本發(fā)明屬于微生物的酶失活領(lǐng)域，具體涉及一種耐冷假單胞菌胞外蛋白酶失活方法。此外，本發(fā)明還涉及一種原料乳的處理方法，以及經(jīng)該方法處理后得到的原料乳。
背景技術(shù)：
假單胞菌是原料乳中常見的占主導(dǎo)地位的耐冷菌群。耐冷假單胞菌能在原料乳冷藏過程中分泌耐熱蛋白酶，這種蛋白酶難以通過高溫加熱的方式加以滅活，其耐熱的機(jī)理是：經(jīng)過高溫處理后，未被破壞的處于非折疊狀態(tài)的蛋白酶分子(無活性)重新折疊成有活性的天然構(gòu)象。因此這類酶能夠耐受巴氏滅菌(72℃/15s)或超高溫(120～150℃/0.5～8.0s)滅菌工藝，無法通過單一的熱處理完全滅活。
耐熱蛋白酶主要通過降解酪蛋白引起原料乳物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生明顯變化，包括原料乳沉積，Zeta電勢和酪蛋白膠束水合作用降低，以及釋放出多肽，從而導(dǎo)致原料乳變質(zhì)，影響后續(xù)乳產(chǎn)品的貨架期。
當(dāng)前采用的耐冷菌蛋白酶失活方法有高溫失活法和低溫失活法，高溫失活法由于溫度高，會破壞乳品營養(yǎng)成分；而低溫失活法處理時間過長，能耗大。因此，如何不破壞乳品營養(yǎng)成分又快速地使耐冷假單胞菌的胞外蛋白酶失活，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問題。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種新的耐冷假單胞菌的胞外蛋白酶失活方法，通過該方法既能避免高溫破壞原料乳的營養(yǎng)成分，同時大大縮短了低溫處理的時間，降低了失活過程中消耗的能源。
具體的，一方面，提供了一種耐冷假單胞菌胞外蛋白酶失活方法，包括以下步驟：將含有耐冷假單胞菌胞外蛋白酶的溶液在50-70℃熱浴加熱2-4min，再經(jīng)800W微波加熱60-120s。
進(jìn)一步地，上述微波加熱時間為90s。
進(jìn)一步地，上述熱浴加熱的溫度為55℃，時間為3.5min。
進(jìn)一步地，上述熱浴為金屬浴。
第二方面，提供了一種原料乳的處理方法，包括以下步驟：將原料乳在50-70℃熱浴加熱2-4min，再經(jīng)800W微波加熱60-120s。
第三方面，提供了一種原料乳，經(jīng)上述的處理方法進(jìn)行處理后得到。
進(jìn)一步地，原料乳中耐冷假單胞菌菌體數(shù)量低于105cfu/ml。
上述耐冷假單胞菌胞外蛋白酶失活方法，首先將含有耐冷假單胞菌胞外蛋白酶的溶液在50-70℃熱浴加熱2-4min，使胞外蛋白酶在處于最佳失活溫度范圍情況下先開始自降解，而后通過微波800W加熱60-120s，促進(jìn)溶液中分子內(nèi)的振動，破壞蛋白酶空間折疊，并加速蛋白酶肽鏈和自身催化位點結(jié)合，促進(jìn)肽鏈斷裂以及降解后的肽段從反應(yīng)位點離去，進(jìn)而加速使胞外蛋白酶徹底失活。
此外，上述的胞外蛋白酶失活方法，與低溫失活方法相比，大大縮短了處理時間，降低能耗，滅活效果也優(yōu)于傳統(tǒng)方法，并且，不會破壞胞外蛋白酶所處的溶液環(huán)境中的其他營養(yǎng)物質(zhì)。
具體實施方式
為更清楚的對本發(fā)明技術(shù)方案予以闡述，下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步闡述。
與普通的胞外酶不同，耐冷假單胞菌所分泌的耐熱蛋白酶，難以通過現(xiàn)有的高溫或低溫失活方法使其完全滅活，也難以通過常規(guī)的微波加熱方法使其快速失活，常規(guī)微波方法使酶失活的效率低，時間長，并且和高溫失活一樣，也會破壞牛乳的營養(yǎng)成分。為此，發(fā)明人通過創(chuàng)造性勞動，開發(fā)出一種新的使耐冷假單胞菌胞外蛋白酶失活的方法，包括以下步驟：將含有耐冷假單胞菌胞外蛋白酶的溶液在50-70℃熱浴加熱2-4min，再經(jīng)800W微波加熱60-120s。
上述耐冷假單胞菌胞外蛋白酶失活方法，首先將含有耐冷假單胞菌胞外蛋白酶的溶液在50-70℃加熱2-4min，使胞外蛋白酶在處于最佳失活溫度范圍情況下先開始自降解，而后通過微波800W加熱60-120s，促進(jìn)溶液中分子內(nèi)的振動，破壞蛋白酶空間折疊，并加速蛋白酶肽鏈和自身催化位點結(jié)合，促進(jìn)肽鏈斷裂以及降解后的肽段從反應(yīng)位點離去，進(jìn)而加速使胞外蛋白酶徹底失活。上述的胞外蛋白酶失活方法，與低溫失活方法相比，大大縮短了處理時間，降低能耗，滅活效果也優(yōu)于傳統(tǒng)方法，并且，不會破壞胞外蛋白酶所處的溶液環(huán)境中的其他營養(yǎng)物質(zhì)。
需要注意的是，上述失活方法中，當(dāng)微波功率在800W左右時，例如750W，850W等，也具有一定的使耐冷假單胞菌胞外蛋白酶失活的效果，而優(yōu)選的在800W時，酶失活的效果相對更好。在不影響本發(fā)明的核心思想的基礎(chǔ)上，對微波功率進(jìn)行合理地調(diào)整，視為對該技術(shù)特征的的等同替換。
進(jìn)一步地，上述微波加熱時間優(yōu)選的為90s。上述熱浴加熱的溫度優(yōu)選的為55℃；熱浴加熱時間優(yōu)選的為3.5min。通過實施例的比對亦可見，在上述優(yōu)選的加熱時間和溫度下，耐冷假單胞菌胞外蛋白酶失活效果更好。
上述的熱浴是指將容器置于熱浴介質(zhì)內(nèi)，讓熱浴介質(zhì)的溫度熱量通過容器傳遞給容器內(nèi)物質(zhì)，從而達(dá)到加熱容器內(nèi)物質(zhì)的目的。常用的熱浴有水浴、油浴、沙浴、鉛浴等，在上述的耐冷假單胞菌胞外蛋白酶失活方法中，優(yōu)選采用金屬浴的方式，金屬浴加熱控制更加方便精準(zhǔn)。
在另一個具體的實施方式中，還提供了一種原料乳的處理方法，其特征在于，包括以下步驟：將原料乳在50-70℃熱浴加熱2-4min，再經(jīng)800W微波加熱60-120s。
通過采用上述原料乳的處理方法，一方面避免了高溫工藝破壞原料乳中的維生素、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，另一方面對胞外蛋白酶的滅活效果優(yōu)于其他傳統(tǒng)方法，并且相對于傳統(tǒng)方法而言縮短了處理時間，降低了能耗，非常適合應(yīng)用于原料乳的工業(yè)化生產(chǎn)。
在另一個具體的實施方式中，還提供了一種原料乳，該原料乳通過上述原料乳的處理方法得到。原料乳的處理方法具備上述的有益效果，通過該方法處理得到的原料乳也相應(yīng)地具備上述有益效果，此處不再贅述。
進(jìn)一步地，上述原料乳中耐冷假單胞菌菌體數(shù)量低于105cfu/ml。低溫加熱和微波加熱處理的過程，不但使耐冷假單胞菌產(chǎn)生的胞外蛋白酶失活，而且，也同時起到了殺滅耐冷假單胞菌的作用，從而使處理過后的原料乳中耐冷假單胞菌菌體數(shù)量低于105cfu/ml。
下述實施例中，耐冷假單胞菌株(Pseudomonas sp)，編號為948，1034，1035，1044，M73，M35，D22，D81，M73，N33，M55，J935，M97和D72，這些菌種在實施例中為產(chǎn)生胞外蛋白酶的具體菌株，只是為了驗證說明本發(fā)明技術(shù)方案的技術(shù)效果，不涉及本發(fā)明的失活方法的本身，因此這些具體菌株不會影響本發(fā)明技術(shù)方案的實施。
下列實施例中的MA溶液，其成分包括偶氮酪蛋白5.0g/l,3-嗎啉丙磺酸緩沖液MOPS(pH 6.7)50mM，氯化鈣1mM。其他未作特別說明的試劑和實驗設(shè)備，均可以通過商業(yè)途徑直接購得。
實施例1
將耐冷假單胞菌株1034，1035，1044，M73和948復(fù)壯后的菌液20μL接種至含1mL濃度為10g/L的滅菌脫脂奶粉溶液的EP管中，6℃培養(yǎng)8d。將培養(yǎng)后的菌液以12000rpm，于25℃離心15min。
對照樣品1：取100μL上清加至100μL MA溶液中，40℃反應(yīng)2h。
對照樣品2：取100μL上清于金屬浴中，55℃加熱10min后，于4℃冷卻30S后，加至100μL MA溶液中，40℃反應(yīng)2h。
測試樣品：取100μL上清于金屬浴中，55℃加熱3.5min后，迅速轉(zhuǎn)移至微波爐(美的微波爐，額定電壓220V-50Hz，2450MHz，腔體容積352×325×202mm(23L))中，于800W加熱90S后,4℃冷卻30S，加至100μL MA溶液中，40℃反應(yīng)2h。
對三組樣品分別用20μL 2M的三氯乙酸終止反應(yīng)，以10000rpm，于25℃離心15min后，取150μL上清至96孔孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加50μl濃度為1M氫氧化鈉溶液中和。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀中測450nm處的吸收值。反應(yīng)2h的吸光值減去同一空白樣品(菌液上清由去離子水替代)的吸光值得到吸光值增值(DA)。450nm處每毫升樣品每小時的吸光值增值為蛋白酶活力(ΔA h-1mL-1)。
菌株的蛋白酶活力小于0.3ΔA h-1ml-1被認(rèn)為是蛋白酶完全失活。
每次試驗進(jìn)行兩次，取平均值。殘留酶活力計算方法是，將對照樣品2和測試樣品的蛋白酶活力值分別除以對照樣品1的蛋白酶活力值，得到殘留酶活力百分比作為各自的殘留酶活力值。
測得的殘留酶活力值結(jié)果如下表1所示：
表1
從表1結(jié)果可見，測試樣品的失活方法處理時間僅5min，是對照樣品2處理時間的1/2。并且，對于1034，1035，1044，M73和948這5個菌株，采用本發(fā)明的失活方法均能使相應(yīng)的胞外酶失活，除菌株1044外，其他4個菌株產(chǎn)生的蛋白酶的殘留活力均小于采用低溫失活法，這說明本發(fā)明的失活效果遠(yuǎn)優(yōu)于低溫失活法。
實施例2
將耐冷假單胞菌株M35，D22，D81，M73，N33，M55，M97和D72復(fù)壯后的菌液20μL接種至含1mL濃度為10g/L的滅菌脫脂奶粉溶液的EP管中，6℃培養(yǎng)8d。將培養(yǎng)后的菌液以12000rpm，于25℃離心15min。
對照樣品1：取100μL上清加至100μL MA溶液中，40℃反應(yīng)2h。
對照樣品2：取100μL上清于金屬浴中，55℃加熱10min后，于4℃冷卻30S后，加至100μL MA溶液中，40℃反應(yīng)2h。
測試樣品：取100μL上清于金屬浴中，55℃加熱3.5min后，迅速轉(zhuǎn)移至微波爐(美的微波爐，額定電壓220V-50Hz，2450MHz，腔體容積352×325×202mm(23L))中，于800W加熱90S后,4℃冷卻30S，加至100μL MA溶液中，40℃反應(yīng)2h。
測定殘留酶活力值的方法同實施例1，結(jié)果如下表2所示：
表2
從表2結(jié)果可見，測試樣品的失活方法處理時間僅5min，是對照樣品2處理時間的1/2。并且，對于M35，D22，D81，M73，N33，M55，M97和D72這8個菌株，采用本發(fā)明的失活方法均能使相應(yīng)的胞外酶失活，8個菌株產(chǎn)生的蛋白酶的殘留活力均遠(yuǎn)小于采用低溫失活法，這說明本發(fā)明的失活效果遠(yuǎn)優(yōu)于低溫失活法，尤其是對于菌株D22、D72、M55、N33等，其失活效果分別約為低溫失活法的7倍、3倍、1.7倍及1.5倍。
實施例3
將耐冷假單胞菌株1034，1035，1044和M73復(fù)壯后的菌液20μL接種至含1mL濃度為10g/L的滅菌脫脂奶粉溶液的EP管中，6℃培養(yǎng)8d。將培養(yǎng)后的菌液以12000rpm，于25℃離心15min。
對照樣品1：取100μL上清加至100μL MA溶液中，40℃反應(yīng)2h。
對照樣品2：取100μL上清于金屬浴中，55℃加熱10min后，于4℃冷卻30S后，加至100μL MA溶液中，40℃反應(yīng)2h。
測試樣品：取100μL上清于金屬浴中，55℃加熱2min后，迅速轉(zhuǎn)移至微波爐(美的微波爐，額定電壓220V-50Hz，2450MHz，腔體容積352×325×202mm(23L))中，于800W加熱90S后,4℃冷卻30S，加至100μL MA溶液中，40℃反應(yīng)2h。
測定殘留酶活力值的方法同實施例1，結(jié)果如下表3所示：
表3
從表3結(jié)果可見，將測試樣品的失活方法處理時間縮短為2min，對于1034，1035，1044和M73這4個菌株，采用本發(fā)明的失活方法均能使相應(yīng)的胞外酶失活，并且除菌株1044外，其他3個菌株產(chǎn)生的蛋白酶殘留活力均小于低溫失活法。但與實施例1的最優(yōu)條件失活效果相比，所有菌株殘留活力均大于最優(yōu)失活條件處理后的酶活力，這說明此條件失活效果劣于最優(yōu)條件下的失活效果。
實施例4
將耐冷假單胞菌株N33復(fù)壯后的菌液20μL接種至含1mL濃度為10g/L的滅菌脫脂奶粉溶液的EP管中，6℃培養(yǎng)8d。將培養(yǎng)后的菌液以12000rpm，于25℃離心15min。
對照樣品1：取100μL上清加至100μL MA溶液中，40℃反應(yīng)2h。
對照樣品2：取100μL上清于金屬浴中，55℃加熱10min后，于4℃冷卻30S后，加至100μL MA溶液中，40℃反應(yīng)2h。
測試樣品：取100μL上清于金屬浴中，70℃加熱2min后，迅速轉(zhuǎn)移至微波爐(美的微波爐，額定電壓220V-50Hz，2450MHz，腔體容積352×325×202mm(23L))中，于800W加熱90S后,4℃冷卻30S，加至100μL MA溶液中，40℃反應(yīng)2h。
測定殘留酶活力值的方法同實施例1，結(jié)果如下表4所示：
表4
從表4結(jié)果可見，采用70℃加熱2min后立即微波處理，N33產(chǎn)生的胞外蛋白酶的殘留活力略低于與低溫失活法，但二者無顯著差異。而與實施例1的最優(yōu)條件失活效果相比，遠(yuǎn)高于采用最優(yōu)條件處理的殘留酶活力。這說明此條件失活效果劣于最優(yōu)條件失活效果，但與傳統(tǒng)低溫失活的效果相當(dāng)，二者無顯著差異。
實施例5
將耐冷假單胞菌株948復(fù)壯后的菌液20μL接種至含1mL濃度為10g/L的滅菌脫脂奶粉溶液的EP管中，6℃培養(yǎng)8d。將培養(yǎng)后的菌液以12000rpm，于25℃離心15min。
對照樣品1：取100μL上清加至100μL MA溶液中，40℃反應(yīng)2h。
對照樣品2：取100μL上清于金屬浴中，55℃加熱10min后，于4℃冷卻30S后，加至100μL MA溶液中，40℃反應(yīng)2h。
測試樣品：取100μL上清于金屬浴中，70℃加熱4min后，迅速轉(zhuǎn)移至微波爐(美的微波爐，額定電壓220V-50Hz，2450MHz，腔體容積352×325×202mm(23L))中，于800W加熱120S后,4℃冷卻30S，加至100μL MA溶液中，40℃反應(yīng)2h。
測定殘留酶活力值的方法同實施例1，結(jié)果如下表5所示：
表5
從表5結(jié)果可見，采用70℃加熱4min后立即微波處理120s，耐冷假單胞菌948產(chǎn)生的胞外蛋白酶的殘留活力略高于與低溫失活法，但二者無顯著差異。而與實施例1的最優(yōu)條件失活效果相比，遠(yuǎn)高于采用最優(yōu)條件處理的殘留酶活力。這說明此條件失活效果劣于最優(yōu)條件失活效果，但與傳統(tǒng)低溫失活的效果相當(dāng)，二者無顯著差異。
實施例6
將耐冷假單胞菌株948復(fù)壯后的菌液20μL接種至含1mL濃度為10g/L的滅菌脫脂奶粉溶液的EP管中，6℃培養(yǎng)8d。將培養(yǎng)后的菌液以12000rpm，于25℃離心15min。
對照樣品1：取100μL上清加至100μL MA溶液中，40℃反應(yīng)2h。
對照樣品2：取100μL上清于金屬浴中，55℃加熱10min后，于4℃冷卻30S后，加至100μL MA溶液中，40℃反應(yīng)2h。
測試樣品：取100μL上清于金屬浴中，70℃加熱4min后，迅速轉(zhuǎn)移至微波爐(美的微波爐，額定電壓220V-50Hz，2450MHz，腔體容積352×325×202mm(23L))中，于800W加熱120S后,4℃冷卻30S，加至100μL MA溶液中，40℃反應(yīng)2h。
測定殘留酶活力值的方法同實施例1，結(jié)果如下表6所示：
表6
從表6結(jié)果可見，對菌株948產(chǎn)生的胞外蛋白酶而言，其殘留活力大于實施例1的最優(yōu)失活條件處理后的酶活力，與低溫失活法處理后的酶活力相當(dāng)，這說明此條件失活效果劣于最優(yōu)條件失活效果，但與傳統(tǒng)低溫失活的效果相當(dāng)，二者無顯著差異。
實施例7
將耐冷假單胞菌株J935復(fù)壯后的菌液20μL接種至含1mL濃度為10g/L的滅菌脫脂奶粉溶液的EP管中，6℃培養(yǎng)8d。將培養(yǎng)后的菌液以12000rpm，于25℃離心15min。
對照樣品1：取100μL上清加至100μL MA溶液中，40℃反應(yīng)2h。
對照樣品2：取100μL上清于金屬浴中，55℃加熱10min后，于4℃冷卻30S后，加至100μL MA溶液中，40℃反應(yīng)2h。
測試樣品：取100μL上清于金屬浴中，50℃加熱2min后，迅速轉(zhuǎn)移至微波爐(美的微波爐，額定電壓220V-50Hz，2450MHz，腔體容積352×325×202mm(23L))中，于800W加熱90S后,4℃冷卻30S，加至100μL MA溶液中，40℃反應(yīng)2h。
測定殘留酶活力值的方法同實施例1，結(jié)果如下表7所示：
表7
從表7結(jié)果可見，對菌株J935產(chǎn)生的胞外蛋白酶而言，其殘留活力大于實施例1的最優(yōu)失活條件處理后的酶活力，但是遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)低溫失活法處理后的酶活力，這說明此條件失活效果劣于最優(yōu)條件失活效果，優(yōu)于傳統(tǒng)低溫失活的效果。
需要說明的是，上述實施例中，為了便于驗證本發(fā)明的失活方法的效果，采用脫脂乳粉溶液接種高濃度的菌液來進(jìn)行試驗，因而經(jīng)過處理后樣品中仍殘留一部分具有活力的蛋白酶。當(dāng)處理樣品為正常工業(yè)中的原料乳時，原料乳中的耐冷假單胞菌胞外蛋白酶的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于上述實施例中的濃度，因此采用本發(fā)明的失活方法可以使胞外蛋白酶幾乎全部失活，從而避免由胞外蛋白酶引起的原料乳變質(zhì)，有利于延長原料乳的貨架期。
最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以幫助理解本發(fā)明的技術(shù)方案及核心思想，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換，而這些修改或者替換也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。