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一種提高黑曲霉產(chǎn)蛋白酶能力的方法與流程

文檔序號:12411705閱讀:1154來源:國知局

本發(fā)明屬于蛋白酶的生產(chǎn)領(lǐng)域,具體涉及一種提高黑曲霉產(chǎn)蛋白酶能力的方法。



背景技術(shù):

在工業(yè)用酶當(dāng)中,蛋白酶是應(yīng)用最廣的一種,約占整個(gè)酶制劑產(chǎn)量的60%以上,廣泛應(yīng)用于食品、飼料、紡織等領(lǐng)域。

生產(chǎn)用蛋白酶主要來源于動物的臟器和微生物生長分泌產(chǎn)生,許多微生物都具有產(chǎn)蛋白酶的能力,目前研究和應(yīng)用較多的是產(chǎn)蛋白酶真菌,以黑曲霉最為常用。

現(xiàn)有技術(shù)中生產(chǎn)的蛋白酶多采用固態(tài)發(fā)酵,然而,隨著食品、畜牧業(yè)等行業(yè)的不斷發(fā)展,蛋白酶的需求量也不斷上升,由于受酶活及酶適用條件的限制,仍無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的在于提供一種提高黑曲霉產(chǎn)蛋白酶能力的方法,采用液態(tài)發(fā)酵的方法,利用肌醇提高黑曲霉的產(chǎn)蛋白酶能力,獲得的蛋白酶酶活為10000-20000U/g,蛋白酶酶活增加了100-300%。

為了達(dá)到上述目的,本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下:

一種提高黑曲霉生產(chǎn)蛋白酶能力的方法,包括以下步驟:

1)斜面培養(yǎng)

將黑曲霉菌株接種到固體斜面培養(yǎng)基上,28~30℃下恒溫培養(yǎng)24-48h;

2)搖瓶培養(yǎng)

取步驟1)中培養(yǎng)后的黑曲霉菌株,接種到種子培養(yǎng)基中,置于溫度28~30℃,150-220r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24-48h;

3)種子罐培養(yǎng)

取步驟2)中搖瓶培養(yǎng)后的黑曲霉菌株,按照接種量3-6%的比例接入種子罐培養(yǎng)基中,于28~30℃、轉(zhuǎn)速150-250rpm條件下培養(yǎng)48-72h,獲得種子液;

4)發(fā)酵培養(yǎng)

取步驟3)中的種子液,按照接種量3-6%的比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基,進(jìn)行好氧發(fā)酵,獲得蛋白酶;其中,發(fā)酵培養(yǎng)基中含有肌醇0.1-1wt.%。

本發(fā)明獲得的蛋白酶酶活為10000-20000U/g。

進(jìn)一步,步驟1)中的斜面培養(yǎng)基的組分及配制過程為:按重量份,馬鈴薯100-200份,葡萄糖10-20份,瓊脂10-20份,MgSO4 0.2-1.0份,NaCl 0.5-1份,F(xiàn)eSO4 0.002-0.05份,K2HPO4 0.3-1.2份,將上述各組分溶于1000-1500份水中,混合均勻,自然pH值,于110-130℃滅菌20-30min。

優(yōu)選的,步驟2)中搖瓶種子培養(yǎng)基的組分及配制過程為:按重量份,蛋白胨10-15份,酵母提取物5-8份,NaCl 5-10份,將上述組分溶于1000-1500ml水中,自然pH值,于110-130℃滅菌20-30min。

優(yōu)選的,步驟3)中所述種子罐培養(yǎng)基的組分及配制過程為:按質(zhì)量百分?jǐn)?shù),麩皮2-5%,豆粕3-8%,KH2PO4 0.2-0.5%,水85-95%,自然pH值,110-130℃滅菌20-30min。

進(jìn)一步,步驟4)中發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及配制過程為:按質(zhì)量百分?jǐn)?shù),麩皮2-5%,豆粕3-5%,玉米粉2-4%,KH2PO4 0.3-0.8%,肌醇0.1-1%,水85-95%,自然pH值,110-130℃滅菌20-30min。

進(jìn)一步,步驟4)中,好氧發(fā)酵條件為:30-45℃、自然pH值,通風(fēng)量0.02-0.35vvm,轉(zhuǎn)速為150-250rpm,發(fā)酵時(shí)間為48-72h。

本發(fā)明在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了肌醇作為產(chǎn)蛋白酶的生長因子,肌醇廣泛存在于各種天然動物、植物及微生物,是一種“生物活素”,參與生物體內(nèi)的新陳代謝活動,具有與維生素B1和生物素相類似的作用,可以提高黑曲霉的生命強(qiáng)度,促進(jìn)黑曲霉的生長發(fā)育,提高蛋白酶的發(fā)酵水平,縮短發(fā)酵時(shí)間,在發(fā)酵培養(yǎng)中加入0.1-1%的肌醇后,獲得的蛋白酶酶活可以較原來提高100-300%。

與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的有益效果:

1)本發(fā)明對黑曲霉菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基添加了生長因子源,可以提高黑曲霉的生命強(qiáng)度,增加蛋白酶酶活,從根本上提高蛋白酶的發(fā)酵水平。

2)本發(fā)明對黑曲霉菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基添加了生長因子源后,所生產(chǎn)的蛋白酶酶活由原來的5000U/ml增加到10000-20000U/ml,增長率為100-300%,并且,對于蛋白酶酶活的提高,具有良好的穩(wěn)定性。

3)本發(fā)明采用液態(tài)發(fā)酵的方法,具有機(jī)械化程度高,便于自動控制,容易獲得高活力的蛋白酶產(chǎn)品,生產(chǎn)效率高。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1一種提高黑曲霉產(chǎn)蛋白酶能力的方法,包括以下步驟:

1)斜面培養(yǎng)

將自然提取的黑曲霉菌株接種于固體斜面培養(yǎng)基上,37℃下恒溫培養(yǎng)48h;

其中,固體斜面培養(yǎng)基的組成及配制為:馬鈴薯(去皮)100g,葡萄糖10g,瓊脂10g,MgSO4 0.2g,NaCl 0.5g,F(xiàn)eSO4 0.002g,K2HPO4 0.3g,將上述各組分溶于1000ml水中,自然pH值,121℃滅菌30min。

2)搖瓶培養(yǎng)

將步驟1)中培養(yǎng)的黑曲霉菌接種到裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中,置于溫度37℃,200r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)48h。

種子培養(yǎng)基的組成及配制為:蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl 8g,將上述組分溶于1000ml水中,自然pH值,121℃滅菌30min。

3)制備種子液

取步驟2)中搖瓶培養(yǎng)后的種子液按照接種量的3%接種到20L的種子罐培養(yǎng)基中,于37℃、轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)60h,獲得種子液。

其中,種子罐培養(yǎng)基的組成及配制為:麩皮3%,豆粕粉5%,KH2PO40.5%,水91.5%,自然pH值,121℃滅菌30min;

4)發(fā)酵培養(yǎng)

取步驟3)中種子罐培養(yǎng)后的種子液按接種量3%的比例接入發(fā)酵罐中,于37℃、自然pH值,通風(fēng)量0.05vvm,轉(zhuǎn)速為200rpm的條件下,好氧發(fā)酵,發(fā)酵時(shí)間60h。

其中,發(fā)酵罐培養(yǎng)基的組成及配制為:麩皮2.5%,豆粕粉3%,玉米粉3%,KH2PO40.8%,肌醇0.2%,溶于水中,自然pH值,121℃滅菌30min;

以不加肌醇的發(fā)酵培養(yǎng)基作為空白對照組,發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.2%肌醇后,對8個(gè)生產(chǎn)批次所獲得的蛋白酶酶活進(jìn)行測定,蛋白酶酶活測定方法:參考國家標(biāo)準(zhǔn)GBT28715-2012中酸性蛋白酶酶活的測定,結(jié)果參見表1:

表1

由表1可知,黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.2%肌醇后,連續(xù)8批產(chǎn)酶酶活相比未加肌醇的對照組均提高180%以上,具有很高的穩(wěn)定性。

實(shí)施例2一種提高黑曲霉產(chǎn)蛋白酶能力的方法,包括以下步驟:

1)斜面培養(yǎng)

將黑曲霉菌株接種于固體斜面培養(yǎng)基上,37℃下恒溫培養(yǎng)48h;

其中,斜面培養(yǎng)基的組成及配制為:馬鈴薯(去皮)150g,葡萄糖10g,瓊脂10g,MgSO4 0.2g,NaCl 0.5g,F(xiàn)eSO4 0.002g,K2HPO4 0.3g,將上述各組分溶于1000ml水中,自然pH值,121℃滅菌30min。

2)搖瓶培養(yǎng)

將步驟1)中斜面培養(yǎng)的菌株接種到裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中,置于溫度37℃200r/min條件下發(fā)酵48h。

其中,種子培養(yǎng)基的組成及配制為:蛋白胨12g,酵母提取物6g,NaCl 5g,將上述組分溶于1000ml水中,自然pH值,121℃滅菌30min;

3)種子罐培養(yǎng)

取步驟2)中搖瓶培養(yǎng)后的種子液按照接種量的5%接入20L的種子罐培養(yǎng)基中,于37℃、轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)60h。

其中,種子罐培養(yǎng)基的組成及配制為:麩皮4%,豆粕4%,KH2PO40.2%,其余為水,自然pH值,121℃滅菌30min;

4)發(fā)酵培養(yǎng)

取步驟3)中種子罐培養(yǎng)后的種子液按接種量的5%的比例接入發(fā)酵罐,于37℃、自然pH值,通風(fēng)量0.05vvm,轉(zhuǎn)速為200rpm的條件下,好氧發(fā)酵,發(fā)酵時(shí)間60h。

發(fā)酵罐培養(yǎng)基的組成及配制為:麩皮3%,豆粕4%,玉米粉4%,肌醇0.4%,KH2PO40.3%,其余為水,自然pH值,121℃滅菌30min;

以不加肌醇作為空白對照組,在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.4%肌醇后,對8個(gè)生產(chǎn)批次所獲得的蛋白酶酶活進(jìn)行測定,蛋白酶酶活測定方法:參考國家標(biāo)準(zhǔn)GBT28715-2012酸性蛋白酶酶活的測定,結(jié)果參見表2:

表2

由表2可知,黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.4%肌醇后,連續(xù)8批產(chǎn)酶酶活相比未加肌醇的對照組均提高190%以上,具有很高的穩(wěn)定性。

實(shí)施例3一種提高黑曲霉產(chǎn)蛋白酶能力的方法,包括以下步驟:

1)斜面培養(yǎng)

將黑曲霉菌株接種于固體斜面培養(yǎng)基上,37℃下恒溫培養(yǎng)48h;

其中,斜面培養(yǎng)基的組成及配制為:馬鈴薯(去皮)150g,葡萄糖10g,瓊脂10g,MgSO4 0.2g,NaCl 0.5g,F(xiàn)eSO4 0.002g,K2HPO4 0.3g,將上述各組分溶于1000ml水中,自然pH值,121℃滅菌30min。

2)搖瓶培養(yǎng)

將步驟1)中斜面培養(yǎng)的菌株接種到裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中,置于溫度37℃200r/min條件下發(fā)酵48h。

其中,種子培養(yǎng)基的組成及配制為:蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl 8g,將上述組分溶于1000ml水中,自然pH值,121℃滅菌30min。

3)種子罐培養(yǎng)

取步驟2)中搖瓶培養(yǎng)后的種子液按照接種量的6%接入20L的種子罐中,于37℃、轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)72h。

其中,種子罐培養(yǎng)基的組成及配制為:麩皮4%,豆粕3%,KH2PO40.2%,其余為水,自然pH值,121℃滅菌30min。

4)發(fā)酵培養(yǎng)

取步驟3)中種子罐培養(yǎng)后的種子液按接種量的6%的比例接入發(fā)酵罐,于37℃、自然pH值,通風(fēng)量0.05vvm,轉(zhuǎn)速為200rpm的條件下,好氧發(fā)酵,發(fā)酵時(shí)間72h。

發(fā)酵罐培養(yǎng)基的組成及配制為:麩皮5%,豆粕3%,玉米粉3%,肌醇0.8%,KH2PO40.3%,余量為水,自然pH值,121℃滅菌30min。

以不加肌醇作為空白對照組,在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.8%肌醇,對8個(gè)生產(chǎn)批次所獲得的蛋白酶酶活進(jìn)行測定,蛋白酶酶活測定方法:參考國家標(biāo)準(zhǔn)GBT28715-2012酸性蛋白酶酶活的測定,結(jié)果參見表3:

表3

由表3可知,黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.8%肌醇后,連續(xù)8批產(chǎn)酶其酶活相比未加肌醇組均提高200%以上,具有很高的穩(wěn)定性。

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