專利名稱：：一種蛋白酶高產(chǎn)菌株LSF-An-63的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種菌株篩選方法，尤其是涉及一種蛋白酶高產(chǎn)菌株LSF-An-63的篩選方法。二
背景技術(shù)：
：彈性蛋白酶(Elastase)是一種以水解不溶性彈性蛋白為特征的廣譜性蛋白水解酶。自從1949年被Balo和Banga發(fā)現(xiàn)以來，各國科學(xué)家對其的研究便表現(xiàn)得十分活躍，從最初的酶源和純化研究到現(xiàn)今的分子遺傳機理的探索，研究水平越來越深入，很大程度上拓寬了其應(yīng)用領(lǐng)域。目前，彈性蛋白酶在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、輕工業(yè)、服裝加工、環(huán)保和生物技術(shù)等領(lǐng)域被廣泛運用，并具有極大的開發(fā)潛力和商業(yè)價值。彈性蛋白酶主要用作治療高血脂癥，是防治動脈粥樣硬化的有效生化藥物，具有改善血清脂質(zhì)水平，阻止主動脈冠狀動脈斑塊的形成功效；利用彈性蛋白酶降解一些難以處理的結(jié)締組織如韌帶、大動脈血管、筋腿等食物蛋白資源，因而被應(yīng)用食品加工技術(shù)進行深加工可制作高蛋白工程食品和功能膚保健食品。在對食用蛋白質(zhì)的水解能力方面，彈性蛋白酶比木瓜蛋白酶強一倍以上，用作嫩肉劑，彈性蛋白酶將比木瓜蛋白酶具有更大的優(yōu)越性和可接受性，其應(yīng)用前景十分廣闊。彈性蛋白酶也是良好的日用化工原料，主要用于保健性化妝品的生產(chǎn)之中。彈性蛋白酶添加入化妝品中，能增進4皮膚的血液循環(huán)，增強皮膚、毛發(fā)的彈性和柔韌性，可延緩皮膚老化；此外，還能促進頭發(fā)生長和防止脫發(fā)等，是一種新型的美容化妝品基料或加工原料，具有良好的美容保健作用。因此，利用微生物發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)彈性蛋白酶有著具有廣闊的應(yīng)用發(fā)展前景。在我國，彈性蛋白酶的生產(chǎn)還主要是從豬胰臟中提取，受到臟器資源不足、提取工藝復(fù)雜等因素的限制，利用微生物發(fā)酵技術(shù)進行大規(guī)模的生產(chǎn)基本上還是空白，而國外卻已經(jīng)進行微生物發(fā)酵生產(chǎn)并取得了巨大的經(jīng)濟效益。而采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶周期短、營養(yǎng)需求低、提取工藝簡單，可實現(xiàn)自動化生產(chǎn)，不受原料限制而進行大規(guī)模生產(chǎn)，對國家的可持續(xù)發(fā)展策略具有深遠的意義。另外，微生物生產(chǎn)彈性蛋白酶技術(shù)的開發(fā)還存在產(chǎn)物活性不高、性質(zhì)差異大、基因工程菌不穩(wěn)定等問題的制約，而篩選出彈性蛋白酶的高產(chǎn)菌株是解決諸多問題的關(guān)鍵所在，從自然中直接去篩選高產(chǎn)菌株，是一條最為直接和行之有效的方法。得到蛋白酶高產(chǎn)菌株，對于提高微生物資源的開發(fā)和利用，節(jié)約動、植物資源，促進酶制劑產(chǎn)業(yè)發(fā)展意義重大。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明為了解決上述
背景技術(shù)：
中的不足之處，提供一種蛋白酶高產(chǎn)菌株LSF-An-63的篩選方法，其采用酪蛋白初篩和彈性蛋白復(fù)篩，選擇性強，效率高，所得菌株具備作為工業(yè)菌株的能力。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種蛋白酶高產(chǎn)菌株LSF-An-63的篩選方法其特征在于具體篩選過程為:(1)采樣樣品采自楊凌高新區(qū)農(nóng)場的秸稈；(2)純化樣品處理后采用涂布稀釋法獲得單菌落；(3)初篩選用以酪蛋白(脫脂奶粉)為底物的培養(yǎng)基進行初篩；(4)復(fù)篩選用以彈性蛋白(牛筋)為底物的培養(yǎng)基進行復(fù)篩。上述取樣方法為雨后7-8天，采取麥稈及稻桿，裝入滅菌的紙袋。上述初篩培養(yǎng)基以脫脂奶粉為底物，具體配方(％，w/v)為脫脂奶粉2.5,酵母膏0.1，葡萄糖0.1，MgS0,7H2O0.01，KH2P040.05，K2HP040.1，瓊脂2.0，pH7.0上述復(fù)篩培養(yǎng)基以牛筋為底物，具體配方(％，w/v)為牛筋5.0，酵母膏O.1，葡萄糖O.1，MgS04.7H2O0.01，KH2P040.05，K2HP040.1，pH7.0上述牛筋的制備方法為稱取新鮮牛筋，8(TC烘干或者自然晾干，用萬能粉碎機將其粉碎至顆粒狀。上述菌株的培養(yǎng)基a:斜面培養(yǎng)基(％，w/v):蛋白胨l.O，酵母浸膏0.5,NaCl1.0，瓊脂2.0，pH7.0b:種子培養(yǎng)基(％，w/v):葡萄糖1.0蛋白胨0.5，酵母膏0.5，KH2P040.2，MgS040.01，上述培養(yǎng)基均于0.105Mpa蒸汽壓力下滅菌30min。上述菌株的篩選過程為(1)樣品處理取樣品少許剪碎，放入250mL三角瓶中鋪滿底部，加蒸餾水浸過樣品，裝量不超過三角瓶容量的1/2，加少量石灰，塞好棉塞，煮沸10min，自然冷卻后放置到恒溫培養(yǎng)箱中38。C培養(yǎng)48h。(2)純化將處理后的樣品培養(yǎng)液在平板培養(yǎng)基上涂布稀釋進行分離純化，38°C培養(yǎng)24h。挑單菌落進行染鏡檢后接種于固體斜面，置于38'C恒溫箱中培養(yǎng)18-24h后于4'C冰箱中保存。(3)初篩將純化得到的單菌落點接于初篩平板培養(yǎng)基上，于恒溫培養(yǎng)箱中38T:培養(yǎng)32h，測量并計算水解圈與菌落直徑比值(HC值)。將初篩所得的HC值大于1.5的菌株進行搖瓶復(fù)篩。(4)復(fù)篩將初篩得斜面菌種移接于種子液體培養(yǎng)基，38'C培養(yǎng)18-24h后按5%的接種量接種于80ml牛筋復(fù)篩培養(yǎng)基，在旋轉(zhuǎn)式搖床上3『C下170r/min培養(yǎng)48h后觀察比較。將對牛筋分解效果最佳的菌株接種于斜面培養(yǎng)基于冰箱中4'C保存。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點和效果如下1、對產(chǎn)蛋白酶菌株選擇性強；2、篩選過程采用混合篩選，效率高；3、方法科學(xué)、時間周期短。四圖l為菌株篩選流程框圖。五具體實施方式-彈性蛋白酶(Elastase)是一種以水解不溶性彈性硬蛋白(elastin)為特征的蛋白水解酶，它可由動物胰臟提取或由微生物發(fā)酵制得，其產(chǎn)生菌種類較多，且菌株產(chǎn)物活性產(chǎn)別很大。本發(fā)明的具體內(nèi)容有采取農(nóng)場秸稈為樣品，分離純化后，分別采用以酪蛋白和彈性蛋白為底物的選擇性培養(yǎng)基進行篩選，最后得到一株彈性蛋白酶高產(chǎn)菌株LSF-An-63。實施例l:(參見圖l)1、培養(yǎng)基制備斜面培養(yǎng)基(％，w/v):蛋白胨1.0，酵母浸膏0.5，NaCl1.0，瓊脂2.0,pH7.0初篩培養(yǎng)基(％,w/v):脫脂奶粉2.5,酵母膏0.1，葡萄糖0.1，MgS(V7H200.01,KH2P040.05,K風(fēng)O.1，瓊脂2.0，pH7.0脫脂奶粉為市售，加入瓊脂前應(yīng)先用適當(dāng)體積的蒸餾水進行溶解。復(fù)篩培養(yǎng)基a,w/v):牛筋5.0，酵母膏0.2，葡萄糖l.O，MgS04-7H200.01，KH2P040.05，K2HP040.1牛筋應(yīng)以研磨好的顆粒狀為宜，先單獨分裝于三角瓶。種子培養(yǎng)基(％，w/v):葡萄糖l.O，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，KH2P040.2，MgS040.01，以上培養(yǎng)基均于121。C下滅菌20min。2、采樣雨后7-8天，采取農(nóng)場麥稈，裝入滅菌的紙袋。3、樣品處理取樣品少許剪碎，放入250rnL三角瓶中鋪滿底部，加蒸餾水浸過樣品，裝量不超過三角瓶容量的1/2，加入2-3g石灰，塞好棉塞，煮沸10min，自然冷卻后放置到37。C培養(yǎng)48h。4、純化將處理后的樣品培養(yǎng)液在平板培養(yǎng)基上涂布稀釋進行分離純化，38°C培養(yǎng)24h。挑單菌落進行染鏡檢后接種于固體斜面，分別編號為LSF-An-1，LSF-An-2，LSF-An-3，……LSF-An-114，置于38。C恒溫箱中培養(yǎng)18-24h后于4。C冰箱中保存。5、初篩將純化得到的單菌落點接于初篩平板培養(yǎng)基上，于38。C培養(yǎng)32h，測量并計算水解圈與菌落直徑比值(HC值)。將初篩所得的HC值大于1.5的菌株進行搖瓶復(fù)篩。表l產(chǎn)彈性蛋白酶初篩結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>6、復(fù)篩:將初篩得斜面菌種移接于種子液體培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)，38'C培養(yǎng)24h后按5%的接種量接種于80ml牛筋復(fù)篩培養(yǎng)基，在旋轉(zhuǎn)式搖床上38'C下170r/min培養(yǎng)48h后觀察比較。將對牛筋分解效果最佳的菌株測酶活，取具有作為工業(yè)菌株潛力的菌株LSF-An-63接種于斜面培養(yǎng)基于冰箱中4"C保存。表2產(chǎn)彈性蛋白酶復(fù)篩結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注*牛筋部分水解，發(fā)酵液液體澄清**牛筋大部分分解，發(fā)酵液液渾濁***牛筋全部被水解，瓶底出現(xiàn)白色粘狀物，發(fā)酵液呈乳黃色****牛筋全部被水解，瓶底無任何雜質(zhì)，發(fā)酵液呈褐色透明權(quán)利要求1、一種蛋白酶高產(chǎn)菌株LSF-An-63的篩選方法，其特征在于篩選過程為(1)采樣樣品采自秸稈；(2)純化樣品處理后采用涂布稀釋法獲得單菌落；(3)初篩選用以酪蛋白為底物的培養(yǎng)基進行初篩；(4)復(fù)篩選用以彈性蛋白為底物的培養(yǎng)基進行復(fù)篩。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白酶高產(chǎn)菌株LSF-An-63的篩選方法，其特征在于取樣方法為雨后7-8天，采用麥稈及稻桿，裝入滅菌的紙袋。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種蛋白酶高產(chǎn)菌株LSF-An-63的篩選方法，其特征在于初篩培養(yǎng)基以脫脂奶粉為底物，由以下組分組成96w/v:脫脂奶粉2.5，酵母膏0.1，葡萄糖O.1，MgS04.7H2O0.01，KH2P040.05,K異0.1,瓊脂2.0,pH7.0。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種蛋白酶高產(chǎn)菌株LSF-An-63的篩選方法，其特征在于復(fù)篩培養(yǎng)基以牛筋為底物，由以下組分組成％w/v:牛筋5.0,酵母膏0.1，葡萄糖O.1，MgS0/7H2O0.01，KH2P040.05，K2HPO40.1，pH7.0。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種蛋白酶高產(chǎn)菌株LSF-An-63的篩選方法，其特征在于牛筋的制備方法為稱取新鮮牛筋，80'C烘干或者自然晾干，用萬能粉碎機將其粉碎至顆粒狀。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種蛋白酶高產(chǎn)菌株LSF-An-63的篩選方法，其特征在于菌株的培養(yǎng)基a:斜面培養(yǎng)基％,w/v:蛋白胨1.0，酵母浸膏0.5，NaCl1.0,瓊脂2.0，pH7.0;b:種子培養(yǎng)基％，w/v:葡萄糖l.O蛋白胨0.5，酵母膏0.5,KH2P040.2,MgS040.01;上述培蕎基均于0.105Mpa蒸汽壓力下滅菌30min。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種蛋白酶高產(chǎn)菌株LSF-An-63的篩選方法，其特征在于菌株的篩選過程為(1)樣品處理取樣品少許剪碎，放入250mL三角瓶中鋪滿底部，加蒸餾水浸過樣品，裝量不超過三角瓶容量的1/2，加少量石灰，塞好棉塞，煮沸10min，自然冷卻后放置到恒溫培養(yǎng)箱中38。C培養(yǎng)48h。(2)純化將處理后的樣品培養(yǎng)液在平板培養(yǎng)基上涂布稀釋進行分離純化，38'C培養(yǎng)24h，挑單菌落進行染鏡檢后接種于固體斜面，置于38。C恒溫箱中培養(yǎng)18-24h后于4"冰箱中保存；(3)初篩將純化得到的單菌落點接于初篩平板培養(yǎng)基上，于恒溫培養(yǎng)箱中38'C培養(yǎng)32h，測量并計算水解圈與菌落直徑比值，將初篩所得的比值大于1.5的菌株進行搖瓶復(fù)篩；(4)復(fù)篩將初篩得斜面菌種移接于種子液體培養(yǎng)基，3S。C培養(yǎng)18-24h后按5%的接種量接種于80ml牛筋復(fù)篩培養(yǎng)基，在旋轉(zhuǎn)式搖床上38。C下170r/min培養(yǎng)48h后觀察比較，將對牛筋分解效果最佳的菌株接種于斜面培養(yǎng)基于冰箱中4'C保存。全文摘要本發(fā)明涉及一種蛋白酶高產(chǎn)菌株LSF-An-63的篩選方法，其采用酪蛋白初篩和彈性蛋白復(fù)篩，選擇性強，效率高，所得菌株具備作為工業(yè)菌株的能力。本發(fā)明具體篩選過程為(1)采樣樣品采自農(nóng)場的秸稈；(2)純化樣品處理后采用涂布稀釋法獲得單菌落；(3)初篩選用以酪蛋白(脫脂奶粉)為底物的培養(yǎng)基進行初篩；(4)復(fù)篩選用以彈性蛋白(牛筋)為底物的培養(yǎng)基進行復(fù)篩。文檔編號C12N1/02GK101508958SQ20091002161公開日2009年8月19日申請日期2009年3月19日優(yōu)先權(quán)日2009年3月19日公開號200910021612.8發(fā)明者劉雙發(fā),安德榮申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)