一種脯氨酸蛋白酶突變體及其應用的制作方法

文檔序號：12411703閱讀：515來源：國知局

本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體內(nèi)容涉及一種脯氨酸蛋白酶突變體應用。

技術背景

脯氨酸蛋白酶，也稱脯氨酰內(nèi)肽酶(簡稱PEP)或脯氨酰寡肽酶，屬于絲氨酸蛋白酶中一種新的家族，該家族能專一性地水解多肽中脯氨酸殘基的羧基端肽鍵，含有典型的絲氨酸蛋白酶家族的G-X-S-X-G/A高度保守序列，但是活性位點Ser周圍的氨基酸殘基和其他典型的絲氨酸蛋白不同，而且與已知的絲氨酸蛋白酶家族(包括胰蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶，羧肽酶Y)相比，在一級結構上同源性很低。

脯氨酸蛋白酶不僅能降解催產(chǎn)素，還可以降解許多催產(chǎn)素類似物，抗利尿激素的降解也是由于脯氨酸羧基端肽鍵的斷裂而形成的。此外，很多肽類激素的也是由于脯氨酸殘基的羧基端肽鍵以相同的方式被斷裂而滅活的。相反，人體的胃泌素，促腎上腺皮質(zhì)激素和豚鼠的膠原蛋白卻不能被這類酶所降解，脯氨酸蛋白酶也不能夠降解很多分子量比較大的蛋白質(zhì)和多肽，例如血清蛋白、IgG、彈力蛋白、明膠、酪蛋白，促腎上腺激素釋放激素，泛素和蛋白酶抑制劑等。根據(jù)對脯氨酸蛋白酶降解的多種肽類激素和人工合成多肽的分析，發(fā)現(xiàn)不同來源的脯氨酸蛋白酶可以專一性降解肽鏈內(nèi)Y-Pro-Y'中的順式結構Pro-Y'鍵，Y'可以是除脯氨酸之外的氨基酸、多肽、酰胺、芳香胺或者醇類化合物。

在食品與發(fā)酵工業(yè)，脯氨酰蛋白酶是一種有價值的酶類，如能通過水解啤酒中富含脯氨酸的蛋白多肽，阻止其與多酚類物質(zhì)形成大聚合物渾濁沉淀，從而提高啤酒的非生物穩(wěn)定性。已有報道證明脯氨酸蛋白酶在蛋白水解物中的去苦味作用。此外，鑒于脯氨酸蛋白酶的特異性，該酶還有可能作為一種分子生物學的工具酶，用于蛋白質(zhì)序列測定、特異位點的酶切、肽段的修飾和加工等。

作為一種非常重要的工業(yè)用酶，脯氨酸蛋白酶目前主要應用在食品加工業(yè)和啤酒釀酒業(yè)，尤其在啤酒生產(chǎn)和面包制造業(yè)應用很突出。脯氨酸蛋白酶可以降解啤酒中的渾濁敏感蛋白的脯氨酸而使其失活，在不影響發(fā)酵性能的前提下，顯著性的提高了啤酒的非生物穩(wěn)定性。

在工業(yè)生產(chǎn)中，追求微生物最大化表達量的酶，提高酶的特定性質(zhì)的意義重大，不僅可以顯著降低生產(chǎn)成本，并減少能源消耗和環(huán)境污染。一般情況下，除了通過傳統(tǒng)菌種誘變方法提高微生物表達量，還可以通過基因工程手段如突變、利用強啟動子、多拷貝基因、合適的信號肽等改造其性能及表達量。因此，通過篩選或改造的方法獲得性能優(yōu)良的脯氨酸蛋白酶成為本領域內(nèi)的研究熱點。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術問題，提供了一種新型的脯氨酸蛋白酶突變體及其應用。所述突變體是申請人通過定向進化技術篩選獲得的，其耐熱性顯著高于野生型，有利于脯氨酸蛋白酶的廣泛應用。

本發(fā)明一方面提供了一種脯氨酸蛋白酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1。

所述脯氨酸蛋白酶的編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:2。

本發(fā)明另一方面提供了一種脯氨酸蛋白酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID NO:1的脯氨酸蛋白酶的第101位氨基酸由Gly變?yōu)镚lu，第146位氨基酸由Val變?yōu)镮le，第441位氨基酸由Arg變?yōu)門rp。

所述脯氨酸蛋白酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO:3，其編碼基因的核酸序列為SEQ ID NO：4。

本發(fā)明另一方面提供了一種重組質(zhì)粒，其攜帶有編碼序列為SEQ ID NO：4的脯氨酸蛋白酶突變體的基因。

本發(fā)明還提供了一種重組菌株，是通過將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入黑曲霉(Aspergillus niger)中獲得的。

本發(fā)明還提供了所述脯氨酸蛋白酶突變體在啤酒或飲料生產(chǎn)中的應用。

本發(fā)明通過定向進化技術篩選獲得的脯氨酸蛋白酶突變體，其最適反應pH值為4.0，最適反應溫度為55℃，且在45-60℃范圍內(nèi)均能保持80％以上的酶活，耐熱性顯著高于野生型。所述突變體可廣泛應用于啤酒生產(chǎn)中，能顯著降低啤酒的濁度。所述突變體可在麥汁制備過程中添加，其麥汁濁度減少量比添加相同用量的野生型脯氨酸蛋白酶的實驗組1提高了29.4％-48.3％；所述突變體也可在啤酒發(fā)酵過程中添加，其啤酒的濁度減少量比添加相同用量的野生型脯氨酸蛋白酶的實驗組1提高了8.9％-15.4％。從而說明本發(fā)明提供的脯氨酸蛋白酶突變體更能耐受麥汁糖化過程中的高溫，并且對發(fā)酵過程中敏感蛋白的酶解效果明顯優(yōu)于野生型脯氨酸蛋白酶，因而更有利于減少敏感蛋白而引起的渾濁，取得了意料不到的效果。

附圖說明

圖1為質(zhì)粒pSU圖譜；

圖2為脯氨酸蛋白酶F1及其突變體F2最適反應溫度對比；

圖3為脯氨酸蛋白酶F1及其突變體F2最適反應pH對比。

具體實施方式

本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學領域使用的常規(guī)技術和方法，例如MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻提供了本領域技術人員已知的定義和方法。但是，本領域的技術人員可以在本發(fā)明所記載的技術方案的基礎上，采用本領域其它常規(guī)的方法、實驗方案和試劑，而不限于本發(fā)明具體實施例的限定。

下面結合具體實施方式對本發(fā)明進行詳細描述。

實施例1脯氨酸蛋白酶基因的獲得

提取本實驗室保存的一株黑曲霉(Aspergillus niger)Su2-1的基因組。利用下述引物F和引物R進行PCR擴增。反應條件為：94℃變性5min；然后94℃變性30s，56℃復性30s，72℃延伸120s，30個循環(huán)后，72℃保溫10min。將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，結果顯示擴增獲得的基因片段大小為2100bp。

引物F：ATGCGTTCCTTCTCCGCTGTCG

引物R：TCAAGCATAATACTCCTCCACC

將獲得的基因片段送上海生工生物工程股份有限公司完成測序。測序結果顯示該基因片段的核苷酸序列為SEQ ID NO：2，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO：1。通過NCBI BLAST比對發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白為脯氨酸蛋白酶，命名為F1。

實施例2脯氨酸蛋白酶突變體的獲得

申請人為了提高上述脯氨酸蛋白酶F1的耐熱性，通過定向進化技術對該酶進行了大量突變的篩選。

以F1基因為模板，以引物F和引物R用GeneMorph II隨機突變PCR試劑盒(Stratagene)進行PCR擴增，膠回收PCR產(chǎn)物，EcoRI、NotI進行酶切處理后與經(jīng)同樣酶切后的pET21a載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培養(yǎng)，待轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)后，用牙簽逐個挑至96孔板，每個孔中加入150ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培養(yǎng)基，37℃220rpm培養(yǎng)6h左右，離心棄上清，將菌體用pH5.5的緩沖液重懸，反復凍融破壁，獲得含有脯氨酸蛋白酶F1的大腸桿菌細胞裂解液。

分別取出30μl裂解液至兩塊新的96孔板，其中一塊于50℃處理10min后，稀釋到pH5.5的緩沖液中，另一塊不處理，稀釋到pH5.5的緩沖液中，分別測定其酶活。

結果發(fā)現(xiàn)，不同的突變子經(jīng)過高溫處理后保持的酶活性不同，有些突變對脯氨酸蛋白酶的活性沒有影響，有些突變甚至使其活性降低了，對依然保持高活性的突變子進行DNA測序。最終，申請人獲得了能顯著提高脯氨酸蛋白酶F1耐熱性的三點突變體：G101E，V146I和R441W。

將上述含G101E，V146I和R441W三點突變的脯氨酸蛋白酶突變體命名為F2，其氨基酸序列為SEQ ID NO：3，參照該序列得到一個編碼核苷酸序列為SEQ ID NO：4。

將上述脯氨酸蛋白酶突變體基因分別用引物F、R進行PCR擴增，引物兩端引入EcoR I、Not I位點。PCR反應條件為：94℃變性5min；然后94℃變性30s，56℃復性30s，72℃延伸120s，30個循環(huán)后，72℃保溫10min。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，上述脯氨酸蛋白酶突變體F2的基因大小約為2100bp。

實施例3重組表達載體的構建

將脯氨酸蛋白酶F1及其突變體F2基因分別通過XbaI連接到表達載體pSU(圖1)中，構建得到表達載體pSU-F1、pSU-F2。

原生質(zhì)體制備：接種宿主菌黑曲霉Su2-1于PDA+U平板，30℃培養(yǎng)5-7d。割取2cm×2cm大小的菌塊，接種100ml液體PDA+U培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h生長菌絲體，用于轉(zhuǎn)化。將長好的菌絲體過濾后，用20ml 1.2M硫酸鎂溶液重懸，加入0.2g溶菌酶。30℃、100rpm培養(yǎng)2-3h。將裂解好的菌絲用2層擦鏡紙過濾，3000rpm離心10min獲得原生質(zhì)體。

轉(zhuǎn)化：原生質(zhì)體用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用適量的山梨醇溶液重懸，使原生質(zhì)體濃度達到10⁸。200ul原生質(zhì)體中加入10ul準備好的質(zhì)粒，加入50ul 25％的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml 25％的PEG6000室溫放置5min，加入4ml山梨醇溶液顛倒混勻。倒入50ml轉(zhuǎn)化上層培養(yǎng)基后，傾倒入4個轉(zhuǎn)化下層平板中，待上層培養(yǎng)基凝固后，于30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5d。

轉(zhuǎn)化子篩選：培養(yǎng)5d后，挑取長出的菌落，點種到轉(zhuǎn)化下層平板進行復篩，30℃培養(yǎng)2d。將正常生長的轉(zhuǎn)化子分別接種到新鮮的PDA平板，30℃培養(yǎng)5-7d。每個轉(zhuǎn)化子割取2cm×2cm大小的菌塊，分別接種50ml液體搖瓶培養(yǎng)基中發(fā)酵，32℃培養(yǎng)5d，每天加入適量氨水，控制pH在4.5左右。培養(yǎng)5d后，離心菌體獲得上清液即為粗酶液。通過對粗酶液進行蛋白電泳檢測，篩選出有明顯蛋白條帶表達的轉(zhuǎn)化子。

申請人將篩選到的其中一個重組表達脯氨酸蛋白酶F1的陽性轉(zhuǎn)化子命名為黑曲霉Su-F1(Aspergillus niger Su-F1),一個重組表達脯氨酸蛋白酶突變體F2的陽性轉(zhuǎn)化子命名為黑曲霉Su-F2(Aspergillus niger Su-F2)。

將黑曲霉Su-F1和黑曲霉Su-F2的發(fā)酵上清液進行脯氨酸蛋白酶酶活檢測，同時以黑曲霉宿主菌發(fā)酵上清液做對照。結果表明：黑曲霉宿主菌的發(fā)酵上清液酶活僅為3.2U/ml，而黑曲霉Su-F1和黑曲霉Su-F2的發(fā)酵上清液酶活分別為30.5u/ml、35.4u/ml。從而進一步說明，本發(fā)明構建的重組菌黑曲霉Su-F1和黑曲霉Su-F2能分別重組表達脯氨酸蛋白酶F1和及其突變體F2。

酶活測定方法

(1)脯氨酸蛋白酶酶活單位的定義

在37℃、pH值為5.0的條件下，每分鐘分解Z-GLY-Pro-pNA釋放1μmolpNA的酶量，定義為一個酶活力單位U。

(2)酶活測定方法

試劑：磷酸氫二鈉(0.2mol/L)-檸檬酸(0.1mol/L)緩沖液pH5.0

Z-GLY-Pro-pNA溶液(5mmol/L)

取1ml濃度為5mmol/L的Z-GLY-Pro-pNA溶液于10ml磷酸-檸檬酸緩沖液中混勻，測樣前10min配制，可使用4h。

在試管中加入1.1ml上述底物混合液；

將試管在37℃的水浴鍋中預熱15min；

將比色皿(0.5cm)放置在比色皿架上，比色皿架的溫控調(diào)整到37℃，分光光度計調(diào)節(jié)至410nm測定吸光度；

吸取0.1ml稀釋的酶液，加入至含底物混合液的試管中，加入酶液時開始計時，渦旋混勻后倒于比色皿中；

將比色皿置于比色皿架上后，讀取30s的數(shù)據(jù)；

酶液反應時如出現(xiàn)吸光值下降后并上升的趨勢，則記錄下降至谷底的吸光值及時間，并延續(xù)記錄10min后數(shù)據(jù)；

如不出現(xiàn)吸光值下降的情況，可直接記錄反應前后410nm處的吸光值，反應時間為10min。

通過ΔA410計算脯氨酸蛋白酶酶活：

U＝(ΔA410×V×1000×1000×N)/(T×γ×ν×β)

其中：ΔA410：吸光值變化；

T：反應時間(10min)；

V：反應體系體積(1.2ml)；

1000×1000：將mol換算成μmol；

γ：摩爾消光系數(shù)(cm²/mol)8800；

β：比色杯光程(0.5cm)；

ν：樣品量(0.1ml)；

N：稀釋倍數(shù)；

實施例4酶學性質(zhì)分析

1、最適反應溫度測定

分別在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，pH5.0條件下測定實施例3獲得的重組菌株黑曲霉Su-F1和黑曲霉Su-F2發(fā)酵粗酶液的脯氨酸蛋白酶活力，以最高酶活為100％，計算相對酶活，做溫度-相對酶活曲線。結果如圖2所示，脯氨酸蛋白酶F1的最適反應溫度為45℃，而脯氨酸蛋白酶突變體F2的最適反應溫度為55℃，且在45-60℃范圍內(nèi)均能保持80％以上的酶活，耐溫性得到顯著提高。

2、最適反應pH測定

采用pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的緩沖液，將實施例3獲得的重組菌株黑曲霉Su-F1和黑曲霉Su-F2發(fā)酵粗酶液進行稀釋測定，在37℃下進行脯氨酸蛋白酶活力測定，計算酶活，以最高酶活為100％，計算相對酶活，做pH-相對酶活曲線。結果如圖3所示，脯氨酸蛋白酶F1的最適反應pH值為4.0，而脯氨酸蛋白酶突變體F2的最適反應pH值也為4.0，沒有明顯變化。

實施例5脯氨酸蛋白酶在啤酒生產(chǎn)中的應用

應用一：在麥汁制備過程中添加脯氨酸蛋白酶

1、準備10個相同的糖化杯，分別命名為1-10號；向每個糖化杯中各加入250ml、55℃的水，和70g粉碎的麥芽粉，混勻溶解；

2、1號糖化杯作為空白組，不再添加其他物質(zhì)；

2-4號糖化杯作為實驗組1，分別按10u/l、20u/l、30u/l的比例添加本發(fā)明提供的野生型脯氨酸蛋白酶；

5-7號糖化杯為實驗組2，分別按10u/l、20u/l、30u/l的比例添加本發(fā)明提供的脯氨酸蛋白酶突變體；

8-10號糖化杯為實驗組3，暫時不添加其他物質(zhì)。

3、糖化過程：將1-10號糖化杯55℃保溫30分鐘，以1℃/min的升溫速度加熱到65℃，保溫55分鐘，以1℃/min的升溫速度到72℃，保溫10分鐘，77℃保溫2分鐘后快速降至室溫。向各糖化杯中補充水分至450g，過濾得到麥汁。

4、分別測定1-7號麥汁的初始濁度，具體結果見表1。

5、向8-10號麥汁中分別按0.3g/l、0.6g/l、0.9g/l的比例添加PPVP(交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，目前啤酒廠普遍使用的用于降低啤酒濁度的化合物)，30分鐘后，過濾麥汁，測定其初始濁度，具體結果見表1。

6、麥汁渾濁測試：

(1)原理：

啤酒在低溫貯藏過程中容易產(chǎn)生渾濁，主要是因為啤酒中的敏感蛋白(富含脯氨酸的蛋白)容易與多酚類物質(zhì)結合產(chǎn)生絮凝。根據(jù)單寧儀的原理，通過添加單寧(屬于多酚類)，加速啤酒的渾濁，然后通過濁度計測定其濁度的變化趨勢，進而確定脯氨酸蛋白酶或PVPP對啤酒渾濁的減少量。

(2)具體步驟：

分別向1-10號麥汁中添加濃度為0.1g/l的單寧，使麥汁中的單寧含量達到7.5mg/l，充分混勻5分鐘后，倒入玻璃瓶中，用校正后的濁度計分別測定麥汁渾濁測試后的濁度，計算麥汁濁度減少量，具體結果見表1。

計算公式：

濁度減少量(％)＝1-(實驗組渾濁測試后濁度-實驗組初始濁度)/(空白組渾濁測試后濁度-空白組初始濁度)*100％

表1麥汁濁度表

由表1的結果可知，與空白組相比，實驗組通過在麥汁糖化過程中添加本發(fā)明提供的脯氨酸蛋白酶以及在麥汁糖化結束后添加PVPP均能顯著降低麥汁在渾濁測試后的濁度，說明脯氨酸蛋白酶和PVPP能有效減少麥汁中的敏感蛋白含量，進而減少測試過程中渾濁的產(chǎn)生。其中，添加脯氨酸蛋白酶的實驗組1和2制備得到的麥汁，其濁度減少量要高于添加對應劑量PVPP的實驗組3，從而說明本發(fā)明提供的脯氨酸蛋白酶在降低麥汁渾濁方面的效果要明顯優(yōu)于啤酒廠目前常用的PVPP，能有效減少敏感蛋白而引起的渾濁，提高穩(wěn)定性。

進一步地，添加脯氨酸蛋白酶突變體的實驗組2，其麥汁濁度減少量比添加相同用量的野生型脯氨酸蛋白酶的實驗組1提高了29.4％-48.3％，從而說明本發(fā)明提供的脯氨酸蛋白酶突變體更能耐受麥芽汁糖化過程中的高溫，對敏感蛋白的酶解效果明顯優(yōu)于野生型脯氨酸蛋白酶，因而更有利于減少敏感蛋白而引起的渾濁，取得了意料不到的效果。

應用二：在啤酒發(fā)酵過程中添加脯氨酸蛋白酶

1、將純麥芽經(jīng)過糖化、過濾、煮沸(添加啤酒花)、旋沉，制備得到麥汁。

2、首先按表2中所述的添加量分別將本發(fā)明提供的脯氨酸蛋白酶與酵母液加入到發(fā)酵罐中，同時，以不加脯氨酸蛋白酶的發(fā)酵罐作為空白對照組；再將麥汁經(jīng)換熱泵降溫充氧后灌入發(fā)酵罐；9～10℃發(fā)酵5天，后升溫至12℃，糖度降至3.8～4.20Bix，封罐發(fā)酵5天，然后降溫至0℃，發(fā)酵結束，即得啤酒溶液。將啤酒過濾后，分別測定其濁度，計算濁度減少量，具體結果見表2。

3、向空白對照組制得的啤酒中分別按0.3g/l、0.6g/l、0.9g/l的比例添加PPVP，30分鐘后，過濾啤酒，測定其濁度，計算濁度減少量，具體結果見表2。

計算公式：

濁度減少量(％)＝(空白組啤酒濁度-實驗組啤酒濁度)/空白組啤酒濁度*100％

表2啤酒濁度表

從表2的數(shù)據(jù)可以知道，與空白對照組相比，實驗組通過在發(fā)酵過程中添加本發(fā)明提供的脯氨酸蛋白酶以及在發(fā)酵結束后添加PVPP均能顯著降低啤酒的濁度，從而說明說明脯氨酸蛋白酶和PVPP能有效減少啤酒中的敏感蛋白含量，進而減少渾濁的產(chǎn)生。其中，添加脯氨酸蛋白酶的實驗組1和2制備得到的啤酒，其濁度減少量要明顯高于添加對應劑量PVPP的實驗組3，從而說明本發(fā)明提供的脯氨酸蛋白酶在降低啤酒渾濁方面的效果要明顯優(yōu)于啤酒廠目前常用的PVPP，能有效減少敏感蛋白而引起的渾濁，提高啤酒的穩(wěn)定性。

進一步地，添加脯氨酸蛋白酶突變體的實驗組2，其啤酒的濁度減少量比添加相同用量的野生型脯氨酸蛋白酶的實驗組1提高了8.9％-15.4％，從而說明本發(fā)明提供的脯氨酸蛋白酶突變體在發(fā)酵過程中對敏感蛋白的酶解效果明顯優(yōu)于野生型脯氨酸蛋白酶，因而更有利于減少敏感蛋白而引起的渾濁，取得了意料不到的效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 青島蔚藍生物集團有限公司

濰坊康地恩生物科技有限公司

<120> 一種脯氨酸蛋白酶突變體及其應用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 526

<212> PRT

<213> 1

<400> 1

Met Arg Ser Phe Ser Ala Val Ala Ala Ala Ala Leu Ala Leu Ser Trp

1 5 10 15

Ala Ser Leu Ala Gln Ala Ala Arg Pro Arg Leu Val Pro Lys Pro Val

20 25 30

Pro Arg Pro Ala Ser Ser Lys Ser Ala Ala Thr Thr Gly Glu Ala Asn

35 40 45

Phe Glu Gln Leu Leu Asp His His Asn Pro Asp Lys Gly Thr Phe Ser

50 55 60

Gln Arg Tyr Trp Trp Ser Thr Glu Tyr Trp Gly Gly Pro Gly Ser Pro

65 70 75 80

Val Val Leu Phe Thr Pro Gly Glu Val Ser Ala Asp Gly Tyr Glu Gly

85 90 95

Tyr Leu Thr Asn Gly Thr Leu Thr Gly Val Tyr Ala Gln Glu Ile Gln

100 105 110

Gly Ala Val Ile Ile Ile Glu His Arg Tyr Trp Gly Asp Ser Ser Pro

115 120 125

Tyr Glu Val Leu Asn Ala Glu Thr Leu Gln Tyr Leu Thr Leu Asp Gln

130 135 140

Ala Val Leu Asp Leu Thr Tyr Phe Ala Glu Thr Val Lys Leu Gln Phe

145 150 155 160

Asp Asn Ser Thr Arg Ser Asn Ala Gln Asn Ala Pro Trp Val Met Val

165 170 175

Gly Gly Ser Tyr Ser Gly Ala Leu Thr Ala Trp Thr Glu Ser Val Ala

180 185 190

Pro Gly Thr Phe Trp Ala Tyr His Ala Thr Ser Ala Pro Val Glu Ala

195 200 205

Ile Tyr Asp Phe Trp Gln Tyr Phe Tyr Pro Ile Gln Gln Gly Met Ala

210 215 220

Gln Asn Cys Ser Lys Asp Val Ser Leu Val Ala Glu Tyr Val Asp Lys

225 230 235 240

Val Gly Lys Asn Gly Thr Ala Lys Glu Gln Gln Ala Leu Lys Glu Leu

245 250 255

Phe Gly Leu Gly Ala Val Glu His Phe Asp Asp Phe Ala Ala Val Leu

260 265 270

Pro Asn Gly Pro Tyr Leu Trp Gln Asp Asn Asp Phe Ala Thr Gly Tyr

275 280 285

Ser Ser Phe Phe Gln Phe Cys Asp Ala Val Glu Gly Val Glu Ala Gly

290 295 300

Ala Ala Val Thr Pro Gly Pro Glu Gly Val Gly Leu Glu Lys Ala Leu

305 310 315 320

Ala Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Asn Ser Thr Ile Leu Pro Asp Tyr Cys

325 330 335

Ala Gly Tyr Gly Tyr Trp Thr Asp Glu Trp Ser Val Ala Cys Phe Asp

340 345 350

Ser Tyr Asn Ala Ser Ser Pro Ile Tyr Thr Asp Thr Ser Val Gly Asn

355 360 365

Pro Val Asp Arg Gln Trp Glu Trp Phe Leu Cys Asn Glu Pro Phe Phe

370 375 380

Tyr Trp Gln Asp Gly Ala Pro Glu Gly Thr Ser Thr Ile Val Pro Arg

385 390 395 400

Leu Val Ser Ala Ser Tyr Trp Gln Arg Gln Cys Ser Leu Tyr Phe Pro

405 410 415

Glu Thr Asn Gly Tyr Thr Tyr Gly Ser Ala Lys Gly Lys Asn Ser Ala

420 425 430

Thr Val Asn Ser Trp Thr Gly Gly Arg Asp Met Thr Arg Asn Thr Thr

435 440 445

Arg Leu Ile Trp Thr Asn Gly Gln Tyr Asp Pro Trp Arg Asp Ser Gly

450 455 460

Val Ser Ser Thr Phe Arg Pro Gly Gly Pro Leu Ala Ser Thr Ala Asn

465 470 475 480

Glu Pro Val Gln Val Ile Pro Gly Gly Phe His Cys Ser Asp Leu Tyr

485 490 495

Met Ala Asp Tyr Tyr Ala Asn Glu Gly Val Lys Lys Val Val Asp Asn

500 505 510

Glu Val Lys Gln Ile Lys Glu Trp Val Glu Glu Tyr Tyr Ala

515 520 525

<210> 2

<211> 1581

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

atgcgttcct tctccgctgt cgctgccgca gccctggcgc tctcttgggc gtctctggct 60

caggctgctc gccctcgtct tgtgcccaag cctgtccctc ggccagcttc gagtaaatcg 120

gctgcgacca caggcgaggc taactttgag cagttgctgg accatcataa tccagacaag 180

ggaacgtttt cccagcggta ctggtggagt actgaatact ggggtggtcc tgggtcaccg 240

gttgtcctct ttactcctgg agaggtctct gccgatggct atgaggggta tctcaccaat 300

gggactctca ctggtgttta tgcgcaggag atccagggtg ccgtcattat cattgagcac 360

cgctactggg gtgattcttc gccttatgag gtactcaatg ccgaaactct tcagtatctt 420

acattggacc aagccgttct ggacctgacc tacttcgccg agacggtgaa actgcaattc 480

gataacagca cccgcagcaa tgcgcagaat gctccctggg tcatggtcgg tggatcatac 540

agcggtgcct tgacggcttg gaccgagtct gtcgcgcctg gaacgttctg ggcttaccat 600

gccactagtg ctcctgtgga ggctatctat gacttttggc aatacttcta ccccatccag 660

caaggtatgg cacagaactg cagcaaggac gtgtctctgg tagccgagta tgtcgacaag 720

gttggaaaga acggaactgc caaggagcag caggcactca aggaattgtt tggcttggga 780

gctgttgagc atttcgatga ctttgccgct gtcctcccca acggaccgta cctctggcag 840

gacaacgact ttgccacagg atactcttcc ttcttccagt tctgtgacgc cgtcgagggt 900

gtcgaagccg gcgcggcagt aacccccggc cccgagggtg tcggcctcga aaaggccctg 960

gccaactacg caaactggtt caattcaacc attctccctg attactgcgc aggctacggc 1020

tactggaccg acgaatggag cgtcgcctgc ttcgacagct acaacgcctc gagccctatc 1080

tacaccgata catccgtcgg caatcccgtc gaccgccaat gggaatggtt cctttgcaac 1140

gagcctttct tctactggca agacggtgct cccgagggta cctccaccat tgtgccccgg 1200

ctcgtcagcg cctcctactg gcaacgccaa tgctcgctct acttccccga aacgaacggc 1260

tacacgtacg gtagcgcgaa gggtaagaac tctgccacgg tgaacagctg gaccggtggg 1320

cgggacatga cccgcaacac gacgcggttg atctggacga atgggcaata cgacccctgg 1380

cgcgactccg gtgtgtcgag cactttccgg cctggtggac cgctggcgag cacggcgaat 1440

gaacccgtgc aggttattcc gggcggattc cattgctccg atttgtatat ggcagattat 1500

tatgcgaacg agggggtaaa aaaggtggta gataatgagg tgaagcagat taaggagtgg 1560

gtggaggagt attatgcttg a 1581

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