地為10-15％，最佳地為10％，所述百分比為所述固形物的質(zhì)量占所述牛乳體積的質(zhì)量體積百分比。

本發(fā)明技術(shù)方案之三：多粘類芽孢桿菌CGMCC No.10062在制備抑菌物質(zhì)中的應(yīng)用。

本發(fā)明中，所述抑菌物質(zhì)可以抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌。所述革蘭氏陰性菌較佳地包括大腸桿菌(Escherichia coli)、福氏志賀氏菌(Shigella flexneri)及腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)；所述革蘭氏陽(yáng) 性菌較佳地包括單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、藤黃小球菌(Micrococcus luteus)及枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明提供了一種多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用。通過培養(yǎng)本發(fā)明多粘類芽孢桿菌，能夠獲得一種具有廣譜、高抑菌效果的抑菌物質(zhì)，對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌具有明顯的抑制作用。

生物材料保藏信息

本發(fā)明的多粘類芽孢桿菌BD3736，已于2014年11月26日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編：100101，保藏編號(hào)為：CGMCC No.10062，培養(yǎng)物名稱是BD3736，分類命名是Paenibacillus polymyxa。

附圖說明

圖1為本發(fā)明述抑菌的類芽孢桿菌發(fā)酵液提取物對(duì)指示菌的抑制作用。

圖2為本發(fā)明所述抑菌的類芽孢桿菌發(fā)酵液提取物經(jīng)Sephadex G-15柱層析后不同收集管在280nm處的紫外吸收結(jié)果。

圖3為本發(fā)明所述抑菌的類芽孢桿菌發(fā)酵液提取物經(jīng)Sephadex G-15柱層析后不同收集管洗脫液對(duì)沙門氏菌的抑菌活性。

圖4為本發(fā)明所述抑菌的類芽孢桿菌發(fā)酵液提取物經(jīng)Sephadex G-15柱層析后不同收集管洗脫液蛋白含量。

圖5為本發(fā)明所述抑菌的類芽孢桿菌發(fā)酵液提取物經(jīng)Sephadex G-15柱層析后不同收集管洗脫液經(jīng)硫酸銨沉淀后，SDS-PAGE電泳結(jié)果。其中，M：蛋白Marker；23-26代表Sephedx G-15柱層析的收集管號(hào)。

圖6為本發(fā)明所述抑菌的類芽孢桿菌發(fā)酵液提取物經(jīng)SDS-PAGE電泳后各條帶對(duì)腸炎沙門氏菌的抑菌效果。

圖7為本發(fā)明所述抑菌的類芽孢桿菌發(fā)酵液提取物對(duì)不同溫度處理的穩(wěn)定性。

圖8為本發(fā)明所述抑菌的類芽孢桿菌發(fā)酵液提取物不同酸堿度處理的穩(wěn)定性。圖中豎坐標(biāo)為R²-r²(R為樣品加入不同pH緩沖液所產(chǎn)生的抑菌圈半徑，r為不同pH緩沖液所產(chǎn)生的抑菌圈半徑)。

圖9為本發(fā)明所述抑菌的類芽孢桿菌發(fā)酵液提取物對(duì)不同酶處理的穩(wěn)定性。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇

本發(fā)明所用到的培養(yǎng)基成分如下：

TYC培養(yǎng)基：胰胨(或酪朊水解物)1.5g；酵母膏0.5g；L-胱氨酸0.02g；乙酸鈉2.0g；Na₂SO₄0.01g；NaCl 0.1g；蔗糖5.0g；蒸餾水100m L；115℃，殺菌15min。

TYC固體培養(yǎng)基：上述TYC培養(yǎng)基另加入1.8g瓊脂。

LB培養(yǎng)基：胰胨(或酪朊水解物)1g；酵母膏0.5g；NaCl 0.5g，水100mL，115℃，殺菌15min。

LB固體培養(yǎng)基：上述LB培養(yǎng)基加入1.8g瓊脂。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯浸粉，0.5g；葡萄糖，2.0g；氯霉素，0.1g；蒸餾水100m L，115℃，殺菌15min。

PDA固體培養(yǎng)基：上述PDA培養(yǎng)基加入1.8g瓊脂。

BHI培養(yǎng)基：胰胨(或酪朊水解物)1g；酵母膏0.5g；NaCl 0.5g，水100mL，115℃，殺菌15min。

糖發(fā)酵肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)買自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

本發(fā)明中所用到的菌種：

大腸桿菌(Escherichia coli)、福氏志賀氏菌(Shigella flexneri)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、藤黃小球菌(Micrococcus luteus)及枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)均購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。

本發(fā)明中所用到的試劑：

基因組DNA提取試劑盒；購(gòu)自天根生化科技有限公司。KOD plus與KOD plus 10×緩沖液(不含氯化鎂)購(gòu)自東洋紡(Toyobo)公司。

引物由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

本發(fā)明中所述的室溫是指進(jìn)行試驗(yàn)的操作間的溫度，一般為25℃。

以下實(shí)施例中，所述各種牛乳的固形物含量百分比為所述牛乳中的固形物質(zhì)量占所述牛乳體積的質(zhì)量體積百分比。

實(shí)施例1 BD3736菌株的分離

取上海的農(nóng)家腌制泡菜，以無(wú)菌方式取1g，放入10mL無(wú)菌生理鹽水搗碎，用無(wú)菌生理鹽水系列稀釋，通過涂布的方式將稀釋液均勻涂布于固體TYC培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24-48小時(shí)。選取粘鼻涕狀、具有良好拉絲性的單菌落多個(gè)，分別轉(zhuǎn)接到新的固體TYC培養(yǎng)基上，得到純化的菌落，其中之一即為BD3736菌株。

實(shí)施例2 BD3736菌株的鑒定

1、形態(tài)學(xué)鑒定

將實(shí)施例1分離得到的BD3736菌株接種到LB固體培養(yǎng)基、含有0.001％溶菌酶的LB固體培養(yǎng)基、含有3％NaCl的LB固體培養(yǎng)基和PDA固體培養(yǎng)基上，所述百分比為占所述LB固體培養(yǎng)基或所述PDA固體培養(yǎng)基質(zhì)量的質(zhì)量百分比。大氣條件下培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)18h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且菌落大小穩(wěn)定時(shí)，進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，主要包括氧利用、菌落的大小、顏色、透明度、濕 潤(rùn)度、菌落表面狀態(tài)(是否平坦、突起、褶皺、凹陷等)、菌落邊緣狀態(tài)(是否整齊、不規(guī)則、放射狀等)。

結(jié)果顯示，所述BD3736菌株兼性好氧，在0.001％的溶菌酶或者3％NaCl中不生長(zhǎng)，在LB固體培養(yǎng)基上呈薄層、似變形蟲的移動(dòng)擴(kuò)散狀；在PDA固體培養(yǎng)基上為大型粘液狀，乳白至淺黃色，表面光滑，中央常有小突起。

進(jìn)一步對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BD3736菌株經(jīng)涂片后進(jìn)行美藍(lán)染色、芽孢染色和革蘭氏染色，光鏡下觀察菌體和芽孢形態(tài)及革蘭氏染色特性。結(jié)果表明，菌體桿狀，芽孢膨大，呈橢圓形，位于菌體的中間，革蘭氏染色陽(yáng)性。

2、生理生化特征分析

采用常規(guī)方法對(duì)BD3736菌株進(jìn)行生理生化特性分析，試驗(yàn)項(xiàng)目及其結(jié)果見表1。

表1 BD3736菌株的理化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1)取180mm×16mm的試管，每試管中加糖發(fā)酵肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基，高壓滅菌，分別加入0.22μm的膜過濾的糖，使其終濃度為50mM；

2)挑取LB平板培養(yǎng)的的多粘類芽孢桿菌BD3736菌株2-3環(huán)接入30mLLB培養(yǎng)基中，置于30℃下，180r/min振蕩培養(yǎng)18h。無(wú)菌條件下12000rpm離心10min收集菌體。用生理鹽水0.9％(w/v)NaCl洗滌2次，重懸于1mL糖發(fā)酵肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

3)往步驟1)試管中接種10μL步驟2)重懸于1mL糖發(fā)酵肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基的BD3736菌株，30℃培養(yǎng)24h，48h觀察菌株的生長(zhǎng)狀況并檢測(cè)菌株的糖發(fā)酵結(jié)果。結(jié)果見表2所示。

表2菌株糖發(fā)酵鑒定結(jié)果

“+”表示利用糖產(chǎn)酸，“-”表示不產(chǎn)酸。

結(jié)果顯示，上述BD3736菌株的生理生化特征跟Paenibacillus polymyxa的模式菌株一致，認(rèn)為其屬于Paenibacillus polymyxa。

3、16s rDNA序列同源性分析

挑取如上所述LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的BD3736菌株2-3環(huán)接入30mL LB培養(yǎng)基中，置于30℃下，180r/min振蕩培養(yǎng)18h。取5mL菌液12000rpm離心10min收集菌體。按基因組DNA提取試劑盒說明書上的方法提取BD3736菌株的基因組DNA作為基因擴(kuò)增模板，以細(xì)菌16s rDNA通用引物，27f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492r：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：KOD plus10×緩沖液(不含氯化鎂)2.5μL、MgSO₄1.5μL，KOD plus 0.5μL，2mM dNTP 2.5μL、ddH₂O 16μL、10μM引物27f 1μL、10μM引物1492r 1μL、模板DNA 1μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；30個(gè)循環(huán)(94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min)，72℃延伸8min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目標(biāo)條帶測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如序列表SEQ ID NO.1所示。所得序列通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在線Blast比對(duì)。結(jié)果顯示，本發(fā)明BD3736菌株16s rDNA序列與多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CF05最接近，相似性為99％，故認(rèn)為BD3736菌株屬于Paenibacillus polymyxa。

4、pheS基因序列同源性分析

以上述步驟中提取的BD3736基因組DNA作為基因擴(kuò)增模板，以細(xì)菌pheS引物，pheS-f：5’-atgagcgaaaccatccaaatg-3’，pheS-r：5’-ttattgacgcgcaaactgctt-3’進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：KOD plus10×緩沖液(不含氯化鎂)2.5μL、MgSO₄1.5μL，KOD plus 0.5μL，2mM dNTP 2.5μL、ddH₂O 16μL、10μM引物pheS-f 1μL、10μM引物pheS-r 1μL、模板DNA 1μL。 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；30個(gè)循環(huán)(94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min)；72℃延伸8min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目標(biāo)條帶送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如序列表SEQ ID NO.2所示。所得序列通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在線Blast比對(duì)。結(jié)果顯示，上述BD3736菌株的pheS基因序列與Paenibacillus polymyxa strain CF05相似性最高，但相似性僅為98％，故兩者屬于不同菌株。

實(shí)施例3 多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)BD3736來源的抗菌物質(zhì)的提取

1、BD3736菌株的培養(yǎng)

取20％甘油保存的BD3736菌株，接種到LB固體培養(yǎng)基上，在大氣條件下30℃恒溫箱中48h。然后，刮取一環(huán)單菌落于15mL固形物含量為10％滅菌脫脂牛乳中，30℃、180r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24h，制得BD3736菌株種子發(fā)酵液。

在500mL三角瓶中裝入130mL固形物含量為10％滅菌脫脂牛乳，將上述BD3736菌株種子發(fā)酵液按照4％(v/v)的接種量接種，30℃、180r/min恒溫振蕩5天，得BD3736菌株發(fā)酵液。

2、BD3736菌株發(fā)酵液提取物的制備

將如上所述BD3736菌株發(fā)酵液在60℃下水浴10min，冷卻至室溫，9000r/min，離心25min，收集上清液。在磁力攪拌的作用下，緩慢加入硫酸銨粉末，使鹽離子終飽和度達(dá)到80％，所述百分比為所述鹽的質(zhì)量占所述上清液和鹽的總體積的質(zhì)量體積百分比，過夜沉淀。然后9000r/min離心25min，收集沉淀物。將上述沉淀物重懸入去離子水中，即得BD3736菌株發(fā)酵液提取物粗品。

實(shí)施例4 BD3736菌株發(fā)酵液提取物的純化

(1)將實(shí)施例3所述BD3736菌株發(fā)酵液提取物粗品利用截留值分別為3500Da和1000Da的透析袋，4℃過夜透析，收集袋內(nèi)的樣品。將透析液冷凍干燥，得凍干粉。

(2)將步驟(1)得到的凍干粉用超純水溶解到質(zhì)量濃度200mg/mL，上樣量10mL，過Sephadex G-15(柱體積約800mL)凝膠柱層析分離。洗脫液為pH 7.0的超純水，流速為3mL/min。每4min收集一管，每管約12mL。用蛋白紫外檢測(cè)儀在280nm處檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

將上述收集到的樣品蒸干水相。測(cè)定對(duì)沙門氏菌的抑菌圈直徑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，14-16、23-30兩段收集管(分別用A、B表示)表現(xiàn)出明顯的抑菌活性，且兩段收集管的洗脫時(shí)間比較接近，A為64min，B為96min，說明它們的分子量比較接近。

(3)利用蛋白定量試劑盒，將步驟(2)得到的不同收集管，分別檢測(cè)蛋白含量。結(jié)果見圖4。

實(shí)施例5 BD3736菌株發(fā)酵液提取物的相對(duì)分子質(zhì)量的分析

(1)SDS-PAGE電泳。

取實(shí)施例4中編號(hào)為23-26號(hào)的收集管中收集的樣品點(diǎn)樣跑SDS-PAGE膠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，樣品經(jīng)電泳后出現(xiàn)兩條明顯的色帶，分子量分別37kD～25kD和10kDa以下。

(2)將步驟(1)得到的兩個(gè)條帶，用無(wú)菌蒸餾水反復(fù)浸洗后，測(cè)試不同分離條帶的抑菌作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6，結(jié)果顯示，低于10kD區(qū)域出現(xiàn)的條帶具有抑菌活性。

實(shí)施例6 BD3736菌株發(fā)酵液提取物的對(duì)溫度的穩(wěn)定性

將實(shí)施例3所制得的BD3736菌株發(fā)酵液提取物粗品分別在60℃、80℃和100℃中水浴30min和121℃溫度下處理15min，未經(jīng)熱處理的樣品CK作為對(duì)照。利用如實(shí)施例2所述制得的指示菌(腸炎沙門氏菌)平板，在牛津杯分別加100μL上述樣品測(cè)其抑菌圈直徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7，結(jié)果顯示，BD3736菌株所產(chǎn)抑菌的類芽孢桿菌發(fā)酵液提取物粗品在60℃、80℃、100℃溫度下處理30min后，抑菌活性均沒有發(fā)生明顯變化；甚至經(jīng)121℃處理15min后，活性也沒有喪失?？梢夿D3736菌株的抑菌的類芽孢桿菌發(fā)酵液提取物具有較好的熱穩(wěn)定性。

實(shí)施例7 BD3736菌株發(fā)酵液提取物對(duì)酸堿度的穩(wěn)定性

用不同pH范圍的緩沖液將如實(shí)施例3所制得的BD3736菌株發(fā)酵液提取物粗品pH分別調(diào)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，室溫放置2h，以對(duì)應(yīng)pH值的緩沖液為對(duì)照，利用如實(shí)施例2所述制得的指示菌(腸炎沙門氏菌)平板，在牛津杯分別加100μL上述樣品測(cè)其抑菌圈直徑。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8，結(jié)果顯示，本發(fā)明所述BD3736菌株發(fā)酵液提取物能耐受較寬范圍的酸堿度，且在堿性條件下抑菌活性大于酸性。

實(shí)施例8 BD3736菌株發(fā)酵液提取物的酶的穩(wěn)定性

分別配制5mg/mL的胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、脂肪酶(pH分別為1.5、7.5、7.5和6.5)，各取100μL于離心管中，加入實(shí)施例3所制得的BD3736菌株發(fā)酵液提取物粗品400μL，使酶的終濃度為1mg/mL。在各蛋白酶的最適溫度下(胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和脂肪酶分別為40℃、37℃、55℃和26℃)恒溫水浴酶解4h，置100℃沸水水浴5min使酶失活。再將pH值調(diào)回6.0，用20mmol/mL PBS緩沖液將體積補(bǔ)至同一體積，以100μL超純水加400μL細(xì)菌素為對(duì)照。利用如實(shí)施例2所述制得的指示菌(腸炎沙門氏菌)平板，在牛津杯分別加100μL上述樣品測(cè)其抑菌圈直徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9，結(jié)果顯示，本發(fā)明所述BD3736菌株發(fā)酵液提取物對(duì)胃蛋白酶、蛋白酶K部分敏感，對(duì)脂肪酶、胰蛋白酶不敏感。依據(jù)此推測(cè)該BD3736菌株發(fā)酵液提取物為蛋白類物質(zhì)。

實(shí)施例9 BD3736菌株發(fā)酵液的抑菌譜

1、指示菌平板的制備

將20％甘油保存的病原菌，分別轉(zhuǎn)接到BHI固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48h。然后刮取一環(huán)單菌落轉(zhuǎn)接到液體BHI中，30℃培養(yǎng)24h。12000rpm離心5min收集菌體，用無(wú)菌水稀釋，制成菌懸液。利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，控制終始菌濃為10⁶cfu/mL。

待BHI固體培養(yǎng)基冷卻至55℃，與制備好的所述指示菌菌懸液混勻倒平板，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)倒入20mL左右培養(yǎng)基。凝固并充分晾干后即得指示菌 平板。

2、BD3736菌株發(fā)酵所產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的抑菌譜

以大腸桿菌(Escherichia coli)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)、福氏志賀氏菌(Shigella flexneri)為革蘭氏陰性菌代表，以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、單增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黃小球菌(Micrococcus luteus)為革蘭氏陽(yáng)性菌代表。在指示菌平板上放置牛津杯，然后加100μL實(shí)施例3所獲得的BD3736菌株發(fā)酵液提取物粗品，檢測(cè)對(duì)其是否有抑制作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，結(jié)果顯示，本發(fā)明所述BD3736菌株發(fā)酵液提取物對(duì)大腸桿菌、志賀氏菌、腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌、藤黃小球菌及枯草芽孢桿菌均有比較明顯的抑制作用，而對(duì)金黃色葡萄球菌沒有抑制作用。因此BD3736菌株發(fā)酵液提取物具有抑菌活性，并具有廣譜、高效抑菌效果。

實(shí)施例10 BD3736菌株發(fā)酵液提取物的發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化

將如實(shí)施例3所述裝入500ml三角瓶中的130ml固形物含量10％滅菌脫脂牛乳的發(fā)酵液連續(xù)發(fā)酵，每隔1天取樣一次。

在實(shí)施例9所述的指示菌平板上等間隔放置無(wú)菌牛津杯，取100μL上述發(fā)酵液加入牛津杯中，每個(gè)樣品2個(gè)重復(fù)，將加好樣的培養(yǎng)皿，30℃恒溫培養(yǎng)36h后，測(cè)量抑菌圈的直徑(mm)。結(jié)果如表3所示。

表3 BD3736菌株不同時(shí)間的發(fā)酵上清液對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌、福氏志賀氏菌的抑菌效果

注：抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑(mm)＞20：極敏感；抑菌圈直徑(mm)在15～20：高敏感；抑菌圈直徑(mm)在10～14：中敏感；抑菌圈直徑(mm)＜10：低敏感；抑菌圈直徑(mm)為0：不敏感。

從表3可知，BD3736菌株第5天的發(fā)酵上清液抑菌活性明顯最強(qiáng)，抑菌圈平均直徑約為13.08mm，且該抑菌的類芽孢桿菌發(fā)酵液提取物對(duì)腸炎沙門氏菌抑菌作用最強(qiáng)，因此本發(fā)明以腸炎沙門氏菌作為指示菌代表。

實(shí)施例11多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)BD3736來源的抗菌物質(zhì)的提取

1、BD3736菌株的培養(yǎng)

取20％甘油保存的BD3736菌株，接種到LB固體培養(yǎng)基上，在大氣條件下30℃恒溫箱中48h。然后，刮取一環(huán)單菌落于15mL固形物含量為10％滅菌脫脂牛乳中，30℃、180r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24h，制得BD3736菌株種子發(fā)酵液。

在500mL三角瓶中裝入130mL滅菌生鮮牛乳，將上述BD3736菌株種子發(fā)酵液按照4％(v/v)的接種量接種25℃、180r/min恒溫振蕩5天，得BD3736菌株發(fā)酵液。所述滅菌生鮮牛乳的固形物含量為11％。

2、BD3736菌株發(fā)酵液提取物的制備

將如上所述BD3736菌株發(fā)酵液在50℃下水浴15min，冷卻至室溫，9000r/min，離心25min，收集上清液。在磁力攪拌的作用下，緩慢加入硫酸銨粉末，使鹽離子終飽和度達(dá)到80％，所述百分比為所述鹽的質(zhì)量占所述上清液和鹽的總體積的質(zhì)量體積百分比。過夜沉淀。然后9000r/min離心25min，收集沉淀物。將上述沉淀物重懸入去離子水中，即得BD3736菌株發(fā)酵液提取物粗品。

測(cè)定如上所述抑菌的類芽孢桿菌發(fā)酵液提取物對(duì)指示菌平板(沙門氏菌)的抑菌圈直徑。結(jié)果顯示，抑菌圈直徑為14.5mm。

實(shí)施例12多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)BD3736來源的抗菌物質(zhì)的提取

1、BD3736菌株的培養(yǎng)

取20％甘油保存的BD3736菌株，接種到LB固體培養(yǎng)基上，在大氣條件下30℃恒溫箱中48h。然后，刮取一環(huán)單菌落于15mL固形物含量10％滅菌脫脂牛乳，30℃、180r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24h，制得BD3736菌株種子發(fā)酵液。

在500mL三角瓶中裝入130mL滅菌脫脂牛乳，將上述BD3736菌株種子發(fā)酵液按照4％(v/v)的接種量接種25℃、180r/min恒溫振蕩5天，得BD3736菌株發(fā)酵液。所述滅菌脫脂牛乳的固形物含量為2％。

2、BD3736菌株發(fā)酵液提取物的制備

將如上所述BD3736菌株發(fā)酵液在50℃下水浴15min，冷卻至室溫，9000r/min，離心25min，收集上清液。在磁力攪拌的作用下，緩慢加入硫酸銨粉末，使鹽離子終飽和度達(dá)到80％，所述百分比為所述鹽的質(zhì)量占所述上清液和鹽的總體積的質(zhì)量體積百分比。過夜沉淀。然后9000r/min離心25min，收集沉淀物。將上述沉淀物重懸入去離子水中，即得BD3736菌株發(fā)酵液提取物粗品。

測(cè)定如上所述抑菌的類芽孢桿菌發(fā)酵液提取物對(duì)指示菌平板(沙門氏菌)的抑菌圈直徑。結(jié)果顯示，抑菌圈直徑為13mm。

實(shí)施例13多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)BD3736來源的抗菌物質(zhì)的提取

1、BD3736菌株的培養(yǎng)

取20％甘油保存的BD3736菌株，接種到LB固體培養(yǎng)基上，在大氣條件下30℃恒溫箱中48h。然后，刮取一環(huán)單菌落于15mL固形物含量為10％滅菌脫脂牛乳中，30℃、180r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24h，制得BD3736菌株種子發(fā)酵液。

在500mL三角瓶中裝入130mL滅菌脫脂牛乳，將上述BD3736菌株種子發(fā)酵液按照4％(v/v)的接種量接種35℃、180r/min恒溫振蕩5天，得BD3736菌株發(fā)酵液。所述滅菌脫脂牛乳的固形物含量為15％。

2、BD3736菌株發(fā)酵液提取物的制備

將如上所述BD3736菌株發(fā)酵液在80℃下水浴5min，冷卻至室溫，9000r/min，離心25min，收集上清液。在磁力攪拌的作用下，緩慢加入硫酸銨粉末，使鹽離子終飽和度達(dá)到80％，所述百分比為所述鹽的質(zhì)量占所述上清液和鹽的總體積的質(zhì)量體積百分比。過夜沉淀。然后9000r/min離心25min，收集沉淀物。將上述沉淀物重懸入去離子水中，即得BD3736菌株發(fā)酵液提取物粗品。

測(cè)定如上所述抑菌的類芽孢桿菌發(fā)酵液提取物對(duì)指示菌平板(沙門氏菌)的抑菌圈直徑。結(jié)果顯示，抑菌圈直徑為14mm。

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