本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物提取
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種蠅蛆非甲殼素多糖及其提取方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：多糖一般是由10個(gè)以上相同或不同的單糖基通過苷鍵連接而成的聚糖，在生物體內(nèi)具有調(diào)節(jié)免疫等功能。具體功能與其分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。微生物、植物和動(dòng)物均含多糖。不同來(lái)源多糖的生物活性不盡相同。昆蟲是自然界種類最多、數(shù)量最大的生物類群。蠶蛹多糖的提取已見報(bào)道。家蠅(MuscadomesticaLinnaeus)是一種世代周期短、繁殖率高、養(yǎng)殖技術(shù)簡(jiǎn)單、養(yǎng)殖設(shè)備投資小的昆蟲資源。家蠅幼蟲(俗稱蠅蛆)體內(nèi)含有多種活性物質(zhì)，不同的蠅蛆提取物陸續(xù)見諸報(bào)道。包括蠅蛆蛋白質(zhì)、抗菌肽、甲殼素、殼聚糖和磷脂。曾有報(bào)道從家蠅中提取調(diào)節(jié)免疫的物質(zhì)的報(bào)道(高嘉，家蠅中免疫及抗菌活性物質(zhì)的分離與純化，天津輕工業(yè)學(xué)院研究生學(xué)位論文)。究其實(shí)際的提取物，實(shí)際上是凝集素和抗菌肽的分離。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種蠅蛆非甲殼素多糖。本發(fā)明的另一目的在于提供上述蠅蛆非甲殼素多糖的提取方法。本發(fā)明的再一目的在于提供上述蠅蛆非甲殼素多糖的應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種蠅蛆非甲殼素多糖，外觀為灰白色粉末；易溶于水，水溶液呈中性；不溶于有機(jī)溶劑，該有機(jī)溶劑包括無(wú)水乙醇、丙酮和乙醚；其水溶液與酚-硫酸反應(yīng)后作吸光度測(cè)定，特征吸收峰波長(zhǎng)為490nm；其水溶液在濃硫酸與α-茶酚作用，于界面呈處紫色環(huán)；其水解前與斐林試劑呈陰性反應(yīng)，水解后與斐林呈陽(yáng)性反應(yīng)，產(chǎn)生棕紅色氧化亞酮沉淀，在紙上與雪夫試劑產(chǎn)生玫瑰色反應(yīng)。上述蠅蛆非甲殼素多糖的提取方法，具體包括如下步驟：(1)將適量家蠅3齡幼蟲，至于磷酸鹽緩沖液中孵育，并除去蟲體外表面的液體；(2)將步驟(1)所得的物料進(jìn)行勻漿，得勻漿液；(3)在上述勻漿液中加入3～6倍體積的丙酮，室溫下攪拌浸泡0.5～14h，去上清后，再加入沉淀的1.5～3倍體積的丙酮，室溫下攪拌浸泡0.5～14h，去上清后，接著再加入沉淀的1.5～3倍體積的丙酮，室溫下攪拌浸泡0.5～14h，去上清，得沉淀；(4)待步驟(3)所得沉淀中的丙酮揮發(fā)后，加入沉淀的1.5～3倍體積的水，95～100℃孵育1～2h后取上清，重復(fù)3～5次，累積上清液；(5)在步驟(4)所得的上清液中加入3～5倍體積的95％乙醇，充分?jǐn)嚢?，?～4℃放置8～24h后，離心收集沉淀；(6)用無(wú)水乙醇清晰步驟(5)所得的沉淀，得到粗多糖濕品；(7)將步驟(6)所得的粗多糖濕品于45～55℃烘干，即得所述蠅蛆非甲殼素多糖。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.01M，pH為7.4。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述磷酸鹽緩沖液的配方如下：1000mL蒸餾水含NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO41.44g和KH2PO40.24g。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述步驟(1)為：將適量家蠅3齡幼蟲，至于磷酸鹽緩沖液中孵育1h后，更換磷酸鹽緩沖液再孵育1h，然后除去蟲體外表面的液體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述步驟(3)為：在上述勻漿液中加入3～6倍體積的丙酮，室溫下攪拌浸泡0.5～14h，去上清后，再加入沉淀的2倍體積的丙酮，室溫下攪拌浸泡0.5～14h，去上清后，接著再加入沉淀的2倍體積的丙酮，室溫下攪拌浸泡0.5～14h，去上清，得沉淀。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述步驟(4)為：待步驟(3)所得沉淀中的丙酮揮發(fā)后，加入沉淀的2倍體積的水，95～100℃孵育1～2h后取上清，重復(fù)4次，累積上清液。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，4℃放置8～24h后，離心收集沉淀。上述蠅蛆非甲殼素多糖在調(diào)節(jié)免疫功能中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果：1、本發(fā)明所提取的非甲殼素多糖具有調(diào)節(jié)免疫的功能。2、本發(fā)明的操作過程簡(jiǎn)單，成本低廉，產(chǎn)率高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施方式以下通過具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說明和描述。實(shí)施例1蠅蛆多糖的制備籠養(yǎng)方式獲得家蠅3齡幼蟲120g，置于0.01M磷酸鹽緩沖液(1000ml蒸餾水含NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO41.44g和KH2PO40.24g，用Na2HPO4調(diào)節(jié)pH到7.4)中，在室溫下孵育1h，更換液體，再孵育1h。瀝去蟲體外面的液體。經(jīng)勻漿器攪拌(Waring組織搗碎機(jī)，18000rpm)，制成勻漿。加3倍體積的丙酮，室溫下攪拌浸泡30min，去上清。加2倍體積的丙酮，室溫下攪拌浸泡30min，去上清，重復(fù)1次。揮去丙酮后加2倍體積的水，置水浴100℃1h后取上清，重復(fù)4次，累積上清液。加入4倍體積、濃度為95％的乙醇，輕輕攪拌，放置4℃冰箱中過夜，次日離心收集沉淀，上清液回收乙醇。用無(wú)水乙醇對(duì)沉淀洗滌兩次，即得粗多糖濕品。將粗多糖濕品轉(zhuǎn)入電熱鼓風(fēng)干燥箱中50℃下烘干，得干燥的蠅蛆非甲殼素多糖本實(shí)施例制得的蠅蛆非甲殼素多糖的理化性質(zhì)如下：為灰白色粉末，易溶于水，其溶液呈中性；不溶于無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚等有機(jī)溶解中。其水溶液與酚-硫酸反應(yīng)后作吸光度測(cè)定，其特征吸收峰波長(zhǎng)為490nm，其水溶液在濃硫酸與α一茶酚作用，于界面呈處紫色環(huán)。水解前與斐林試劑呈陰性反應(yīng)；水解后與斐林呈陽(yáng)性反應(yīng)，產(chǎn)生棕紅色氧化亞酮沉淀，在紙上與雪夫試劑產(chǎn)生玫瑰色反應(yīng)。實(shí)施例2蠅蛆多糖的制備籠養(yǎng)方式獲得家蠅3齡幼蟲5kg，分置于0.01M磷酸鹽緩沖液，(pH7.4)中，在室溫下孵育1h，更換液體，再孵育1h。瀝去蟲體外面的液體。經(jīng)勻漿器分次攪拌(Waring組織搗碎機(jī)，18000rpm)，累積勻漿。加3倍體積的丙酮，室溫下攪拌浸泡30min，去上清。加2倍體積的丙酮，室溫下攪拌浸泡30min，去上清，重復(fù)1次。揮去丙酮后加2倍體積的水，置水浴100℃1h后取上清，重復(fù)4次，累積上清液。加入4倍體積、濃度為95％的乙醇，輕輕攪拌，放置4℃冰箱中過夜，次日離心收集沉淀，上清液回收乙醇。用無(wú)水乙醇對(duì)沉淀洗滌兩次，即得粗多糖濕品。將粗多糖濕品轉(zhuǎn)入電熱鼓風(fēng)干燥箱中50℃下烘干，得干燥的蠅蛆非甲殼素多糖，其理化性質(zhì)與實(shí)施例1制得蠅蛆非甲殼素多糖的相同。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：精確稱取105℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖90.0mg，置100mL容量瓶中定容。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0、10、20、30、40、50、60μL，注明標(biāo)記后分別置于比色管中，各加蒸餾水使體積為1.0mL，再加入5％的苯酚1.0mL搖勻，迅速加入98％濃硫酸3.25mL，顯色20min，冷水中冷卻至室溫。以不含葡萄糖的溶液(標(biāo)記為0μL)為空白對(duì)照，于最大吸收波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y＝0.009x+0.002(R2＝0.999)，如圖1所示。樣品多糖含量測(cè)定：準(zhǔn)確稱量本實(shí)施例制得的干燥的蠅蛆非甲殼素多糖2.0mg，加蒸餾水至10.0mL，得待測(cè)樣品溶液。準(zhǔn)確吸取待測(cè)樣品溶液0.4、0.6、0.8mL，補(bǔ)加蒸餾水至1.0mL，按測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線方法顯色，于490nm處分別測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算取其平均值，得粗多糖含量為26.3％。實(shí)施例3蠅蛆多糖調(diào)節(jié)免疫功能的檢測(cè)供試多糖配制：稱取實(shí)施例1或?qū)嵤├?制得的蠅蛆粗多糖粉末250mg用20mL注射用氯化鈉溶液溶解，2000rpm離心10min，取上清液過濾除菌，配成濃度為12.5mg/mL的高劑量組溶液。然后取上述液體10mL，加注射用氯化鈉溶液倍比稀釋成6.25mg/mL、3.125mg/mL的中劑量組、低劑量組溶液。按試驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)分批飼養(yǎng)小鼠(清潔級(jí)昆明種小鼠，雄性，體重18-22g)，適應(yīng)性喂養(yǎng)4天后隨機(jī)分為5組，空白組、環(huán)磷酞胺(Cyclophosphamide，CY)模型組、CY+多糖小劑量組、CY+多糖中劑量組、CY+多糖大劑量組，每組8只。每周空腹稱重一次。第一組為對(duì)照組，第三、四、五組為實(shí)驗(yàn)組，按0.2mL/10g的量每日尾靜脈注射高、中、低劑量的蠅蛆多糖溶液，第二和三組經(jīng)同途徑給予等體積的生理鹽水，自由采食。第19天第三、四、五組開始腹腔注射環(huán)磷酞胺100mg/kg，1次/d，連續(xù)3天。具體試驗(yàn)如下：(1)碳廓清法試驗(yàn)：22日齡小鼠40只，稱重后腹腔注射CY。1h后按小鼠空腹體重0.1mL/10g計(jì)算每只尾靜脈注入50％印度墨汁(臨用前配置，稀釋于生理鹽水)。2min(T1)和10min(T2)后立即分別從眼眶靜脈叢采取20μL，并立即注入4mL0.1％NaHCO3溶液中。兩次采血完畢之后脫頸處死，取脾臟和肝臟并稱重。以正常小鼠血注入4mL0.1％NaHCO3溶液中作對(duì)照。在可見分光光度計(jì)600nm波長(zhǎng)處，以NaHCO3溶液作校對(duì)，測(cè)A值。結(jié)果以吞噬指數(shù)來(lái)表示。碳廓清指數(shù)K＝(logA1-logA2)/(T2-T1)，吞噬指數(shù)a＝[體重/(肝重+脾重)]*k1/3，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示：表1蠅蛆多糖對(duì)免疫抑制小鼠吞噬指數(shù)α的影響組別吞噬指數(shù)α空白組5.7035±0.0063CY模型組3.0820±0.0382小劑量多糖+CY組3.9625±0.0376#○中劑量多糖+CY組4.1820±0.2578□●大劑量多糖+CY組5.0833±0.0792□●注：空白組和CY模型組彼此對(duì)照，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果顯示為極顯著差異(P＜0.01，未標(biāo)記號(hào))；#與空白組比較差異顯著(P＜0.05)；●與CY模型組比較差異顯著(P＜0.05)；□與空白組比較差異不顯著(P＞0.05)；○與CY模型組比較差異不顯著(P＞0.05)；中劑量多糖+CY組與其它兩個(gè)劑量組比較差異不顯著(P＞0.05，未標(biāo)記號(hào))；大、小劑量組之間比較差異顯著(P＜0.05，未標(biāo)記號(hào))。(2)脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的測(cè)定：22日齡小鼠40只，稱重后腹腔注射CY。1h后摘眼球取血，分離血清，4℃保存?zhèn)溆?。脫頸處死小鼠，無(wú)菌采取脾臟，4℃放置，在200目銅網(wǎng)上輕輕研磨并過濾，加入Hank′S液，轉(zhuǎn)入滅菌好的離心管中，做好標(biāo)記，4℃保存。用Hank′S液配平后，1500rpm，10min離心，棄上清，重復(fù)三次。加入配好的細(xì)胞培養(yǎng)液，振蕩重懸后，置于4℃冰箱保存，以備細(xì)胞計(jì)數(shù)用。將細(xì)胞液置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，將計(jì)數(shù)好的細(xì)胞進(jìn)行濃度調(diào)整，統(tǒng)一調(diào)整至5.0×106個(gè)/mL。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100μL的脾淋巴細(xì)胞液，每個(gè)樣本設(shè)三個(gè)重復(fù)孔。再加入150μLconA(終濃度為5μg/ml)，并用含100mL/L小牛血清的RPMI1640做空白對(duì)照。置于5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，結(jié)束培養(yǎng)4h前，每孔加入50μL的MTT濃度為(2mg/ml)。繼續(xù)孵育4h，棄上清液，每孔加入150μLDMSO，輕微振蕩15min，在酶標(biāo)儀上570nm讀數(shù)，以空白對(duì)照孔校正零點(diǎn)，試驗(yàn)結(jié)果以0D值表示，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示：表2蠅蛆多糖對(duì)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響組別OD值空白組0.5013±0.0036CY模型組0.2377±0.0093小劑量多糖+CY組0.3808±0.0349#○中劑量多糖+CY組0.4120±0.0339□●大劑量多糖+CY組0.4862±0.0581□●注：空白組和CY模型組彼此對(duì)照，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果顯示為顯著差異(P＜0.05，未標(biāo)記號(hào))；#與空白組比較差異顯著(P＜0.05)；●與CY模型組比較差異顯著(P＜0.05)；□與空白組比較差異不顯著(P＞0.05)；○與CY模型組比較差異不顯著(P＞0.05)；三個(gè)劑量組之間差異不顯著(P＜0.05，未標(biāo)記號(hào))。(3)免疫臟器重量測(cè)定：各組動(dòng)物于末次給藥后24h處死，取脾臟和胸腺，用濾紙吸干水分后在分析天平上稱重計(jì)算臟器系數(shù)，公式如(1)和(2)：脾臟指數(shù)＝(脾臟重量(g))×100/(處死時(shí)體重(g))(1)胸腺指數(shù)＝(胸腺重量(g))×100/(處死時(shí)體重(g))(2)試驗(yàn)結(jié)果如表3所示：表3蠅蛆多糖對(duì)免疫抑制小鼠脾和胸腺重量及其指數(shù)的影響組別脾重(g)胸腺重(g)脾指數(shù)胸腺指數(shù)空白組0.0825±0.00650.0705±0.00780.0028±0.00030.0021±0.0001CY模型組0.0420±0.00720.0360±0.00920.0015±0.00010.0012±0.0003小劑量多糖+CY組0.0595±0.0158#○0.0387±0.0149#○0.0017±0.0003#○0.0016±0.0004#○中劑量多糖+CY組0.0665±0.0215#○0.0463±0.0126#●0.0021±0.0004#○0.0020±0.0004□●大劑量多糖+CY組0.0760±0.0102□●0.0635±0.0108□●0.0026±0.0002□●0.0020±0.0001□●注：空白組和CY模型組彼此對(duì)照，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果顯示脾重和胸腺重及其指數(shù)均為極顯著差異(P＜0.01，未標(biāo)記號(hào))；#與空白組比較差異顯著(P＜0.05)；●與CY模型組比較差異顯著(P＜0.05)；□與空白組比較差異不顯著(P＞0.05)；○與CY模型組比較差異不顯著(P＞0.05)；三個(gè)劑量組之間差異不顯著(P＞0.05，未標(biāo)記號(hào))。以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3