本發(fā)明涉及食用菌加工領(lǐng)域，具體涉及一種桑黃子實(shí)體細(xì)胞壁活性粗多糖的制備方法。
背景技術(shù)：
鮑氏針層孔菌(Phellinus baumii Pilat)，俗稱桑黃，是一種多年生、黃褐色的珍貴的藥用真菌，有“森林黃金”之美稱。桑黃具有抗腫瘤、提高免疫、延緩衰老、護(hù)肝、鎮(zhèn)痛等作用，已在功能食品和臨床上得到廣泛應(yīng)用。
作為珍稀藥用真菌，桑黃的主要活性成分是多糖，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)桑黃多糖的研究和利用主要集中在水溶性胞內(nèi)多糖及其抗癌效果，相關(guān)的制備工藝已有很多報(bào)道。但目前常規(guī)水提子實(shí)體胞內(nèi)多糖的提取得率非常低，大概在1％-2％左右，大量的多糖還殘留在子實(shí)體細(xì)胞壁中。水提胞內(nèi)多糖后的桑黃殘?jiān)糠浅？捎^，含有豐富的細(xì)胞壁多糖，這部分多糖通常沒(méi)有繼續(xù)提取利用而被丟棄，具有很大的研究?jī)r(jià)值，因此提取桑黃子實(shí)體細(xì)胞壁活性多糖是很好的發(fā)展方向；另一方面，目前國(guó)內(nèi)外桑黃多糖的產(chǎn)品主要是常規(guī)水提醇沉得到的子實(shí)體胞內(nèi)多糖，且多糖含量不高，僅為30％左右，分子量主要集中在幾十萬(wàn)到一百萬(wàn)之間。
中國(guó)專利CN103319618A公開了一種桑黃菌絲體活性多糖的制備方法，其包括步驟：培養(yǎng)菌絲體、菌絲體多糖的提取，其制備的多糖含量較低，具體為16～38％。
因此，對(duì)子實(shí)體細(xì)胞壁中分子量在兩百萬(wàn)以上的大分子多糖進(jìn)行挖掘，有助于珍稀藥用真菌資源的進(jìn)一步開發(fā)利用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種桑黃子實(shí)體細(xì)胞壁活性粗多糖的制備方法，該制備方法簡(jiǎn)單，制備所得的活性粗多糖含量較高，分子量較大。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一方面，本發(fā)明提供一種桑黃子實(shí)體細(xì)胞壁活性粗多糖的制備方法，包括如下步驟：
步驟一、子實(shí)體殘?jiān)奶幚恚簩⒆訉?shí)體水提胞內(nèi)多糖的殘?jiān)弥兴幏鬯闄C(jī)粉碎，過(guò)篩。加水常溫浸泡后沸水反復(fù)提取，棄去水提液，以除去水溶性胞內(nèi)多糖。將反復(fù)水提取后的桑黃殘?jiān)娓?，備用?/p>
步驟二、桑黃殘?jiān)某?xì)粉碎：采用超微粉碎震動(dòng)磨機(jī)將步驟一所得的桑黃殘?jiān)鬯?，過(guò)篩。
步驟三、桑黃子實(shí)體細(xì)胞壁活性粗多糖的提?。簩⒉襟E二超微粉碎后的桑黃殘?jiān)屑尤胨?，常溫浸泡，加蒸餾水沸水浴提取，濾渣重復(fù)提取，合并提取液；在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮提取液至物料比為1:1.2-1.5，制備濃縮液；取濃縮液離心去除不溶性雜質(zhì)，留取離心液；在離心液中加乙醇沉淀，分離沉淀物，使用與乙醇沉淀濃度相同的酒精對(duì)沉淀物進(jìn)行反復(fù)洗滌，然后使用水溶解沉淀物，用透析袋進(jìn)行透析去除沉淀物中的小分子物質(zhì)，最后對(duì)去除小分子物質(zhì)的沉淀物進(jìn)行冷凍干燥，以獲得桑黃子實(shí)體細(xì)胞壁活性粗多糖。
為了進(jìn)一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：
優(yōu)選地，本發(fā)明所述的桑黃子實(shí)體細(xì)胞壁活性粗多糖的制備方法還包括對(duì)桑黃子實(shí)體細(xì)胞壁活性粗多糖進(jìn)行進(jìn)一步純化的步驟。
優(yōu)選地，所述步驟一中過(guò)篩的目數(shù)為20目，所述步驟二中過(guò)篩的目數(shù)為200目。
優(yōu)選地，所述步驟二中超微粉碎震動(dòng)磨機(jī)的操作溫度為-10℃，操作時(shí)間為10～20min，優(yōu)選15min。
優(yōu)選地，所述步驟三的具體操作參數(shù)如下：將步驟二超微粉碎后的桑黃殘?jiān)屑尤?0-15倍重量的水，常溫浸泡30-60min，加蒸餾水沸水浴提取1-3h，濾渣重復(fù)提取2-3次，合并提取液；在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮提取液至物料比為1:1.2-1.5，制備濃縮液；取濃縮液，8000-12000×g離心15-30min去除不溶性雜質(zhì)，留取離心液；在離心液中加乙醇沉淀20h以上，分離沉淀物，使用與乙醇沉淀濃度相同的酒精對(duì)沉淀物進(jìn)行反復(fù)洗滌，然后使用水溶解沉淀物，用8000-10000分子量透析袋透析2-4d，去除沉淀物中的小分子物質(zhì)，最后對(duì)去除小分子物質(zhì)的沉淀物進(jìn)行冷凍干燥，以獲得桑黃子實(shí)體細(xì)胞壁活性粗多糖。
優(yōu)選地，所述乙醇沉淀采用的乙醇濃度為20％-80％，更優(yōu)選乙醇濃度為20-60％，進(jìn)一步優(yōu)選乙醇濃度為20-25％。
優(yōu)選地，所述冷凍干燥的桑黃子實(shí)體細(xì)胞壁活性粗多糖的含量在50％以上，更優(yōu)選含量在65％以上，進(jìn)一步優(yōu)選含量在75％以上。
優(yōu)選地，所述桑黃子實(shí)體細(xì)胞壁活性粗多糖的分子量為40k Da-3500k Da，更優(yōu)選地在2000k Da以上。
另一方面，本發(fā)明還提供一種含有所述桑黃子實(shí)體細(xì)胞壁活性粗多糖的應(yīng)用，所述桑黃子實(shí)體細(xì)胞壁活性粗多糖用于提高人或動(dòng)物體的免疫力。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明所述的制備方法采用桑黃子實(shí)體提取后的殘?jiān)鼮樵?，?shí)現(xiàn)了廢棄物循環(huán)再利用，有效節(jié)約了制備成本；本發(fā)明所述的制備方法工藝簡(jiǎn)單，增設(shè)超微粉碎步驟，使得殘?jiān)牧６确植季鶆?，比表面積增大，在進(jìn)行提取步驟時(shí)殘?jiān)c水的接觸面積增大，有效提高了粗多糖的提取率；采用本發(fā)明所述的制備方法，其能獲得穩(wěn)定的大分子桑黃子實(shí)體細(xì)胞壁活性粗多糖，且活性粗多糖的含量較高，具有優(yōu)良的免疫活性。
附圖說(shuō)明
圖1是根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施例制備的桑黃子實(shí)體細(xì)胞壁活性粗多糖的液相色譜圖，其乙醇沉淀采用的乙醇濃度為20％。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來(lái)限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1
本實(shí)施例為一種桑黃子實(shí)體細(xì)胞壁活性粗多糖的制備方法，其步驟如下：
步驟一、子實(shí)體殘?jiān)奶幚恚簩⒆訉?shí)體水提胞內(nèi)多糖的殘?jiān)弥兴幏鬯闄C(jī)粉碎，過(guò)20目篩。再加15倍的水提取，100℃提取3h，棄去水提液。反復(fù)此步驟9-10遍，以除去水溶性胞內(nèi)多糖。將反復(fù)水提取后的桑黃殘?jiān)娓?，備用?/p>
步驟二、桑黃殘?jiān)某?xì)粉碎：采用超微粉碎震動(dòng)磨機(jī)-10℃下將步驟一所得殘?jiān)鬯?5min，過(guò)200目篩。采用此步驟可將物料粉碎至數(shù)微米，其能使殘?jiān)牧６确植季鶆颍缺砻娣e增大，在進(jìn)行提取步驟時(shí)殘?jiān)c水的接觸面積增大，以利于大分子的細(xì)胞壁多糖的溶出，有效提高了粗多糖的提取率。
步驟三、細(xì)胞壁多糖的提?。簩⒉襟E二超微粉碎后的殘?jiān)屑尤?5倍重量的水，常溫浸泡60min，加蒸餾水沸水浴提取3h，濾渣重復(fù)提取2-3次，合并提取液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓提取液濃縮至物料比1:1.2，制備濃縮液；取濃縮液，10000×g離心30min去除不溶性雜質(zhì)，留取離心液；取三份離心液分別加無(wú)水乙醇至酒精終濃度為20％、50％、70％，靜止沉淀24h，然后采用10000×g離心20min分別分離出沉淀物；然后分別用對(duì)應(yīng)酒精終濃度(即20％、50％、70％)的乙醇分別反復(fù)洗滌對(duì)應(yīng)的沉淀物，最后分別用去離子水洗對(duì)應(yīng)的沉淀物，在水浴鍋上進(jìn)行乙醇的揮發(fā)，用8000分子量透析袋(MD34，截留分子量8000)分別透析3d，去除小分子物質(zhì)，采用冷凍干燥儀進(jìn)行冷凍干燥分別得到桑黃細(xì)胞壁粗多糖。
步驟四、總糖含量的測(cè)定：用硫酸-苯酚測(cè)定多糖含量，20％、50％、70％不同濃度的酒精醇沉制備的粗多糖中多糖含量分別為86.12％，53.18％，57.83％。
實(shí)施例2
本實(shí)施例為另一種桑黃子實(shí)體細(xì)胞壁活性粗多糖的制備方法，其步驟一、步驟二與實(shí)施例1相同，步驟三和步驟四如下：
步驟三、細(xì)胞壁多糖的提?。簩⒉襟E二超微粉碎后的殘?jiān)屑尤?0倍重量的水，常溫浸泡30min，加蒸餾水沸水浴提取1h，濾渣重復(fù)提取2-3次，合并提取液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓提取液濃縮至物料比1:1.5，制備濃縮液；取濃縮液，12000×g離心15min去除不溶性雜質(zhì)，留取離心液；取離心液加無(wú)水乙醇至酒精終濃度為40％，靜止沉淀30h，然后采用12000×g離心15min分離出沉淀物；然后用對(duì)應(yīng)酒精終濃度(即40％)的乙醇反復(fù)洗滌沉淀物，最后用去離子水洗沉淀物，在水浴鍋上進(jìn)行乙醇的揮發(fā)，用10000分子量透析袋透析4d，去除小分子物質(zhì)，采用冷凍干燥儀進(jìn)行冷凍干燥分別得到桑黃細(xì)胞壁粗多糖。
步驟四、總糖含量的測(cè)定：用硫酸-苯酚測(cè)定多糖含量，40％濃度的酒精醇沉制備的粗多糖中多糖含量為70.75％。
實(shí)施例3
本實(shí)施例為另一種桑黃子實(shí)體細(xì)胞壁活性粗多糖的制備方法，其步驟一、步驟二與實(shí)施例1相同，步驟三和步驟四如下：
步驟三、細(xì)胞壁多糖的提取：將步驟二超微粉碎后的殘?jiān)屑尤?2倍重量的水，常溫浸泡45min，加蒸餾水沸水浴提取2h，濾渣重復(fù)提取2-3次，合并提取液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓提取液濃縮至物料比1:1.3，制備濃縮液；取濃縮液，8000×g離心30min去除不溶性雜質(zhì)，留取離心液；取離心液加無(wú)水乙醇至酒精終濃度為60％，靜止沉淀22h，然后采用8000×g離心30min分離出沉淀物；然后用對(duì)應(yīng)酒精終濃度(即60％)的乙醇反復(fù)洗滌沉淀物，最后用去離子水洗沉淀物，在水浴鍋上進(jìn)行乙醇的揮發(fā)，用9000分子量透析袋透析2d，去除小分子物質(zhì)，采用冷凍干燥儀進(jìn)行冷凍干燥分別得到桑黃細(xì)胞壁粗多糖。
步驟四、總糖含量的測(cè)定：用硫酸-苯酚測(cè)定多糖含量，60％濃度的酒精醇沉制備的粗多糖中多糖含量為65.53％。
實(shí)施例4
本實(shí)施例為另一種桑黃子實(shí)體細(xì)胞壁活性粗多糖的制備方法，其步驟一、步驟二與實(shí)施例1相同，步驟三和步驟四如下：
步驟三、細(xì)胞壁多糖的提?。簩⒉襟E二超微粉碎后的殘?jiān)屑尤?5倍重量的水，常溫浸泡60min，加蒸餾水沸水浴提取3h，濾渣重復(fù)提取2-3次，合并提取液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓提取液濃縮至物料比1:1.5，制備濃縮液；取濃縮液，10000×g離心30min去除不溶性雜質(zhì)，留取離心液；取離心液加無(wú)水乙醇至酒精終濃度為25％，靜止沉淀24h，然后采用8000×g離心30min分離出沉淀物；然后用對(duì)應(yīng)酒精終濃度(即25％)的乙醇反復(fù)洗滌沉淀物，最后用去離子水洗沉淀物，在水浴鍋上進(jìn)行乙醇的揮發(fā)，用10000分子量透析袋透析3d，去除小分子物質(zhì)，采用冷凍干燥儀進(jìn)行冷凍干燥分別得到桑黃細(xì)胞壁粗多糖。
步驟四、總糖含量的測(cè)定：用硫酸-苯酚測(cè)定多糖含量，25％濃度的酒精醇沉制備的粗多糖中多糖含量為75.82％。
實(shí)施例5
采用HPSEC-MALLS-RI聯(lián)用測(cè)定細(xì)胞壁多糖的分子量，本實(shí)施例采用實(shí)施例1中制備的桑黃細(xì)胞壁粗多糖作為樣品，其乙醇沉淀采用的乙醇濃度分別為20％、50％、70％。
樣品前處理：稱取2mg樣品，溶解于1mL流動(dòng)相中，配制成濃度2mg/mL的溶液。用12000×g離心10min后取上清液，經(jīng)0.25μm的水相微孔膜過(guò)濾后進(jìn)行HPSEC-MALLS-RI分析。
分析柱選TSK PWXL6000和TSK PWXL3000凝膠色譜柱串聯(lián)后分析，流動(dòng)相為含0.05mol/L的NaH2PO4和0.15mol/L的NaNO3溶液(pH＝7，0.02％疊氮鈉)，流速為0.5mL/min，色譜柱溫用柱溫箱恒定在35℃；激光檢測(cè)器光源波長(zhǎng)選用623.8nm。多糖在溶液中的折光指數(shù)增量(dn/dc)按照0.146mL/g計(jì)算。
使用Astra(version 6.1.1,Wyatt Technology,Santa Barbara,CA)數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)光散射數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和分析，計(jì)算分子量。20％、50％、70％不同濃度的酒精醇沉制備得到的粗多糖中分子量段分別集中在2500-3500kDa，300-600kDa，40-80kDa之間。如圖1所示，20％的酒精醇沉制備得到細(xì)胞壁粗多糖主峰分子量為Mw＝3159kDa，其為超微粉碎過(guò)程中溶出的大分子的細(xì)胞壁多糖。
實(shí)施例6
對(duì)桑黃細(xì)胞壁多糖體外免疫活性的研究，本實(shí)施例采用實(shí)施例1中制備的桑黃細(xì)胞壁粗多糖，其乙醇沉淀采用的乙醇濃度分別為20％、50％、70％。
測(cè)定細(xì)胞壁粗多糖的免疫活性，主要進(jìn)行體外刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放NO量的試驗(yàn)。
NO在體內(nèi)很容易被氧化，并且形成亞硝酸鹽，Griess法測(cè)定培養(yǎng)上清液中亞硝酸鹽的濃度，可以間接反映巨噬細(xì)胞NO釋放量。
具體操作步驟：取出超低溫冰箱凍存的細(xì)胞，1000rpm離心3min，去除凍存液，收集細(xì)胞，平均分配到裝有DMEM完全培養(yǎng)基的小培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，定期換液，待細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶瓶底80～90％時(shí)，用37℃加熱的0.25％胰酶溶液消化，消化液于1000rpm離心3min，收集細(xì)胞，用無(wú)色1640完全培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至5×105個(gè)/mL,計(jì)算好所需孔數(shù)，向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入180μL細(xì)胞稀釋液，然后加入20μL待測(cè)樣品，每個(gè)樣品濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以LPS(10μg/mL)為陽(yáng)性對(duì)照，PBS為陰性對(duì)照，將96孔板置于37℃、5％CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)48h，然后吸取每孔上清液100μL，加入50μL Griess試劑，放置10min，543nm測(cè)定吸光度值。
結(jié)果表明，100ug/ml的酒精終濃度為20％、50％、70％醇沉得到桑黃子實(shí)體細(xì)胞壁粗多糖刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放NO量分別為46.05％、30.16％、45.16％。最終選取20％的酒精終濃度進(jìn)行醇沉，獲得的粗多糖活性較好，接近陽(yáng)性對(duì)照LPS的釋放量50.14％，且分子量大。
實(shí)施例7
對(duì)桑黃細(xì)胞壁多糖單糖組成成分的分析，本實(shí)施例采用實(shí)施例1中制備的桑黃細(xì)胞壁粗多糖，其乙醇沉淀采用的乙醇濃度分別為20％、50％、70％。
樣品前處理：取桑黃細(xì)胞壁粗多糖樣品，用萬(wàn)分之一天平準(zhǔn)確稱取2mg左右于具塞試管中，按照(3mL：2mg)的比例加入2mol/L的TFA，110℃水解4h，冷卻，用旋蒸儀低溫減壓蒸干水解液，接著加入3mL甲醇，減壓蒸干，重復(fù)操作4-5次，以除去殘留的三氟乙酸，將水解產(chǎn)物用去離子水清洗定容至50mL，上樣量為20μL，以單糖標(biāo)準(zhǔn)品Gal，Glu，Ara，F(xiàn)uc，Rha，Man，Xyl，F(xiàn)ru，Rib，GluA和GalA為對(duì)照，用高效陰離子色譜(HPAEC)測(cè)定單糖的組成和摩爾比。
結(jié)果表明，桑黃子實(shí)體細(xì)胞壁粗多糖的主要單糖組成成分為葡萄糖、巖藻糖和葡萄糖醛酸，且單糖組分摩爾比為19.70：2.52：1.00，由上可知桑黃子實(shí)體細(xì)胞壁粗多糖主要為大分子葡聚糖。
對(duì)比例1
中國(guó)專利CN103319618A公開了一種桑黃菌絲體活性多糖的制備方法，其通過(guò)桑黃菌絲體的培養(yǎng)，然后進(jìn)行水提取+乙醇沉淀的方法制備多糖，多糖種類包括巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖，其最終檢測(cè)的多糖含量為16.10％～37.83％。
對(duì)比例2
中國(guó)專利CN105542030A公開了一種從桑黃子實(shí)體中提取水溶性β葡聚糖的方法，其通過(guò)堿液提取+乙醇沉淀的方法制備桑黃粗多糖，并通過(guò)酸水解+水復(fù)溶的方法提取桑黃β水溶性多糖，其最終檢測(cè)的多糖含量為50％以上，具體為58％-65％，平均分子量為2000-200000道爾頓(即20-200k Da)。
實(shí)施例1與對(duì)比例1、對(duì)比例2的多糖含量、平均分子量及多糖類型對(duì)比如下表所示：
通過(guò)上述對(duì)比可知，本發(fā)明所制備的桑黃粗多糖含量明顯高于對(duì)比例1，其高值86％遠(yuǎn)高于對(duì)比例2的65％；本發(fā)明所制備的桑黃粗多糖分子量也相對(duì)高于對(duì)比例1和對(duì)比例2，三者制備的多糖類型也不相同。
由上述實(shí)施例和對(duì)比例可知，本發(fā)明所述的制備方法采用桑黃子實(shí)體提取后的殘?jiān)鼮樵?，?shí)現(xiàn)了廢棄物循環(huán)再利用；本發(fā)明所述的制備方法對(duì)子實(shí)體細(xì)胞壁中分子量在兩百萬(wàn)以上的大分子多糖進(jìn)行挖掘，有助于珍稀藥用真菌資源的進(jìn)一步開發(fā)利用，其所得的多糖含量在50％以上且可高達(dá)75％以上，其制備的多糖分子量在40-3500k Da之間，主要為穩(wěn)定的大分子葡聚糖。
以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)該實(shí)用進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。