本發(fā)明涉及一種蛋白酶抑制劑的制備方法。

背景技術(shù)：

丙型肝炎病毒(HCV) 感染是在相當(dāng)數(shù)量的感染個(gè)體中引起慢性肝臟疾病例如肝硬化和肝細(xì)胞癌的主要健康問題。當(dāng)前HCV 感染的治療包括單獨(dú)使用或與核苷類似物利巴韋林組合使用重組干擾素-α 的免疫治療。幾種病毒編碼的酶是治療干預(yù)的公認(rèn)靶標(biāo)，包括金屬蛋白酶(NS2-3)、解旋酶(NS3，全長)、NS3 蛋白酶輔助因子(NS4A)、膜蛋白質(zhì)(NS4B)和RNA- 依賴性RNA 聚合酶(NS5B)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種蛋白酶抑制劑的制備方法，該方法獲得的蛋白酶抑制劑可用于抑制HCV( 丙型肝炎病毒)NS3蛋白酶、預(yù)防或治療一種或多種HCV 感染的癥狀。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是設(shè)計(jì)1、一種蛋白酶抑制劑的制備方法，包括以下步驟：

1）將3- 羥基喹啉-4- 甲酸的THF溶液用NBS處理，并在室溫?cái)嚢?.5小時(shí)；該反應(yīng)混合物然后用EtOAc萃取，用水隨后用Na2S2O3水溶液洗滌；將合并的有機(jī)層用Na 2SO4干燥和濃縮，得到中間體產(chǎn)物；

2）在0℃向步驟1的粗產(chǎn)物在MeOH中的溶液中，加入甲苯和(三甲基甲硅烷基) 重氮甲烷并攪拌；將反應(yīng)混合物升溫至室溫并攪拌30分鐘；粗LC-MS顯示出起始材料全部消耗；將AcOH加入到反應(yīng)混合物中，直到鼓泡停止；蒸發(fā)有機(jī)物，將粗殘留物溶于甲苯并蒸發(fā)，得到為棕色固體的粗產(chǎn)物，使用(0-5)％ EtOAc-己烷作為流動(dòng)相將其通過硅膠柱色譜法進(jìn)行純化，得到純的中間體產(chǎn)物；

3）向步驟2的產(chǎn)物在DMF中溶液中，加入Cu-I，接著加入MFSDA；然后在微波高吸光度下將反應(yīng)混合物中在100℃加熱30分鐘；將反應(yīng)用EtOAc稀釋，用鹽水和水洗滌；將有機(jī)物用Na2SO4干燥，濃縮并用40％己烷/EtOAc 進(jìn)行純化，得到中間體產(chǎn)物；

4）將步驟3的產(chǎn)物、三丁基(1-乙氧基乙烯基)錫和Pd(PPh3)4于二噁烷中的混合物在回流下加熱過夜；將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，加入10ml 1N HCl，并在室溫?cái)嚢?0 分鐘；反應(yīng)混合物然后用水稀釋，用DCM 萃取3次；將合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，過濾，濃縮，用0-15％EtOAc-己烷洗脫進(jìn)行色譜法，得到產(chǎn)物；

5）在0℃向步驟5 的產(chǎn)物在DCM中的溶液中，一次性快速加入AlCl3，并將所得混合物在室溫?cái)嚢柽^夜。將反應(yīng)混合物用飽和羅謝爾鹽水溶液停止反應(yīng)，將兩相反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1小時(shí)；分離有機(jī)相，將水層用DCM萃取3次；將合并的有機(jī)層然后用水和鹽水洗滌，過濾，并濃縮；然后將剩余物通過硅膠上的柱色譜法(用己烷/EtOAc 99∶ 1～60∶40洗脫)純化，得到產(chǎn)物；

6）在微波小瓶中，向步驟5的產(chǎn)物的MeOH溶液中加入N-Boc-4-氧代-L-脯氨酸甲酯、和吡咯烷；然后向其中加入分子篩(4A珠)，將反應(yīng)加熱至105℃并在BIOTOPE INITIATOR微波反應(yīng)器中在非常高的吸光度下攪拌30分鐘；將反應(yīng)冷卻至室溫，濾出分子篩；減壓蒸發(fā)溶劑；將粗制的橙色油通過柱色譜法，在ANA-LOGIX使用硅膠柱，經(jīng)30分鐘的過程用己烷/丙酮(0-50％)洗脫進(jìn)行純化，得到產(chǎn)物，為非對映異構(gòu)體的混合物；

7）將步驟6的產(chǎn)物的溶液溶于THF和MeOH的混合物中；將混合物冷卻至0℃，并攪拌15分鐘。然后向該反應(yīng)中加入NaBH4，并在0℃攪拌混合物30分鐘；然后將反應(yīng)在室溫?cái)嚢?小時(shí)；將溶劑用EtOAc稀釋并在室溫用NH4Cl水溶液停止反應(yīng)；將有機(jī)級分用1mNaOH、鹽水、水洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾，減壓蒸發(fā)溶劑；粗制的黃色固體產(chǎn)物用于下一步驟；

8）將步驟7的產(chǎn)物和TEA加入到DCM中；然后加入MsCl到該溶液中，并使其在N2下攪拌過夜；然后將反應(yīng)用飽和NH4Cl停止反應(yīng)，將混合物用DCM萃?。粚⒑喜⒌挠袡C(jī)級分用水洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾，在減壓下蒸發(fā)溶劑，得到產(chǎn)物；

9）將步驟8的產(chǎn)物加入到攪拌冷卻的EtOAc的室溫溶液中；加入Pd/C，在排空和用H2回填后，在連接到H2- 填充的氣球下將反應(yīng)在室溫?cái)嚢?0分鐘；將反應(yīng)混合物用DCM稀釋，將該懸浮液通過硅藻土墊過濾；將不溶物用DCM 進(jìn)一步洗滌，真空濃縮濾液，得到產(chǎn)物；

10）在室溫將步驟9的產(chǎn)物于4N HCl二噁烷溶液中的溶液攪拌1小時(shí)，用甲苯蒸發(fā)2次，用乙醚蒸發(fā)2次，得到胺鹽酸鹽，就這樣用于下一步驟。將胺鹽、(S)-2-( 叔丁氧基羰基氨基)壬-8-烯酸、HATU和TEA于DMF中的漿液在室溫?cái)嚢柽^夜。將反應(yīng)混合物用水稀釋，用EtOAc萃取3次。將合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，過濾，濃縮，用0-50-100％EtOAc- 己烷進(jìn)行層析，得到產(chǎn)物；

11）在60 ℃將步驟10產(chǎn)物和LiOH·H2O于THF、MeOH和水中的混合物攪拌1小時(shí)；然后將反應(yīng)冷卻，用水稀釋，用1N HCl 酸化，用EtOAc 萃取3次；將合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，過濾并蒸發(fā)至干，得到粗酸產(chǎn)物；

12）向步驟11的產(chǎn)物、(1R，2S)-1- 氨基-N-(1- 甲基環(huán)丙基磺?；?-2- 乙烯基環(huán)丙烷甲酰胺、和HATU于DMF的攪拌溶液中，加入TEA并進(jìn)行攪拌；將混合物在室溫?cái)嚢柽^夜；該混合物用Et2O稀釋，用水洗滌，用Et2O回萃??；將合并的有機(jī)物干燥(Na2SO4)，過濾，減壓蒸發(fā)溶劑；粗品黃色油狀物通過柱色譜法純化，用己烷/EtOAc(0％～95％ ) 洗脫，得到產(chǎn)物，為黃色固體；

13）將步驟12 的產(chǎn)物、Zhan 催化劑和1，4-苯醌的DCE溶液在保持75℃的油浴中攪拌。在反應(yīng)混合物冷卻至室溫后，加入丁基乙烯基醚停止反應(yīng)，真空除去揮發(fā)物，將得到的暗綠色/棕色剩余物直接通過柱30％丙酮/己烷純化，得到(2R，6S，13aS，14aR，16aS，Z)-14a-(1-甲基環(huán)丙基磺?；被柞；?-5，16-二氧代-5′ -(三氟甲基)-1′，2′，3，5，6，7，8，9，10，11，13a，14，14a，15，16，16a-十六氫-1H-螺[環(huán)丙并[e]吡咯并[1，2-a][1，4]二氮雜環(huán)十五碳烯-2，3′ -吡喃并[2，3-c]喹啉]-6-基氨基甲酸叔丁酯)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果在于：本發(fā)明一種蛋白酶抑制劑的制備方法，該方法獲得的蛋白酶抑制劑可用于抑制HCV( 丙型肝炎病毒)NS3蛋白酶、預(yù)防或治療一種或多種HCV 感染的癥狀。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的流程圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例：

一種蛋白酶抑制劑的制備方法，包括以下步驟：

1）將3- 羥基喹啉-4- 甲酸(10g，52.9mmol) 的THF(320ml) 溶液用NBS(17.88g，100mmol) 處理，并在室溫?cái)嚢?.5 小時(shí)。該反應(yīng)混合物然后用EtOAc 萃取，用水隨后用Na2S2O3水溶液洗滌。將合并的有機(jī)層用Na 2SO4干燥和濃縮，得到中間體產(chǎn)物。

2）在0℃向步驟1 的粗產(chǎn)物(18.5g，61.1mmol) 在MeOH(40ml) 中的溶液中，加入甲苯(200ml) 和( 三甲基甲硅烷基) 重氮甲烷(TMSCHN2；61.1ml，122mmol) 并攪拌。將反應(yīng)混合物升溫至室溫并攪拌30 分鐘。粗LC-MS 顯示出起始材料全部消耗。將AcOH(3ml) 加入到反應(yīng)混合物中，直到鼓泡停止。蒸發(fā)有機(jī)物，將粗殘留物溶于甲苯并蒸發(fā)，得到為棕色固體的粗產(chǎn)物，使用(0-5)％ EtOAc- 己烷作為流動(dòng)相將其通過硅膠柱色譜法進(jìn)行純化，得到純的中間體產(chǎn)物(12g，37.9mmol，62.0％產(chǎn)率)。

3）向步驟2 的產(chǎn)物(6g，18.93mmol) 在DMF(32ml) 中溶液中，加入Cu-I(1.803g，9.46mmol)，接著加入MFSDA(7.22ml，56.8mmol)。然后在微波高吸光度下將反應(yīng)混合物中在100℃加熱30 分鐘。將反應(yīng)用EtOAc 稀釋，用鹽水和水洗滌。將有機(jī)物用Na2SO4干燥，濃縮并用40％己烷/EtOAc 進(jìn)行純化，得到中間體產(chǎn)物(2.72g，8.89mmol，46.9％產(chǎn)率)。

4）將步驟3 的產(chǎn)物(2.72g，8.89mmol)、三丁基(1- 乙氧基乙烯基) 錫(6.00ml，

17.77mmol) 和Pd(PPh3)4(0.513g，0.444mmol) 于二噁烷(40ml) 中的混合物在回流下加熱過夜。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，加入～ 10ml 1N HCl，并在室溫?cái)嚢?0 分鐘。反應(yīng)混合物然后用水稀釋，用DCM 萃取3 次。將合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，過濾，濃縮，用0-15％ EtOAc- 己烷洗脫進(jìn)行色譜法，得到產(chǎn)物(1.3g，4.83mmol，54.3％產(chǎn)率)。

5）在0℃向步驟5 的產(chǎn)物(1.3g，4.83mmol) 在DCM(50ml) 中的溶液中，一次性快速加入AlCl3(5.79g，43.5mmol)，并將所得混合物在室溫?cái)嚢柽^夜。將反應(yīng)混合物用飽和羅謝爾鹽(Rochelle′ s salt)( 水性) 水溶液停止反應(yīng)，將兩相反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1 小時(shí)。分離有機(jī)相，將水層用DCM 萃取3 次。將合并的有機(jī)層然后用水和鹽水洗滌，過濾，并濃縮。然后將剩余物通過硅膠上的柱色譜法( 用己烷/EtOAc 99 ∶ 1 ～ 60 ∶ 40 洗脫) 純化，得到產(chǎn)物(310mg，1.215mmol，25.2％產(chǎn)率)。

6）在微波小瓶中，向步驟5 的產(chǎn)物(0.310g，1.215mmol) 的MeOH(4ml) 溶液中加入N-Boc-4- 氧代-L- 脯氨酸甲酯(0.591g，2.430mmol)、和吡咯烷(0.039ml，0.486mmol)。然后向其中加入分子篩(4A 珠)，將反應(yīng)加熱至105℃并在BIOTOPE INITIATOR 微波反應(yīng)器中在非常高的吸光度下攪拌30 分鐘。將反應(yīng)冷卻至室溫，濾出分子篩。減壓蒸發(fā)溶劑。將粗制的橙色油通過柱色譜法，在ANA-LOGIX 使用硅膠柱，經(jīng)30 分鐘的過程用己烷/ 丙酮(0-50％ ) 洗脫進(jìn)行純化，得到產(chǎn)物(565mg，1.176mmol，97％產(chǎn)率)，為非對映異構(gòu)體的混合物。

7）將步驟6 的產(chǎn)物(565mg，1.176mmol) 的溶液溶于THF(10ml) 和MeOH(10ml) 的混合物中。將混合物冷卻至0℃，并攪拌15 分鐘。然后向該反應(yīng)中加入NaBH4(57.8mg，1.529mmol)，并在0℃攪拌混合物30 分鐘。然后將反應(yīng)在室溫?cái)嚢? 小時(shí)。將溶劑用EtOAc 稀釋并在室溫用NH4Cl 水溶液停止反應(yīng)。將有機(jī)級分用1m NaOH、鹽水、水洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾，減壓蒸發(fā)溶劑。粗制的黃色固體產(chǎn)物(567mg，1.175mmol，100％產(chǎn)率) 用于下一步驟。

8）將步驟7 的產(chǎn)物(567mg，1.175mmol) 和TEA(0.490ml，3.53mmol) 加入到DCM(6ml)中。然后加入MsCl(0.136ml，1.763mmol) 到該溶液中，并使其在N2下攪拌過夜。然后將反應(yīng)用飽和NH4Cl 停止反應(yīng)，將混合物用DCM(3 x 10mL) 萃取。將合并的有機(jī)級分用水洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾，在減壓下蒸發(fā)溶劑，得到產(chǎn)物(282mg，0.607mmol，51.7％產(chǎn)率)。

9）將步驟8 的產(chǎn)物(282mg，0.607mmol) 加入到攪拌冷卻的EtOAc 的室溫溶液(8ml)中。加入Pd/C(36mg，0.034mmol)，在排空和用H2回填后，在連接到H 2- 填充的氣球下將反應(yīng)在室溫?cái)嚢?0 分鐘。將反應(yīng)混合物用DCM(15mL) 稀釋，將該懸浮液通過硅藻土墊過濾。將不溶物用DCM 進(jìn)一步洗滌，真空濃縮濾液，得到產(chǎn)物(280mg，0.600mmol，99％產(chǎn)率)。

10）在室溫將步驟9的產(chǎn)物(280mg，0.600mmol)于4N HCl二噁烷溶液(30ml) 中的溶液攪拌1小時(shí)，用甲苯蒸發(fā)2次，用乙醚蒸發(fā)2次，得到胺鹽酸鹽(230mg，0.571mmol，95％產(chǎn)率)，就這樣用于下一步驟。將胺鹽(230mg，0.571mmol)、(S)-2-( 叔丁氧基羰基氨基)壬-8- 烯酸(388mg，0.857mmol)、HATU(326mg，0.857mmol) 和TEA(0.239ml，1.713mmol)于DMF(7ml)中的漿液在室溫?cái)嚢柽^夜。將反應(yīng)混合物用水稀釋，用EtOAc 萃取3 次。將合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，過濾，濃縮，用0-50-100％ EtOAc-己烷進(jìn)行層析，得到產(chǎn)物(156mg，0.252mmol，44.1％產(chǎn)率)。

11）在60 ℃ 將步驟10）產(chǎn)物(156mg，0.252mmol) 和LiOH·H2O(42.3mg，1.007mmol) 于THF(1ml)、MeOH(1ml) 和水(0.7ml) 中的混合物攪拌1 小時(shí)。然后將反應(yīng)冷卻，用水稀釋，用1N HCl 酸化，用EtOAc 萃取3 次。將合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，過濾并蒸發(fā)至干，得到粗酸產(chǎn)物(130mg，0.215mmol，85％產(chǎn)率)。

12）向步驟11 的產(chǎn)物(130mg，0.215mmol)、(1R，2S)-1- 氨基-N-(1- 甲基環(huán)丙基磺?；?-2- 乙烯基環(huán)丙烷甲酰胺(79mg，0.322mmol)、和HATU(122mg，0.322mmol) 于DMF(2.5ml) 的攪拌溶液中，加入TEA(0.09ml，0.64mmol) 并進(jìn)行攪拌。將混合物在室溫?cái)嚢柽^夜。該混合物用Et2O(20mL) 稀釋，用水(15ml) 洗滌，用Et2O(20ml) 回萃取。將合并的有機(jī)物干燥(Na2SO4)，過濾，減壓蒸發(fā)溶劑。粗品黃色油狀物通過柱色譜法純化，用己烷/EtOAc(0％～ 95％ ) 洗脫，得到產(chǎn)物(82mg，0.099mmol，45.9％產(chǎn)率)，為黃色固體。

13）將步驟12 的產(chǎn)物(86mg，0.103mmol)、Zhan 催化劑(Zhan ′ s catalyst，詹氏催化劑)(18.96mg，0.026mmol) 和1，4- 苯醌(3.35mg，0.031mmol) 的DCE(35ml) 溶液在保持75℃的油浴中攪拌。在反應(yīng)混合物冷卻至室溫后，加入丁基乙烯基醚(0.5ml)停止反應(yīng)，真空除去揮發(fā)物，將得到的暗綠色/ 棕色剩余物直接通過柱30％丙酮/ 己烷(ANALOGIX) 純化，得到(2R，6S，13aS，14aR，16aS，Z)-14a-(1-甲基環(huán)丙基磺?；被柞；?-5，16-二氧代-5′ -(三氟甲基)-1′，2′，3，5，6，7，8，9，10，11，13a，14，14a，15，16，16a-十六氫-1H-螺[環(huán)丙并[e]吡咯并[1，2-a][1，4]二氮雜環(huán)十五碳烯-2，3′ -吡喃并[2，3-c]喹啉]-6-基氨基甲酸叔丁酯(61mg，0.076mmol，73.4％產(chǎn)率)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。