本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一類誘導(dǎo)細(xì)胞漲亡的銥配合物及其制備方法和抗腫瘤應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥正逐步成為威脅人類生存以及生存質(zhì)量的頭號疾病，為患者家庭與社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。腫瘤治療主要有手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療三種手段，其中化學(xué)治療，即化療，是目前治療腫瘤時最廣泛使用的手段之一?；瘜W(xué)治療，是指應(yīng)用化學(xué)藥物針對性治療癌癥，殺死腫瘤細(xì)胞。目前所使用的超過50種化療藥物一般具有較強(qiáng)的毒副作用，且長期使用后腫瘤細(xì)胞易對其產(chǎn)生耐藥性。除了有機(jī)化合物腫瘤藥物外，金屬配合物作為抗腫瘤藥物也得到了廣泛使用，其具有可塑性強(qiáng)，易引入活性基團(tuán)，相對穩(wěn)定性高等特點，使得金屬配合物在人體內(nèi)易表現(xiàn)出藥效，成為另一大類抗癌藥物。

金屬配合物中，第一個發(fā)現(xiàn)的治療癌癥的金屬類化學(xué)藥物是順鉑(pt(nh3)2cl2)，即順式二氨基二氯絡(luò)鉑，自1972年發(fā)現(xiàn)以來，一直是臨床治療癌癥最常用的金屬類化學(xué)藥物之一，具有抗癌譜廣、療效確切等特點，可用于臨床治療甲狀腺癌、惡性淋巴瘤、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、食道癌、睪丸癌、鼻咽癌等多種實體腫瘤(chem.rev.,1999,99:2467)。自發(fā)現(xiàn)順鉑能有效治療癌癥后，更多應(yīng)用于癌癥治療的鉑類藥物得到了廣泛的關(guān)注，開發(fā)研究新的鉑類藥物如卡鉑、奧沙利鉑等副作用更小、療效更高的抗癌藥為治療癌癥帶來了新的希望(nat.rev.cancer,2007,7,73)。

然而，隨著鉑類藥物使用時間變長，研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞針對鉑類藥物累積起了廣泛的耐藥性。腫瘤細(xì)胞對鉑類藥物的耐藥使得人們逐漸將目光轉(zhuǎn)向了其他金屬配合物的抗癌藥物研究。其中，具有良好抗癌活性的銥配合物逐漸進(jìn)入人們的視野。在早期研究中，由于銥配合物表現(xiàn)出的某種“惰性”性質(zhì)使其抗癌活性降低，人們本不重視銥配合物在抗癌藥物中的應(yīng)用。隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)更多的銥配合物對腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出了較為優(yōu)異的抗增殖效果，激發(fā)了研究者對銥配合物的研究興趣，越來越多具有抗腫瘤活性的銥配合物被合成出來應(yīng)用于抗癌研究中(rscadv.,2012,2:12069)。

此外，人們發(fā)現(xiàn)，無論是有機(jī)化合物還是金屬配合物，其作用機(jī)制大多為靶向dna的細(xì)胞凋亡引發(fā)劑，而長期用藥下，腫瘤細(xì)胞對該機(jī)理形成了廣泛的耐藥性，其中包括dna損傷修復(fù)，特定蛋白的過表達(dá)等(oncogene,2003,22:7265)。因此，為了殺傷耐藥的腫瘤細(xì)胞，人們進(jìn)行了多種途徑的選擇，其中之一就是包括合成靶向線粒體而非細(xì)胞核dna的抗癌藥物。線粒體是另一個與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切的細(xì)胞器，擁有多條細(xì)胞凋亡通路，因此，靶向線粒體的抗癌藥物具有光明的前景。另外一種殺傷耐藥細(xì)胞的途徑即為合成誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行除凋亡以外其他死亡方式的藥物，比如副凋亡、細(xì)胞壞死性凋亡等。gasset與ferrari組合成了釕多吡啶配合物[ru(bipy)2-dppz-7-methoxy][pf6]2，可誘導(dǎo)位于細(xì)胞周期間期的細(xì)胞副凋亡(chem.sci.,2016,7:6115)；lippard組合成錸配合物[reo(ome)(n^n)cl2]，可誘導(dǎo)細(xì)胞壞死性凋亡(j.am.chem.soc.,2015,137:2967)。然而，還有一種死亡方式，細(xì)胞漲亡，在國內(nèi)外研究甚少。細(xì)胞漲亡以細(xì)胞體積增大、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)空泡化、線粒體腫脹以及細(xì)胞膜起泡為主要特征。作為一種新的誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的方式，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞漲亡可為克服腫瘤耐藥性提供另一種有效途徑。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一類新的誘導(dǎo)細(xì)胞漲亡的具有良好抗腫瘤活性的線粒體靶向試劑，合成了一類新的環(huán)金屬化的單核銥(iii)配合物，這類配合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的生長抑制能力，并且基于對線粒體靶向而非傳統(tǒng)的核靶向以及誘導(dǎo)細(xì)胞漲亡而非凋亡的新機(jī)理，可以克服由于腫瘤細(xì)胞耐藥性對腫瘤治療的缺陷，在開發(fā)高效的抗癌藥物方面具有很好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的目的是提供一類誘導(dǎo)細(xì)胞漲亡的銥配合物。

本發(fā)明另一目的是提供所述銥配合物的制備方法。

本發(fā)明再一目的是提供所述銥配合物的抗腫瘤應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一類環(huán)金屬化的銥配合物，其結(jié)構(gòu)式如下所示：

本發(fā)明合成了一類新的環(huán)金屬化的單核銥(iii)配合物，是一類誘導(dǎo)細(xì)胞漲亡的具有良好抗腫瘤活性的線粒體靶向試劑，這類配合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，表現(xiàn)出良好的細(xì)胞漲亡誘導(dǎo)活性，細(xì)胞毒性測試表明該環(huán)金屬化銥(iii)配合物對20種人體不同組織部位的癌細(xì)胞以及耐藥細(xì)胞有明顯的生長抑制作用，抑制活性明顯優(yōu)于順鉑，并且對于人正常肝細(xì)胞株殺傷性較小。

具體地，該類環(huán)金屬化的銥配合物主要有以下四種：

另外，上述環(huán)金屬化的銥配合物的制備方法，包括如下步驟：

s1.由環(huán)金屬配體和ircl3反應(yīng)制得前體反應(yīng)物，簡記為[ir(c^n)2cl]2；

s2.由4,4'-二甲基-2,2'-聯(lián)吡啶(bmb)經(jīng)氧化制得4,4'-二羧基-2,2'-聯(lián)吡啶(bcb)，再由4,4'-二羧基-2,2'-聯(lián)吡啶(bcb)與2-胺基苯硫醇反應(yīng)制得主配體4,4'-二苯并噻唑-2,2'-聯(lián)吡啶(bbtb)；

s3.將前體反應(yīng)物[ir(c^n)2cl]2與主配體4,4'-二苯并噻唑-2,2'-聯(lián)吡啶(bbtb)反應(yīng)，制得權(quán)利要求1所示的環(huán)金屬化銥配合物；

其中，步驟s1所述環(huán)金屬配體為2-苯基吡啶(ppy)、2-(2,4-二氟苯基)吡啶(dfppy)、2-苯基喹啉(2pq)、2-苯基苯并噻唑(pbt)。

其中，步驟s1所述2-苯基吡啶(ppy)、2-(2,4-二氟苯基)吡啶(dfppy)、2-苯基喹啉(2pq)、2-苯基苯并噻唑(pbt)、前體反應(yīng)物[ir(c^n)2cl]2、4,4'-二甲基-2,2'-聯(lián)吡啶(bmb)、4,4'-二羧基-2,2'-聯(lián)吡啶(bcb)、2-胺基苯硫醇、4,4'-二苯并噻唑-2,2'-聯(lián)吡啶(bbtb)的結(jié)構(gòu)式如下所示：

優(yōu)選地，上述環(huán)金屬化的銥配合物的制備方法，，包括如下步驟：

s1.由環(huán)金屬配體和ircl3在乙二醇甲醚與水的混合溶劑中反應(yīng)，制得前體反應(yīng)物，簡記為[ir(c^n)2cl]2；

s2.制備主配體4,4'-二苯并噻唑-2,2'-聯(lián)吡啶(bbtb)

s21.將4,4'-二甲基-2,2'-聯(lián)吡啶(bmb)溶于濃硫酸中與重鉻酸鉀反應(yīng)，加冰水析出固體；

s22.步驟s21的固體經(jīng)50％硝酸氧化，制得4,4'-二羧基-2,2'-聯(lián)吡啶(bcb)，加冰水析出固體；

s23.再將4,4'-二羧基-2,2'-聯(lián)吡啶(bcb)于多聚磷酸中與2-胺基苯硫醇反應(yīng)，制得主配體4,4'-二苯并噻唑-2,2'-聯(lián)吡啶(bbtb)，中和析出固體；

s3.將前體反應(yīng)物[ir(c^n)2cl]2與主配體4,4'-二苯并噻唑-2,2'-聯(lián)吡啶(bbtb)在三氯甲烷與無水甲醇混合溶劑中回流反應(yīng)，減壓懸蒸，得到固體粗產(chǎn)物，即為權(quán)利要求1所示的環(huán)金屬化銥配合物。

進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟s3所得固體粗產(chǎn)物進(jìn)一步干燥獲得粗產(chǎn)品，再經(jīng)氧化鋁柱分離提純，干燥后得到目標(biāo)產(chǎn)物，即為環(huán)金屬化銥配合物。

其中，優(yōu)選地，步驟s1中環(huán)金屬配體和ircl3的摩爾比為1.5～2：1。

更優(yōu)選地，步驟s1中環(huán)金屬配體和ircl3的摩爾比為2：1。

優(yōu)選地，步驟s21中4,4'-二甲基-2,2'-聯(lián)吡啶與重鉻酸鉀的質(zhì)量比為1：4～10。

更優(yōu)選地，步驟s21中4,4'-二甲基-2,2'-聯(lián)吡啶與重鉻酸鉀的質(zhì)量比為1：5。

優(yōu)選地，步驟s23中4,4'-二羧基-2,2'-聯(lián)吡啶：多聚磷酸：2-胺基苯硫醇的質(zhì)量比為0.1～0.3：5：0.2～0.4。

更優(yōu)選地，步驟s23中4,4'-二羧基-2,2'-聯(lián)吡啶：多聚磷酸：2-胺基苯硫醇的質(zhì)量比為0.2：5：0.3。

優(yōu)選地，步驟s3中前體反應(yīng)物[ir(c^n)2cl]2與主配體4,4'-二苯并噻唑-2,2'-聯(lián)吡啶(bbtb)的摩爾比為1～1.5：1。

更優(yōu)選地，步驟s3中前體反應(yīng)物[ir(c^n)2cl]2與主配體4,4'-二苯并噻唑-2,2'-聯(lián)吡啶(bbtb)的摩爾比為1.05：1。

另外，優(yōu)選地，步驟s1所述乙二醇甲醚與水的體積比為2～4：1。

更優(yōu)選地，步驟s1所述乙二醇甲醚與水的體積比為3：1。

優(yōu)選地，步驟s1所述反應(yīng)的溫度為110～120℃，時間為24小時。

更優(yōu)選地，步驟s1所述反應(yīng)的溫度為120℃，時間為24小時。

優(yōu)選地，步驟s21所述反應(yīng)的溫度為75～80℃，時間為1小時。

更優(yōu)選的，步驟s21所述反應(yīng)的溫度為80℃，時間為1小時。

優(yōu)選地，步驟s22所述氧化的反應(yīng)溫度為75～80℃，反應(yīng)時間為4～5小時。

更優(yōu)選的，步驟s22所述氧化的反應(yīng)溫度為80℃，反應(yīng)時間為4小時。

優(yōu)選地，步驟s23所述反應(yīng)的溫度為170～180℃，時間為24小時。

更優(yōu)選的，步驟s23所述反應(yīng)的溫度為180℃，時間為24小時。

優(yōu)選地，步驟s3所述三氯甲烷與無水甲醇的體積比為2～4：1。

更優(yōu)選地，步驟s3所述三氯甲烷與無水甲醇的體積比為3：1。

優(yōu)選地，步驟s3所述回流反應(yīng)的溫度為60～65℃，時間為4～5小時。

更優(yōu)選的，步驟s3回流反應(yīng)的溫度為65℃，時間為5小時。

總而言之，本發(fā)明制備所述環(huán)金屬化銥配合物的方法為：先制備前體反應(yīng)物[ir(c^n)2cl]2和主配體4,4'-二苯并噻唑-2,2'-聯(lián)吡啶(bbtb)，然后按照計量摩爾比將兩者混合于三氯甲烷與無水甲醇(3:1，v/v)混合溶劑中回流反應(yīng)5小時后，減壓懸干并干燥的粗產(chǎn)品經(jīng)過氧化鋁柱色譜分離提純，將溶劑用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干后得到目標(biāo)產(chǎn)物。

其中，作為一種具體的可實施方案，前體反應(yīng)物[ir(c^n)2cl]2可根據(jù)參考文獻(xiàn)(bull.chem.soc.jpn.1974,47,767.)的方法合成，其中c^n分表表示ppy、dfppy、2pq和pbt。

作為一種具體的可實施方案，主配體4,4'-二苯并噻唑-2,2'-聯(lián)吡啶(bbtb)的制備中，bcb制備方法為：將4,4'-二甲基-2,2'-聯(lián)吡啶(bmb)溶于適量濃硫酸中，分批加入過量重鉻酸鉀，加熱反應(yīng)1小時，加冰水析出固體，收集固體溶解于50％硝酸中，回流反應(yīng)4小時，加冰水析出固體，收集固體，為4,4'-二羧基-2,2'-聯(lián)吡啶(bcb)。而從bcb到bbtb可根據(jù)參考文獻(xiàn)(jbiolinorgchem.2007,12,797)的方法合成。

更具體地，可由以下步驟制備上述的bcb：先將bmb溶于適量濃硫酸中(4％，w/v)，維持溫度不變緩慢加入5倍質(zhì)量的重鉻酸鉀固體進(jìn)行氧化，反應(yīng)生成深綠色混合液體。將反應(yīng)液倒入大量冰水中產(chǎn)生淺黃色沉淀，抽濾水洗，將固體置于適量50％硝酸中回流反應(yīng)4小時。將反應(yīng)液倒入冰塊中并加水稀釋，抽濾可得大量白色沉淀，干燥得bcb。

同時，根據(jù)上述方法制備得到的環(huán)金屬化銥配合物也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明的環(huán)金屬化銥配合物對人體多種癌細(xì)胞包括其耐藥株藥株均具有很強(qiáng)的生長抑制能力，并具有一定的殺傷選擇性。而且其作用機(jī)理是基于對線粒體靶向而非傳統(tǒng)的核靶向、誘導(dǎo)細(xì)胞漲亡而非凋亡的新機(jī)理，可以應(yīng)用于線粒體靶向試劑，也可進(jìn)一步作為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗癌藥物。

因此，本發(fā)明的環(huán)金屬化銥配合物在制備線粒體靶向和/或誘導(dǎo)細(xì)胞漲亡的試劑或藥物方面的應(yīng)用，以及在制備抗癌藥物方面的應(yīng)用，都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

優(yōu)選地，所述的抗癌藥物為抗實體瘤癌癥的藥物。

更優(yōu)選地，所述的抗癌藥物是抗人子宮頸癌、人口腔表皮樣癌、人結(jié)腸癌、人肝癌、人肺癌、人卵巢癌和/或人乳腺癌的藥物。

更優(yōu)選地，所述的抗癌藥物是對人子宮頸癌細(xì)胞、人口腔表皮樣癌細(xì)胞及其耐藥株、人結(jié)腸癌細(xì)胞及其耐藥株、人肝癌細(xì)胞及其耐藥株、人肺癌細(xì)胞及其耐藥株、人卵巢癌細(xì)胞及其耐藥株和/或人乳腺癌細(xì)胞及其耐藥株具有殺傷作用的藥物。

更優(yōu)選地，所述抗癌藥物是對上述癌細(xì)胞具有殺傷作用，而對人正常肝細(xì)胞株和正常腎細(xì)胞株無殺傷作用或殺傷作用較少的藥物。

更優(yōu)選地，所述的抗癌藥物為對人子宮頸癌細(xì)胞hela，人口腔表皮樣癌細(xì)胞kb-3-1及其耐藥株kcp4，人結(jié)腸癌細(xì)胞hct-116、sw620及其耐藥株sw620/ad300，人肝癌細(xì)胞hepg2、bel-7402、bel-7404及其耐藥株7404/cp20，人肺癌細(xì)胞a549、h460及其耐藥株a549/cddp、h460/mx20，人卵巢癌細(xì)胞skov3及其耐藥株skov/pt，人乳腺癌細(xì)胞mcf-7及其耐藥株mcf-7/adr具有抑制殺傷作用的抗癌藥物。更進(jìn)一步地，上述抗癌藥物對人正常肝細(xì)胞株hl-7702以及正常腎細(xì)胞株hek293殺傷性較小。

本發(fā)明人課題組在合成靶向線粒體的銥配合物方面累積了豐富的經(jīng)驗，發(fā)現(xiàn)了眾多靶向線粒體的細(xì)胞器染料及探針(chem.sci.,2013,4:4426；biomaterials,2015,58:72；chem.eur.j.,2015,21:12000)，并且對金屬藥物方面進(jìn)行了研究(j.med.chem.,2014,57:8971；j.med.chem.,2013,56:6531；chem.eur.j.,2015,21:15308)。通過大量的研究得到了一系列具有很強(qiáng)腫瘤細(xì)胞毒性、靶向線粒體的環(huán)金屬銥配合物，能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞依循細(xì)胞漲亡途徑死亡，能殺傷多種耐藥細(xì)胞，對合成下一代抗腫瘤耐藥性的抗腫瘤藥物具有重要意義。

經(jīng)研究表明，本發(fā)明上述環(huán)金屬化銥配合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，由于ir(iii)金屬離子電荷的引入，在水中有較好的溶解性。該銥配合物對20多種人體不同組織部位的癌細(xì)胞及其耐藥株的細(xì)胞毒性值為ic50＝0.5～3.5μm，明顯優(yōu)于常見的抗腫瘤配合物順鉑pt(nh3)2cl2，因此是一類潛在的高效抗癌藥物。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供的環(huán)金屬化銥配合物對多種常見的人體癌細(xì)胞包括其耐藥株藥株均具有很強(qiáng)的生長抑制能力，并且其作用機(jī)理是基于對線粒體靶向而非傳統(tǒng)的核靶向、誘導(dǎo)細(xì)胞漲亡而非凋亡的新機(jī)理，可以克服由于腫瘤細(xì)胞耐藥性對腫瘤治療的缺陷，在開發(fā)高效的抗癌藥物方面具有很好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的銥配合物(ir(iii)配合物)的分子結(jié)構(gòu)。

圖2為本發(fā)明ir(iii)配合物的合成途徑。

圖3為本發(fā)明ir(iii)配合物吸收380nm～405nm的光照射后電子躍遷現(xiàn)象。

圖4為本發(fā)明ir(iii)配合物與mitotrackergreenfm共染激光共聚焦實驗圖。

圖5為本發(fā)明ir(iii)配合物細(xì)胞內(nèi)分布icp-ms數(shù)據(jù)。

圖6為caspase3/7活性測試。

圖7為加入caspase抑制劑的細(xì)胞存活率測試。

圖8為ir(iii)配合物誘導(dǎo)細(xì)胞胞質(zhì)空泡化激光共聚焦圖。

圖9為ir(iii)配合物誘導(dǎo)細(xì)胞胞質(zhì)空泡化透射電鏡圖。

圖10為ir(iii)配合物誘導(dǎo)細(xì)胞膜破壞起泡激光共聚焦圖。

圖11為ir(iii)配合物誘導(dǎo)線粒體膜電位損失jc-1染色實驗流式細(xì)胞儀實驗。

圖12為ir(iii)配合物誘導(dǎo)線粒體腫脹透射電鏡圖。

具體實施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購。

實施例1環(huán)金屬化ir(iii)配合物的合成

本發(fā)明環(huán)金屬化ir(iii)配合物的的合成途徑如圖2所示，具體方法如下：

(1)主配體4,4'-二苯并噻唑-2,2'-聯(lián)吡啶(bbtb)的合成方法：

1)4,4'-二羧基-2,2'-聯(lián)吡啶(bcb)的合成：

先將4,4'-二甲基-2,2'-聯(lián)吡啶(1.0g)溶于50ml濃硫酸中，維持溫度不變緩慢加入5.0g重鉻酸鉀固體進(jìn)行氧化，反應(yīng)生成深綠色混合液體。將反應(yīng)液倒入80ml冰水中產(chǎn)生淺黃色沉淀，抽濾水洗，將固體置于30ml50％硝酸中回流反應(yīng)4小時。將反應(yīng)液倒入冰塊中并加800ml水稀釋，抽濾可得大量白色沉淀，水洗干燥得bcb。

2)4,4'-二苯并噻唑-2,2'-聯(lián)吡啶(bbtb)合成：

按照參考文獻(xiàn)(jbiolinorgchem.2007,12,797)合成方法，通入氬氣保護(hù)下，加入0.2g4,4'-二羧基-2,2'-聯(lián)吡啶，0.3g2-胺基苯硫醇以及5.0g多聚磷酸于三頸圓底燒瓶中，加熱到180℃，反應(yīng)24小時。反應(yīng)液冷卻后，邊攪拌邊倒入100ml水中。用飽和nahco3溶液中和，過濾收集藍(lán)綠色沉淀物，水洗干燥得bbtb。es-msm/z:423.5([m+h]+,100％)。

(2)前體反應(yīng)物[ir(c^n)2cl]2的合成方法：

參考文獻(xiàn)(bull.chem.soc.jpn.1974,47,767.)合成方法，將0.47gircl3(15.7mmol)和兩倍當(dāng)量的環(huán)金屬配體(c^n配體)混合于40ml乙二醚甲醇與水(3:1，v/v)混合溶劑中，氬氣保護(hù)下120℃回流反應(yīng)24小時。反應(yīng)液冷卻后抽濾，沉淀物依次用水、乙醇、正己烷洗，干燥得[ir(c^n)2cl]2前體反應(yīng)物。產(chǎn)率：85％。

(3)環(huán)金屬化銥配合物[ir(c^n)bbtb]cl的合成方法：

將前體反應(yīng)物[ir(c^n)2cl]2與0.050gbbtb(0.12mmol)按照當(dāng)量比1.05:1投入三氯甲烷與無水甲醇(3:1,v/v)混合溶劑中，加熱65℃回流反應(yīng)5小時。反應(yīng)液冷卻后減壓懸干溶劑，得粗產(chǎn)品。干燥粗產(chǎn)品后用氧化鋁層析柱分離提純，溶劑懸干后，得本發(fā)明環(huán)金屬化ir(iii)配合物(其分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示)。

[ir(ppy)bbtb]cl產(chǎn)率51％。es-ms(ch3oh)m/z:923.5[m-cl]⁺.¹hnmr(300mhz,dmso)δ9.57(s,2h),8.32(ddd,j＝26.4,12.2,5.2hz,8h),8.06(d,j＝5.8hz,2h),7.94(t,j＝6.8hz,4h),7.82(d,j＝5.7hz,2h),7.72–7.55(m,4h),7.16(t,j＝6.2hz,2h),7.05(t,j＝7.5hz,2h),6.94(t,j＝7.2hz,2h),6.20(d,j＝7.4hz,2h).

[ir(dfppy)bbtb]cl產(chǎn)率45％。es-ms(ch3oh):m/z995.3[m-cl^-]⁺.¹hnmr(300mhz,dmso)δ9.60(s,2h),8.39–8.22(m,8h),8.10(d,j＝5.8hz,2h),8.04(t,j＝7.9hz,2h),7.89(d,j＝5.8hz,2h),7.64(dt,j＝14.7,7.0hz,4h),7.25(t,j＝6.8hz,2h),7.02(t,j＝11.0hz,2h),5.63(d,j＝6.0hz,2h).

[ir(2pq)bbtb]cl產(chǎn)率52％。es-ms(ch3oh):m/z1023.1[m-cl^-]⁺.¹hnmr(400mhz,dmso)δ9.21(s,1h),8.61(dd,j＝20.9,8.9hz,4h),8.42–8.26(m,8h),8.20(d,j＝7.6hz,2h),7.95(d,j＝7.0hz,2h),7.63(dt,j＝15.2,7.0hz,2h),7.43(t,j＝7.0hz,2h),7.34(d,j＝8.8hz,2h),7.27–7.17(m,4h),6.87(t,j＝6.9hz,1h),6.43(d,j＝7.0hz,1h).

[ir(2pq)bbtb]cl產(chǎn)率47％。es-ms(ch3oh):m/z1035.0[m-cl^-]⁺.¹hnmr(400mhz,dmso)δ9.57(s,2h),8.47(d,j＝4.1hz,2h),8.34(d,j＝7.5hz,2h),8.26(d,j＝6.5hz,6h),8.07(d,j＝6.9hz,2h),7.65(dt,j＝15.2,7.0hz,4h),7.42(t,j＝7.7hz,2h),7.26(t,j＝7.3hz,2h),7.18(t,j＝7.1hz,2h),6.98(t,j＝6.9hz,2h),6.37(d,j＝8.4hz,2h),6.32(d,j＝7.5hz,2h).

實施例2環(huán)金屬化ir(iii)配合物的細(xì)胞亞細(xì)胞器靶向?qū)嶒?/p>

1、本發(fā)明的環(huán)金屬化銥(iii)配合物吸收380nm～405nm的光照射后，電子從基態(tài)躍遷至³mlct軌道呈激發(fā)態(tài)，而后躍遷返回基態(tài)的過程中發(fā)出磷光(如圖3所示)。

2、另外，利用該性質(zhì)，可通過激光共聚焦顯微鏡觀察配合物于細(xì)胞內(nèi)的分布狀態(tài)。該系列配合物與商用線粒體染料mitotrackergreenfm的共染表明，該系列配合物([ir(ppy)bbtb]cl，[ir(dfppy)bbtb]cl，[ir(2pq)bbtb]cl，[ir(pbt)bbtb]cl)主要定位于細(xì)胞的線粒體，其共定位系數(shù)(pearson'scolocalizationcoefficients)分別為0.83，0.85，0.92，0.87，重合率較高(如圖4所示)。

3、此外，經(jīng)icp-ms定量測試(如圖5所示)，可進(jìn)一步表明該系列配合物的細(xì)胞靶向為線粒體。

實施例3環(huán)金屬化ir(iii)配合物的細(xì)胞毒性mtt實驗

1、實驗方法

(1)實驗樣品：

ir(iii)配合物，對照為常用抗腫瘤配合物順鉑cddp(pt(nh3)2cl2)。

(2)方法

取對數(shù)生長期的腫瘤或正常細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度5×10³個/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，實驗各樣品以對數(shù)稀釋法共添加5個濃度。每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，對照設(shè)8個以上復(fù)孔。

實驗樣品以dmso助溶，用dmem培養(yǎng)液稀釋。24h貼壁后加樣，仍將細(xì)胞置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48h，然后加mtt，再繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去上清液，每孔加150μmdmso，用酶聯(lián)免疫檢測儀在595.0nm波長測各孔吸光度，計算細(xì)胞增殖抑制率。求出ic50值(抑制率等于50％的時候的藥物濃度)。

2、結(jié)果如表1所示。

表1ir(iii)配合物對不同部位癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ic50)

結(jié)果顯示，本發(fā)明的銥配合物對多種人體不同組織部位的癌細(xì)胞及其耐藥株都具有很好的抑制殺傷作用，且顯著優(yōu)于對照，因此是一類潛在的高效抗癌藥物。

實施例4環(huán)金屬化ir(iii)配合物誘導(dǎo)細(xì)胞漲亡實驗

1、細(xì)胞漲亡有別于細(xì)胞凋亡，是細(xì)胞程序性死亡的另外一種方式，其主要特征有：caspase非依賴性死亡，胞質(zhì)空泡化，細(xì)胞膜破壞以及線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mptp)開放等。

本實驗通過對本發(fā)明的系列銥配合物與陽性對照順鉑對比，分別研究其刺激耐順鉑肺癌細(xì)胞株a549/cddp的caspase-3/7凋亡蛋白活性，以及分別加入caspase抑制劑ac-devd-cho與z-vad-fmk細(xì)胞存活率實驗研究該系列配合物誘導(dǎo)細(xì)胞死亡對caspase的依賴性。

2、結(jié)果

(1)caspase-3/7凋亡蛋白活性表明，本發(fā)明的系列銥配合物并未刺激caspase-3/7活性(如圖6所示，孵育時間24小時，a:[ir(c^n)bbtb]cl孵育濃度0.5μm，順鉑50μm；b：[ir(c^n)bbtb]cl孵育濃度1μm，順鉑100μm；c：[ir(c^n)bbtb]cl孵育濃度2μm，順鉑200μm)。而caspase抑制劑未能抑制該系列配合物的細(xì)胞毒性(如圖7所示，孵育時間24小時)，均表明該系列配合物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為非caspase依賴性。

(2)通過激光共聚焦顯微鏡以及透射電鏡對細(xì)胞進(jìn)行觀察(孵育濃度1μm，孵育時間24小時，scalebar：10μm)，結(jié)果顯示本發(fā)明的銥配合物能誘導(dǎo)細(xì)胞的胞質(zhì)空泡化(圖8，圖9)。

(3)通過激光共聚焦顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察(孵育濃度2μm，孵育時間24小時，scalebar：10μm)，結(jié)果顯示本發(fā)明的銥配合物能誘導(dǎo)細(xì)胞膜的破壞(圖10)。

(4)jc-1是一種膜電位依賴型的靶向線粒體的細(xì)胞染料，在正常的線粒體中聚集成聚集體，發(fā)出紅色熒光；當(dāng)線粒體膜電位損失時形成單體，發(fā)出綠色熒光。線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，能顯著降低線粒體膜電位，導(dǎo)致線粒體的腫脹，因此利用透射電鏡(圖11)與流式細(xì)胞儀jc-1染料染色實驗可檢測細(xì)胞線粒體膜電位的損失情況(圖12)。結(jié)果顯示，該系列配合物能夠顯著降低線粒體膜電位，從而導(dǎo)致線粒體腫脹。

綜上所述，本發(fā)明的銥配合物能有效誘導(dǎo)細(xì)胞漲亡，提供了一種新的抗耐藥腫瘤的途徑。