專利名稱：蕨菜多糖的提取分離方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種糖的提取分離方法，更具體地，本發(fā)明涉及一種 蕨菜多糖的提取分離方法。
背景技術：
蕨菜是可作食用的蕨類植物的統(tǒng)稱。野生蕨菜自古以來就被用作 菜蔬和度荒的食品,我國最早的詩經(jīng)中《詩召南草蟲》記載:"陡彼南山， 言采其蕨"。北魏賈思勰的《齊民要術》及明代李時珍的《本草綱目》 均有較多的記載。由于野生蕨菜具有特殊的清香口味,又極少受到污 染，所以倍受人們青睞,已成為我國重要出口 土特產(chǎn)品之一,在國外享 有"山珍之王"的美稱。蕨菜為傳統(tǒng)野菜,營養(yǎng)極為豐富,含有大量的氨 基酸以及無機元素，其中有8種人體必需氨基酸，其胡蘿卜素和維生素 C的含量均高于番茄、茄子和黃瓜。不僅蕨的嫩葉可供食用,其地下 根狀莖富含淀粉,可提取食用。我國野生蕨菜資源豐富,極具開發(fā)價值, 但目前絕大多數(shù)尚未被利用。有關蕨菜化學成分的測定、藥理作用的 特點、營養(yǎng)保健的價值，近年有一些報道，但對于蕨菜多糖的提取方 法和特別是分離純化則尚未報道，有些方法提取出的蕨菜多糖含色素 很多，灰色粉末狀的蕨菜粗多糖水溶性差，提取率不高，純度也很低。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了克服上述存在的問題，提供一種科學地提取 蕨菜多糖，并能保持蕨菜多糖的生物活性，最大限度地提高蕨菜多糖 提取率的方法。本發(fā)明的多糖的提取分離方法是利用多糖、糖蛋白溶于水的特 性，用熱水浸提法，并用乙醇沉淀的方法分離，最后用陰離子交換層 析和凝膠排阻層析純化多糖。具體包括以下步驟 1)取蕨菜粉碎過40~80目篩，用2~4倍90%乙醇在80 100。C回流浸提0.5~2小時；2) 去掉乙醇后加水在60 90。C水洛上提取2-3次，每次2 4小時；3) 將上述浸提液離心4800rpm， 10min，棄沉淀，取上清液；4) 用Sevage方法脫去上清蛋白在上清液中加等體積的氯仿-正丁 醇，氯仿與正丁醇的體積比為4: 1，充分震蕩后靜置10分鐘， 4000-6000 rpm離心IO分鐘，反復多次直至完全脫去蛋白。5) 乙醇沉淀的方法分離將脫去蛋白的溶液在50'C 6(TC減壓蒸餾 濃縮，加入2 3倍于該溶液體積的乙醇進行沉淀，離心收集沉淀，干 燥，得粗多糖；6) 陰離子交換柱和凝膠排阻層析純化多糖取粗多糖溶于去離子水 或pH值為7~8,濃度為10~50mmol/L的Tris-HCl緩沖液，制成飽和 溶液，4800rpm離心棄沉淀，將上清樣于DEAE-Sepharose Fast Flow 柱，以上述的Tris-HCl為洗脫液，再用濃度為0.2 0.8mol/LNaCl梯 度洗脫，苯酚-硫酸法跟蹤檢測樣品在490nm的吸收值，收集單一 峰，透析去離子后上樣于SephacrylS-400HR或Sephadex G-100柱， 以去離子水進行洗脫。用苯酚硫酸法跟蹤檢測多糖，用紫外分光光度 計在280nrn測定吸收值，確定蛋白的含量，收集單一峰，冷凍干燥 得純化的單一蕨菜多糖。本發(fā)明中，若釆用新鮮蕨菜，則新鮮蕨菜與蒸餾水以重量比1: 3的比例混合,若釆用干蕨菜粉，則干蕨菜與蒸餾水以重量比1: 15~25 的比例混合。步驟6)中所述的用于蕨菜多糖的檢測苯酚-硫酸法為將0.2ml 樣品用蒸餾水稀釋到2 ml，加入6%的苯酚溶液lml，再加入5 ml濃 硫酸，反應30分鐘后再用紫外分光光度計在490nm處檢測OD值。優(yōu)選地，本發(fā)明步驟2)中水的用量為20倍于樣品的重量，溫 度在60 75X:提取2次，每次2.5 3.5小時；優(yōu)選地，提取溫度是62 68 °。提取2次，每次2.5-3.5小時；更優(yōu)選地，是65'C，提取2次，每次3小時。本發(fā)明步驟5)中在-6(TC真空冷凍干燥8 12小時 本發(fā)明步驟6)中采用流動水透析；Tris-HCl和去離子水洗脫的 流速控制在2ml/min 。本發(fā)明方法以干蕨菜為原料，提取、純化各種蕨菜多糖、糖蛋白， 多糖的提取率高，經(jīng)優(yōu)化后的提取率為2.02%,經(jīng)過純化的多糖純度 在98%以上；除色素徹底、水溶性好，并且能保持多糖和糖蛋白的 生物活性。本發(fā)明方法簡單合理，適合于大規(guī)模生產(chǎn)，且能普遍應用 于各種蕨類植物多糖和糖蛋白的分離純化。
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于此實施例。實施例1:1. 蕨菜粗多糖的制備取干蕨菜粉100g，粉碎過后過40目篩，加入100ml90%乙醇在 90。C回流浸提l小時。去掉乙醇后，加入2000ml水，在65。C水洛上 提取2次，每次3小時。離心后取上清液，加入等體積的氯仿-正丁 醇，氯仿與正丁醇的體積比為4: 1，充分振蕩，靜置10分鐘，4500 rpm離心10分鐘。重復以上步驟，直至無沉淀。上清在55。C減壓蒸 餾濃縮，取上清液，然后用2.5倍體積乙醇沉淀，直至無沉淀析出。 最后沉淀在-60'C真空冷凍干燥IO小時后得粗多糖。再用苯酚-硫 酸法在490nm檢測多糖，用紫外分光光度計在280nm測定吸收值， 確定蛋白的含量。2. 蕨菜多糖的精制將上述500mg粗多糖溶解于20mlpH值為7.5，濃度為40 mmol/L 的Tris-HCl中，4800 rpm離心10分鐘棄沉淀。將上清上樣于 DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH值為7.5的Tris-HCl作洗脫液，以濃度為0.5mol/L的NaCl作梯度洗脫，流速控制在2ml/min。收集 的產(chǎn)物用本發(fā)明所述的苯酚-硫酸法在490nrn處檢測光吸收值，得 到三個吸收峰。分別收集三個吸收峰(組分I 、 II、 III),并在去離 子水中透析脫鹽。將透析后溶液濃縮，再分別上樣于SephacrylS-400 HR柱，以去離子水作洗脫液，流速控制在2ml/min,同樣用苯酴硫 酸法跟蹤檢測多糖，在280nm檢測蛋白質(zhì)，確定蛋白的含量。結(jié)果 表明，組分I、 II、 in過SephacrylS-400HR后是一個對稱峰，說明 此組分為單一組分，將組分I冷凍干燥后得白色蓬松的蕨菜多糖，易 溶于水。 實施例21. 蕨菜粗多糖的制備取干蕨菜粉100g,粉碎過后過80目篩，加入100ml90%乙醇在 IO(TC回流浸提2小時。去掉乙醇后，加入2500ml水，在90。C水洛 上提取3次，每次4小時。離心后取上清液，加入等體積的氯仿-正 丁醇，氯仿與正丁醇的體積比為4: 1，充分振蕩，靜置10分鐘，4500 rpm離心10分鐘。重復以上步驟，直至無沉淀。上清在5(TC減壓蒸 餾濃縮，取上清液，然后用2倍體積乙醇沉淀，直至無沉淀析出。最 后沉淀在-6(TC真空冷凍干燥12小時后得粗多糖。再用苯酚-硫酸 法在4卯nm檢測多糖，用紫外分光光度計在280nm測定吸收值，確 定蛋白的含量。2. 蕨菜多糖的精制將上述500mg粗多糖溶解于20mlpH值為8.0，濃度為50 mmol/L 的Tris-HCl中，4800 rpm離心10分鐘棄沉淀。將上清上樣于 DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH值為8.0的Tris-HCl作洗脫液， 以濃度為O.8mol/L的NaCl作梯度洗脫，流速控制在2ml/min。收集 的產(chǎn)物用本發(fā)明所述的苯酚-硫酸法在490nrn處檢測光吸收值，得 到三個吸收峰。分別收集三個吸收峰(組分I 、 II、 III)，并在去離子水中透析脫鹽。將透析后溶液濃縮，再分別上樣于SephacrylS-400 HR柱，以去離子水作洗脫液，流速控制在2ml/min，同樣用苯酚硫 酸法跟蹤檢測多糖，在280nm檢測蛋白質(zhì)，確定蛋白的含量。結(jié)果 表明，組分I、 II、 ni過SephacrylS-400HR后是一個對稱峰，說明 此組分為單一組分，將組分I冷凍干燥后得白色蓬松的蕨菜多糖，易 溶于水。 實施例31. 蕨菜粗多糖的制備取干蕨菜粉100g，粉碎過后過60目篩，加入100ml90%乙醇在 80。C回流浸提0.5小時。去掉乙醇后，加入1500ml水，在75。C水洛 上提取2次，每次3.5小時。離心后取上清液，加入等體積的氯仿-正丁醇，氯仿與正丁醇的體積比為4: 1,充分振蕩，靜置10分鐘， 4500rpm離心IO分鐘。重復以上步驟，直至無沉淀。上清在6(TC減 壓蒸餾濃縮，取上清液，然后用3倍體積乙醇沉淀，直至無沉淀析出。 最后沉淀在-6(TC真空冷凍干燥8小時后得粗多糖。再用苯酚-硫酸 法在490nm檢測多糖，用紫外分光光度計在280nm測定吸收值，確 定蛋白的含量。2. 蕨菜多糖的精制將上述500mg粗多糖溶解于20mlpH值為7.0,濃度為20 mmol/L 的Tris-HCl中，4800 rpm離心10分鐘棄沉淀。將上清上樣于 DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH值為7.0的Tris-HCl作洗脫液， 以濃度為0.6mol/L的NaCl作梯度洗脫，流速控制在2ml/min。收集 的產(chǎn)物用本發(fā)明所述的苯酚-硫酸法在4卯nm處檢測光吸收值，得 到三個吸收峰。分別收集三個吸收峰(組分I 、 II、 III)，并在去離 子水中透析脫鹽。將透析后溶液濃縮，再分別上樣于SephacrylS-400 HR柱，以去離子水作洗脫液，流速控制在2ml/min,同樣用苯酚硫 酸法跟蹤檢測多糖，在280nm檢測蛋白質(zhì)，確定蛋白的含量。結(jié)果表明，組分I、 II、 ni過SephacrylS-400HR后是一個對稱峰，說明此組分為單一組分，將組分I冷凍干燥后得白色蓬松的蕨菜多糖，易溶于水。實施例41. 蕨菜粗多糖的制備取干蕨菜粉100g,粉碎過后過60目篩，加入100ml90。/。乙醇在 80。C回流浸提2小時。去掉乙醇后，加入1800ml水，在68t:水浴上 提取2次，每次3小時。離心后取上清液，加入等體積的氯仿-正丁 醇，氯仿與正丁醇的體積比為4: 1,充分振蕩，靜置10分鐘，4500 rpm離心10分鐘。重復以上步驟，直至無沉淀。上清在58t:減壓蒸 僧濃縮，取上清液，然后用2倍體積乙醇沉淀，直至無沉淀析出。最 后沉淀在-60°C真空冷凍干燥9小時后得粗多糖。再用苯酚-硫酸法 在490nm檢測多糖，用紫外分光光度計在280nm測定吸收值，確定 蛋白的含量。2. 蕨菜多糖的精制將上述500mg粗多糖溶解于20ml去離子水中，4800 rpm離心 IO分鐘棄沉淀。將上清上樣于DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH 值為7.6,濃度為20mmol/L的Tris-HCl作洗脫液，以濃度為0.4mol/L 的NaCl作梯度洗脫，流速控制在2ml/min。收集的產(chǎn)物用本發(fā)明所 述的苯酴-硫酸法在490nm處檢測光吸收值，得到三個吸收峰。分 別收集三個吸收峰(組分I 、 II、 III),并在去離子水中透析脫鹽。 將透析后溶液濃縮，再分別上樣于S印hacrylS-400HR柱，以去離子 水作洗脫液，流速控制在2ml/min,同樣用苯酚硫酸法跟蹤檢測多糖， 在280nm檢測蛋白質(zhì)，確定蛋白的含量。結(jié)果表明，組分I 、 II、 III過Sephacryl S-400HR后是一個對稱峰，說明此組分為單一組分， 將組分I冷凍干燥后得白色蓬松的蕨菜多糖，易溶于水。 實施例51. 蕨菜粗多糖的制備取干蕨菜粉100g,粉碎過后過60目篩，加入100ml90%乙醇在 8(TC回流浸提2小時。去掉乙醇后，加入2200ml水，在62。C水洛上 提取2次，每次3.5小時。離心后取上清液，加入等體積的氯仿-正 丁醇，氯仿與正丁醇的體積比為4: 1,充分振蕩，靜置10分鐘，4500 rpm離心10分鐘。重復以上步驟，直至無沉淀。上清在53t:減壓蒸 餾濃縮，取上清液，然后用3倍體積乙醇沉淀，直至無沉淀析出。最 后沉淀在-60'C真空冷凍干燥11小時后得粗多糖。再用苯酴-硫酸 法在490nm檢測多糖，用紫外分光光度計在280nm測定吸收值，確 定蛋白的含量。2. 蕨菜多糖的精制將上述500mg粗多糖溶解于20mlpH值為7.8，濃度為20 mmol/L 的Tris-HCl中，4800 rpm離心10分鐘棄沉淀。將上清上樣于 DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH值為7.8的Tris-HCl作洗脫液， 以濃度為O.lmol/L的NaCl作梯度洗脫，流速控制在2ml/min。收集 的產(chǎn)物用本發(fā)明所述的苯酚-硫酸法在490nrn處檢測光吸收值，得 到三個吸收峰。分別收集三個吸收峰(組分I 、 II、 III),并在去離 子水中透析脫鹽。將透析后溶液濃縮，再分別上樣于SephacrylS-400 HR柱，以去離子水作洗脫液，流速控制在2ml/min,同樣用苯酚硫 酸法跟蹤檢測多糖，在280nm檢測蛋白質(zhì)，確定蛋白的含量。結(jié)果 表明，組分I、 II 、 ni過SephacrylS-400HR后是一個對稱峰,說明 此組分為單一組分，將組分I冷凍干燥后得白色蓬松的蕨菜多糖，易 溶于水。 實施例6l.蕨菜粗多糖的制備取干蕨菜粉100g，粉碎過后過60目篩，加入100ml90%乙醇在 80'C回流浸提2小時。去掉乙醇后，加入1600ml水，在62""C水洛上提取2次，每次2.5小時。離心后取上清液，加入等體積的氯仿-正丁醇，氯仿與正丁醇的體積比為4: 1，充分振蕩，靜置10分鐘，4500 rpm離心10分鐘。重復以上步驟，直至無沉淀。上清在52"減壓蒸 餾濃縮，取上清液，然后用3倍體積乙醇沉淀，直至無沉淀析出。最 后沉淀在-60'C真空冷凍干燥IO小時后得粗多糖。再用苯酚-硫酸 法在490nm檢測多糖，用紫外分光光度計在280nm測定吸收值，確 定蛋白的含量。2.蕨菜多糖的精制將上述500mg粗多糖溶解于20ml去離子水中，4800 rpm離心 IO分鐘棄沉淀。將上清上樣于DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH 值為7.8,濃度為30mmol/L的Tris-HCl作洗脫液，以濃度為0.2mol/L 的NaCl作梯度洗脫，流速控制在2ml/min。收集的產(chǎn)物用本發(fā)明所 述的苯酚-硫酸法在4卯nm處檢測光吸收值，得到三個吸收峰。分 別收集三個吸收峰(組分I 、 II、 III)，并在去離子水中透析脫鹽。 將透析后溶液濃縮，再分別上樣于SephacrylS-400HR柱，以去離子 水作洗脫液，流速控制在2ml/min,同樣用苯酚硫酸法跟蹤檢測多糖， 在280nm檢測蛋白質(zhì)，確定蛋白的含量。結(jié)果表明，組分I 、 II、 III過Sephacryl S-400 HR后是一個對稱峰，說明此組分為單一組分， 將組分I冷凍干燥后得白色蓬松的蕨菜多糖，易溶于水。 實施例7l.蕨菜粗多糖的制備取新鮮蕨菜粉100g，粉碎過后過60目篩，加入100ml卯。/。乙醇 在80'C回流浸提2小時。去掉乙醇后，加入300ml水，在65T水洛 上提取2次，每次3小時。離心后取上清液，加入等體積的氯仿-正 丁醇，氯仿與正丁醇的體積比為4: 1,充分振蕩，靜置10分鐘，4500 rpm離心10分鐘。重復以上步驟，直至無沉淀。上清在55匸減壓蒸 餾濃縮，取上清液，然后用2.5倍體積乙醇沉淀，直至無沉淀析出。最后沉淀在-6(TC真空冷凍干燥IO小時后得粗多糖。再用苯酴-硫 酸法在490nm檢測多糖，用紫外分光光度計在280nm測定吸收值， 確定蛋白的含量。2.蕨菜多糖的精制將上述500mg粗多糖溶解于20mlpH值為7.5,濃度為30 mmol/L 的Tris-HCl中，4800 rpm離心10分鐘棄沉淀。將上清上樣于 DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH值為7.5的Tris-HCl作洗脫液， 以濃度為0.4mol/L的NaCl作梯度洗脫，流速控制在2ml/min。收集 的產(chǎn)物用本發(fā)明所述的苯酚-硫酸法在490nrn處檢測光吸收值，得 到三個吸收峰。分別收集三個吸收峰(組分I 、 II、 III),并在去離 子水中透析脫鹽。將透析后溶液濃縮，再分別上樣于SephacrylS-400 HR柱，以去離子水作洗脫液，流速控制在2ml/min,同樣用苯酴硫 酸法跟蹤檢測多糖，在280nm檢測蛋白質(zhì)，確定蛋白的含量。結(jié)果 表明，組分I、 II、 in過SephacrylS-400HR后是一個對稱峰，說明 此組分為單一組分，將組分I冷凍干燥后得白色蓬松的蕨菜多糖，易 溶于水。
權利要求
1.一種蕨菜多糖的提取分離方法，包括以下步驟1)取蕨菜粉碎過篩，用乙醇回流浸提；2)去掉乙醇后用水浴上提?。?)將上述浸提液離心、棄沉淀，取上清液；4)將上清液脫去蛋白；5)乙醇沉淀的方法分離在脫去蛋白的溶液中加入乙醇進行沉淀，離心收集沉淀，干燥，得粗多糖；6)陰離子交換柱和凝膠排阻層析純化多糖。
2. 根據(jù)權利要求1所述的蕨菜多糖的提取分離方法，其特征在 于，包括以下步驟1) 取蕨菜粉碎過篩，用2~4倍卯％乙醇在80 100。C回流浸提0.5-2 小時；2) 去掉乙醇加水，在60 90。C水浴上提取2 3次，每次2 4小時；3) 將上述浸提液離心、棄沉淀，取上清液；4) 用Sevage方法脫去上清蛋白；5) 乙醇沉淀的方法分離在脫去蛋白的溶液中加入2 3倍于該溶液 體積的乙醇進行沉淀，離心收集沉淀，干燥，得粗多糖；6) 陰離子交換柱和凝膠排阻層析純化多糖取粗多糖溶于去離子水 或Tris-HCl緩沖液，制成飽和溶液，離心棄沉淀，將上清樣于陰離子 交換柱DEAE-Sepharose Fast Flow,以上述的Tris-HCl為洗脫液，再 用NaCl梯度洗脫，苯酚-硫酸法跟蹤檢測，收集單一峰，透析去離 子后上樣于凝膠排阻層析柱，以去離子水進行洗脫。用苯酴硫酸法跟 蹤檢測，收集單一峰，冷凍干燥得純化的單一蕨菜多糖；步驟l)中的樣品可以是干蕨菜或新鮮蕨菜；步驟2)中水的用 量是干蕨菜樣品重量的15 25倍或新鮮蕨菜樣品重量的3倍。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的蕨菜多糖的提取分離方法，其特征在于，步驟2)中水的用量是干蕨菜樣品重量的20倍，在60 75。C 提取2.5~3.5小時。
4. 根據(jù)權利要求3所述的蕨菜多糖的提取分離方法，其特征在 于，提取溫度在62 68'C。
5. 根據(jù)權利要求3所述的蕨菜多糖的提取分離方法，其特征在 于，提取溫度是65'C，提取2次，每次3小時。
6. 根據(jù)權利要求1所述的蕨菜多糖的提取分離方法，其特征在 于，步驟5)中在-6(TC真空冷凍干燥8 12小時。
7. 根據(jù)權利要求1或2所述的蕨菜多糖的提取分離方法，其特 征在于，步驟6)中的陰離子交換柱是DEAE-SepharoseFastFlow柱； Tris-HCl緩沖液pH值為7 8，濃度為10~50mmol/L; NaCl梯度洗脫 液濃度為0.2~0.8 mol/L。
8. 根據(jù)權利要求1所述的蕨菜多糖的提取分離方法，其特征在 于，凝膠排阻層析柱是Sephacryl S-400 HR或Sephadex G-100柱。
9. 根據(jù)權利要求1所述的蕨菜多糖的提取分離方法，其特征在 于，步驟6)中釆用流動水透析；Tris-HCl和去離子水洗脫的流速控 制在2ml/min。
10. 根據(jù)權利要求l所述的蕨菜多糖的提取分離方法，其特征在 于，步驟4)中的Sevage方法是在上清液中加等體積的氯仿-正丁 醇，氯仿與正丁醇的體積比為4: 1,充分震蕩后靜置10分鐘， 4000 6000rpm離心IO分鐘，反復多次直至完全脫去蛋白；步驟6) 中所述的苯酚-硫酸法為將0.2ml樣品用蒸餾水稀釋到2ml，加入 6。/。的苯酚溶液lml，再加入5 ml濃硫酸，反應30分鐘后再用紫外 分光光度計在490nm出檢測OD值。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蕨菜多糖的提取分離純化方法，旨在解決現(xiàn)有方法提取出的蕨菜多糖含色素多、水溶性差、提取率不高、純度低的問題。為解決上述問題，本發(fā)明采用熱水浸提法浸取，并用乙醇沉淀的方法分離，最后用陰離子交換柱和凝膠排阻層析純化多糖。本發(fā)明方法適合于大規(guī)模生產(chǎn)，且能普遍應用于各種蕨類植物多糖、糖蛋白的分離純化。
文檔編號A23L1/212GK101228949SQ20081005786
公開日2008年7月30日 申請日期2008年2月19日 優(yōu)先權日2008年2月19日
發(fā)明者張方方, 羅云波, 許文濤, 黃昆侖 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學