本發(fā)明涉及一種果膠酶及其應(yīng)用，屬于酶工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
堿性果膠酶(E.C.4.2.2.2，簡稱PGL)，全稱聚半乳糖醛酸裂解酶，在堿性條件下具有高活性，可以利用反式消去作用切斷聚乳糖醛酸的α-1,4-糖苷鍵，將果膠質(zhì)分解為不飽和的寡聚半乳糖醛酸。該酶廣泛存在于細(xì)菌、酵母菌、真菌、植物以及和某些寄生線蟲。不同來源的堿性果膠酶同源性差異較大。堿性果膠酶廣泛應(yīng)用于食品、紡織、造紙、環(huán)境、生物技術(shù)等各個領(lǐng)域，在茶和咖啡發(fā)酵、紡織和植物纖維加工、油提取、含果膠工業(yè)廢水處理等發(fā)揮巨大作用。
在棉纖維初生細(xì)胞壁的最表面含有很多伴生雜質(zhì)，如：果膠質(zhì)、蠟質(zhì)、含氮物質(zhì)以及蛋白質(zhì)等非纖維素類物質(zhì)，互相包結(jié)成為復(fù)雜龐大的疏水網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。紡織工業(yè)中包含精煉步驟，其目的就是去除棉纖維上的雜質(zhì)，提高棉織物的吸濕功能性，再進行后續(xù)加工。傳統(tǒng)的化學(xué)紡織精煉方法即熱堿法，其需要消耗大量的化學(xué)品與水資源，環(huán)境污染嚴(yán)重，據(jù)統(tǒng)計，印染過程中約70％的廢水是在這個步驟中產(chǎn)生的。除此之外，熱堿處理將對纖維造成嚴(yán)重?fù)p傷，機械強度將大幅下降。
近十幾年來，隨著分子生物學(xué)與工業(yè)微生物研究的迅猛快速發(fā)展，采用基因工程手段構(gòu)建重組菌，以期實現(xiàn)堿性果膠酶的過量重組表達。目前，已相繼出現(xiàn)了利用Escherichia coli、Bacillus subtilis和Pichia pastoris等作為宿主表達不同來源果膠酶基因的報道。
現(xiàn)在對堿性果膠酶的研究主要集中于合成堿性果膠酶工程菌與發(fā)酵過程控制。盡管PGL的表達量很高，但是酶的催化效率耐熱性等酶學(xué)特性還有待進一步改進。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種熱穩(wěn)定性提高的堿性果膠酶突變體。所述突變體是以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的堿性果膠酶(野生型)為基礎(chǔ)，將第229位的絲氨酸S點突變?yōu)橘嚢彼酜、第230位的天冬酰胺N突變?yōu)楦彼酨、第231位的甘氨酸G突變?yōu)橘嚢彼酜。
本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供構(gòu)建所述堿性果膠酶突變體的方法，是通過設(shè)計引物對編碼堿性果膠酶的基因進行定點突變后表達。
所述構(gòu)建方法，優(yōu)選以質(zhì)粒pET-20b(+)-pgl為模板設(shè)計引物進行突變并將突變后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入E.coli JM109進行擴增，然后以E.coli BL21(DE3)表達含突變基因的重組質(zhì)粒，得到熱穩(wěn)定性增強的堿性果膠酶突變體。
本發(fā)明要解決的第三個技術(shù)問題是提供應(yīng)用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)所述堿性果膠酶突變體的方法，是將含有編碼突變堿性果膠酶的基因的重組菌E.coli BL21(DE3)(pET-20b(+)-pgl S229K/N230P/G231K)活化培養(yǎng)后接種到含有發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并以IPTG誘導(dǎo)所述堿性果膠酶突變體的表達。
所述活化培養(yǎng)是將重組菌E.coli BL21(DE3)(pET-20b(+)-pgl S229K/N230P/G231K)接種于含有100μg mL-1氨芐青霉素的種子培養(yǎng)基中，裝液量為20mL/250mL，培養(yǎng)溫度37℃，200rpm min-1搖床上振蕩培養(yǎng)10h。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油5g/L，K2HPO472mmol L-1，KH2PO417mmol L-1。
突變前堿性果膠酶(WT)在經(jīng)過30℃保溫24h，50℃保溫2h，55℃下保溫1h后酶活損失比較明顯；但是突變后的堿性果膠酶(S229K/N230P/G231K)做相同處理后，仍保持較高的殘留酶活。30℃保溫24h后，突變后的殘留酶活比突變前提高了57.4％；50℃保溫2h后，突變后的殘留酶活是突變前的5.8倍；55℃下保溫1h，突變后的殘留酶活是突變前的4.3倍?？偟膩碚f，堿性果膠酶S229K/N230P/G231K在30℃、50℃和55℃下的耐熱性明顯提高。本發(fā)明提供的堿性果膠酶更加適合工業(yè)化生產(chǎn)需求，滿足社會生產(chǎn)的要求。
具體實施方式
堿性果膠酶酶活力檢測：取一定量發(fā)酵液，8000rpm離心10min，胞外堿性果膠酶位于發(fā)酵上清液之中。堿性果膠酶反應(yīng)體系為：酶稀釋液20μL，含0.2％PGA的甘氨酸-NaOH緩沖液(0.2mol L-1，0.44mmol L-1的CaCl2，pH9.4)2mL，無活性的酶液為空白對照。堿性果膠酶反應(yīng)條件為：45℃水浴15min，使用3mL磷酸溶液(0.03mol L-1)終止反應(yīng)，235nm處測定反應(yīng)物吸光度值。
堿性果膠酶酶活單位定義為：1分鐘裂解聚半乳糖醛酸產(chǎn)生1μmol不飽和聚半乳糖醛酸所對應(yīng)酶量。堿性果膠酶酶活計算方法：
(OD235×106×體系體積×酶液稀釋倍數(shù))/(103×比色杯厚度×4600×酶反應(yīng)線性范圍內(nèi)的酶促反應(yīng)時間×酶液體積)
堿性果膠酶純化條件：A液：甘氨酸-NaOH，pH 7.5；B液：甘氨酸-NaOH，2M硫酸銨，pH 7.5；5mL疏水柱[HiTrap Phenvl(high sub)FF]，3mL/min，30％B液洗脫得到目的蛋白；30kDa millipore超濾離心管濃縮得到SDS-PAGE電泳純。
堿性果膠酶熱穩(wěn)定性檢測：在不同溫度下按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定酶活力，以處理前酶活定為100％.，將酶液分別在30℃保溫24h，40℃保溫2h，50℃保溫2h，55℃下保溫1h，利用冰浴迅速冷卻后，按上述方法測殘余酶活力，考察其熱穩(wěn)定性。
堿性果膠酶Km、Vmax檢測：在0.05-2g/L不等的底物濃度下測定，由GraphPad Prism 5預(yù)測得到。
實施例1突變表達質(zhì)粒的構(gòu)建及重組枯草芽孢桿菌的獲得
1、以pET-20b(+)-pgl質(zhì)粒為模板構(gòu)建突變表達載體
編碼野生型堿性果膠酶及由21個氨基酸組成的信號肽的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，野生型成熟堿性果膠酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。結(jié)合堿性果膠酶的三維結(jié)構(gòu)，確定將第229位的絲氨酸S點突變?yōu)橘嚢彼酜、第230位的天冬酰胺N突變?yōu)楦彼酨、第231位的甘氨酸G突變?yōu)橘嚢彼酜。
以pET-20b(+)-pgl質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物將第229位的絲氨酸S點突變?yōu)橘嚢彼酜、第230位的天冬酰胺N突變?yōu)楦彼酨、第231位的甘氨酸G突變?yōu)橘嚢彼酜。用于定點突變的引物：
PCR反應(yīng)體系如下：(引物濃度為20μmol/L)
加水補至50μl。
PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10min，98℃變性10s，55℃退火15s，72℃延伸5min，30個循環(huán)后72℃延伸10min，4℃保存。將通過PCR得到的突變表達載體pET-20b(+)-pgl S229K/N230P/G231K利用DpnI核酸內(nèi)切酶進行酶切消化DNA模板。
質(zhì)粒pET-20b(+)-pgl的構(gòu)建方法參見文獻：Overproduction of alkaline polygalacturonate lyase in recombinant Escherichia coli by a two-stage glycerol feeding approach.2011,Shuying Fang et al.Volume 102,Issue 22,p10671–10678.
2、突變表達載體的轉(zhuǎn)化
(1)感受態(tài)細(xì)胞的制備
將E.coli BL21(DE3)在劃線平板培養(yǎng)基上挑取單菌落，接種到LB培養(yǎng)基中。37℃振蕩(200rpm)培養(yǎng)。測定OD600值，當(dāng)OD600值達到0.35～0.5時(約培養(yǎng)5小時)放置冰中停止培養(yǎng)(如果OD600值超出此范圍將不能保證感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率)。取上述菌體培養(yǎng)液1ml于1.5ml Microtube中(根據(jù)需要量確定Microtube數(shù)量)。1,500×g(一般的微型離心機約4000rpm)4℃離心5分鐘，棄上清(注意盡量除盡上清)。在每個Microtube中加入100l冰中預(yù)冷的Solution A，輕輕彈動Microtube使沉淀懸浮，禁止劇烈振蕩1,500×g(一般的微型離心機約4000rpm)4℃離心5分鐘，棄上清(注意盡量除盡上清)。在每個Microtube中加入100μL冰中預(yù)冷的Solution B，輕輕彈動Microtube使沉淀懸浮，禁止劇烈振蕩。
(2)突變表達載體的驗證擴增
感受態(tài)細(xì)胞制作完成。本感受態(tài)細(xì)胞可以直接用于DNA的轉(zhuǎn)化實驗，也可以于-80℃中保存，以備以后使用。在-80℃保存時，可以有效保存一年以上，但不能反復(fù)凍融，一旦融解后，不能再進行-80℃保存。感受態(tài)細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)化將-80℃保存的感受態(tài)細(xì)胞置于冰中融化10分鐘。取100μL的感受態(tài)細(xì)胞移至新的轉(zhuǎn)化管中。向感受態(tài)細(xì)胞中加入0.1ng～10ng(3μL～10μL)的轉(zhuǎn)化用DNA，輕輕混勻后冰中放置30分鐘。42℃水浴中放置90秒鐘后，立即于冰中放置1～2分鐘。加入890μL 37℃預(yù)溫的LB培養(yǎng)基。37℃振蕩培養(yǎng)1小時。取適量涂平板后，將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一夜。確認(rèn)培養(yǎng)菌落，進行下步實驗。
實施例2突變PGL的表達
種子培養(yǎng)基組成(g/L)：酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCl 10，葡萄糖20，pH 7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基組成：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油5g/L，K2HPO472mmol L-1，KH2PO417mmol L-1。
從甘油管中將含有突變表達載體pET-20b(+)-pgl S229K/N230P/G231K的重組菌E.coliBL21(DE3)接種于含有100μg mL-1氨芐青霉素的種子培養(yǎng)基中，裝液量為20mL/250mL。培養(yǎng)溫度37℃，200rpm搖床上振蕩培養(yǎng)10h。
將培養(yǎng)10h的種子液以3％(V/V)的接種量接入含有100μg mL-1氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為50mL/500mL，于37℃，200r min-1培養(yǎng)。菌體生長到一定階段(OD600＝0.6)，加入終濃度0.4mM IPTG進行誘導(dǎo)，同時將溫度調(diào)整為30℃，誘導(dǎo)發(fā)酵48h。
實施例3突變前后PGL的酶學(xué)性質(zhì)
按照實施例2所述的方法分別以含未經(jīng)突變的表達載體pET-20b(+)-pgl的E.coli BL21(DE3)及突變株E.coli BL21(DE3)(pET-20b(+)-pgl S229K/N230P/G231K)進行發(fā)酵，將發(fā)酵液中的酶純化后進行耐熱性等酶學(xué)性質(zhì)分析。所得堿性果膠酶突變體命名為S229K/N230P/G231K。
突變前堿性果膠酶(WT)在經(jīng)過30℃保溫24h，50℃保溫2h，55℃下保溫1h后酶活損失比較明顯；但是突變后的堿性果膠酶(S229K/N230P/G231K)做相同處理后，仍保持較高的殘留酶活。30℃保溫24h后，突變后的殘留酶活比突變前提高了57.4％；50℃保溫2h后，突變后的殘留酶活是突變前的5.8倍；55℃下保溫1h，突變后的殘留酶活是突變前的4.3倍?？偟膩碚f，堿性果膠酶S229K/N230P/G231K在30℃、50℃和55℃下的耐熱性明顯提高。
雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
SEQUENCE LISTING
<110> 曹書華
<120> 一種果膠酶及其應(yīng)用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1263
<212> DNA
<213> Bacillus sp. WSHB04-02
<400> 1
atgaaaaaag tgatgttagc tacggctttg tttttaggat tgactccagc tggcgcgaac 60
gcagctgatt taggccacca gacgttggga tccaatgatg gctggggcgc gtactcgacc 120
ggcacgacag gcgggtcaaa agcatcgtcc ttaaatgtgt ataccgtcag caacagaaac 180
cagcttgtct cggcattagg gaaggaaacg aacacaacgc caaaaatcat ttatatcaag 240
ggaacgattg acatgaacgt agatgacaat ctgaagccgc ttggtctaaa tgactataaa 300
gatccggagt atgatttgga caaatatttg aaagcctatg atcctagcac atggggcaaa 360
aaagagccgt cgggaacaca agaagaagcg agagcacgct ctcagaaaaa ccaaaaagca 420
cgggttatgg tggatatccc tgcaaacacg acgatcgtcg gttcagggac taacgctaaa 480
gtcgtgggag gaaacttcca aatcaagagt gataacgtca ttattcgcaa cattgaattc 540
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gcccaaaaca atgtcattga cgtaccggga ctgtcagctg ctaaaacgat cagcgtattc 1080
agcgggggaa cggctttata tgactccggc acgttgctga acggcacaca gatcaacgca 1140
tcggctgcaa acgggctgag ctcttctgtc ggctggacgc cgtctctgca tggatcgatt 1200
gatgcttctg ctaatgtgaa atcaaatgtc ataaatcaag cgggtgcggg taaattaaat 1260
taa 1263
<210> 2
<211> 399
<212> PRT
<213> Bacillus sp. WSHB04-02
<400> 2
Ala Asp Leu Gly His Gln Thr Leu Gly Ser Asn Asp Gly Trp Gly Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ser Lys Ala Ser Ser Leu Asn Val
20 25 30
Tyr Thr Val Ser Asn Arg Asn Gln Leu Val Ser Ala Leu Gly Lys Glu
35 40 45
Thr Asn Thr Thr Pro Lys Ile Ile Tyr Ile Lys Gly Thr Ile Asp Met
50 55 60
Asn Val Asp Asp Asn Leu Lys Pro Leu Gly Leu Asn Asp Tyr Lys Asp
65 70 75 80
Pro Glu Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr Leu Lys Ala Tyr Asp Pro Ser Thr
85 90 95
Trp Gly Lys Lys Glu Pro Ser Gly Thr Gln Glu Glu Ala Arg Ala Arg
100 105 110
Ser Gln Lys Asn Gln Lys Ala Arg Val Met Val Asp Ile Pro Ala Asn
115 120 125
Thr Thr Ile Val Gly Ser Gly Thr Asn Ala Lys Val Val Gly Gly Asn
130 135 140
Phe Gln Ile Lys Ser Asp Asn Val Ile Ile Arg Asn Ile Glu Phe Gln
145 150 155 160
Asp Ala Tyr Asp Tyr Phe Pro Gln Trp Asp Pro Thr Asp Gly Ser Ser
165 170 175
Gly Asn Trp Asn Ser Gln Tyr Asp Asn Ile Thr Ile Asn Gly Gly Thr
180 185 190
His Ile Trp Ile Asp His Cys Thr Phe Asn Asp Gly Ser Arg Pro Asp
195 200 205
Ser Thr Ser Pro Lys Tyr Tyr Gly Arg Lys Tyr Gln His His Asp Gly
210 215 220
Gln Thr Asp Ala Ser Asn Gly Ala Asn Tyr Ile Thr Met Ser Tyr Asn
225 230 235 240
Tyr Tyr His Asp His Asp Lys Ser Ser Ile Phe Gly Ser Ser Asp Ser
245 250 255
Lys Thr Ser Asp Asp Gly Lys Leu Lys Ile Thr Leu His His Asn Arg
260 265 270
Tyr Lys Asn Ile Val Gln Arg Ala Pro Arg Val Arg Phe Gly Gln Val
275 280 285
His Val Tyr Asn Asn Tyr Tyr Glu Gly Ser Thr Ser Ser Ser Ser Tyr
290 295 300
Pro Phe Ser Tyr Ala Trp Gly Ile Gly Lys Ser Ser Lys Ile Tyr Ala
305 310 315 320
Gln Asn Asn Val Ile Asp Val Pro Gly Leu Ser Ala Ala Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Val Phe Ser Gly Gly Thr Ala Leu Tyr Asp Ser Gly Thr Leu Leu
340 345 350
Asn Gly Thr Gln Ile Asn Ala Ser Ala Ala Asn Gly Leu Ser Ser Ser
355 360 365
Val Gly Trp Thr Pro Ser Leu His Gly Ser Ile Asp Ala Ser Ala Asn
370 375 380
Val Lys Ser Asn Val Ile Asn Gln Ala Gly Ala Gly Lys Leu Asn
385 390 395
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 3
gacggccaaa cggatgcgaa accaaaagct aactatatc 39
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 4
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