本申請涉及一種果膠酶，尤指一種具耐熱性的果膠酶。

背景技術(shù)：

果膠(Pectin)是植物細胞壁中主要的組成之一，絕大部分存在于初生細胞壁(primary cell wall)以及中膠層(middle lamella)。果膠物質(zhì)是種復(fù)雜的異質(zhì)多醣，主要是以D-半乳糖醛酸(D-galacturonic acid)，經(jīng)由α-1,4-糖苷鍵結(jié)組成其骨干。而此骨干可被進一步地修飾，像是甲基酯化(methyl-esterification)或取代成乙?；?acetyl groups)。果膠大致上可被分成三大類：同質(zhì)半乳醛酸聚醣(homogalacturonan)、木糖半乳醛酸聚醣(xylogalacturonan)以及鼠李半乳醛酸聚醣(rhamnogalacturonan)。第三種果膠的結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜，其由重復(fù)的鼠李糖-半乳糖醛酸組成其主鏈，且有不同種的糖，像是半乳糖、木糖以及阿拉伯糖(arabinose)形成其支鏈。

由于這樣復(fù)雜構(gòu)成的果膠，其完整的分解需要依靠好幾種不同的果膠酶(pectinases)來共同作用。果膠酶在自然界中廣泛地存在于許多不同的細菌、酵母、真菌以及植物中，大致上可分為三大種：果膠水解酶(hydrolases)、果膠裂解酶(lyases)以及果膠酯酶(esterases)。在這些果膠酶中，果膠裂解酶(pectate lyase；endopolygalacturonate lyase；EC 4.2.2.2)是分解果膠過程中的關(guān)鍵酶種之一。它可以透過反式消除機制(transelimination mechanism)任意地催化半乳醛酸聚糖中的α-1,4-糖苷鍵結(jié)，進而生成不飽和半乳醛酸寡糖的產(chǎn)物。

長久以來，果膠酶已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在食品以及制酒工業(yè)上。近年來，更延伸應(yīng)用在許多不同的工業(yè)上，像是造紙、紡織以及飼料中。因為果膠酶在工業(yè)上具有極高的經(jīng)濟應(yīng)用價值，許多研究不論是從大自然中篩選新基因或是改造現(xiàn)有的蛋白，都企圖想要找到更適合于工業(yè)應(yīng)用的果膠酶。在許多提升工業(yè)酶的策略中，根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)分析，進而邏輯性地設(shè)計突變點是改造蛋 白的主要方法之一。而一個好的工業(yè)酶所要具備的理想條件之一就是高耐熱性，因為高耐熱性的酶通常具有較高的蛋白穩(wěn)定性以及較佳性能的酶作用力，故也較有利于工業(yè)應(yīng)用。

因此，本申請利用邏輯性的突變設(shè)計去增加果膠裂解酶的耐熱性，進而提升它在工業(yè)上的應(yīng)用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本申請的目的在于改造現(xiàn)有果膠裂解酶，利用結(jié)構(gòu)分析及點突變技術(shù)，有效提升果膠裂解酶的耐熱性，藉以增加果膠裂解酶的工業(yè)應(yīng)用價值。

為達上述目的，本申請的廣義實施方式提供一種果膠酶，其氨基酸序列為將序列編號2第181位置的絲氨酸(serine)以一氨基酸取代修飾的序列，其中用于取代的該氨基酸選自苯丙氨酸(phenylalanine)、甲硫氨酸(methionine)以及亮氨酸(leucine)。編碼該序列編號2的基因是從坎皮納斯類芽孢桿菌(Paenibacillus campinasensis BL-11)所分離出來的PcPEL基因。該果膠酶是果膠裂解酶。

在一個實施方式中，該果膠酶的氨基酸序列是序列編號4的氨基酸序列。

在個一實施方式中，該果膠酶的氨基酸序列是序列編號6的氨基酸序列。

在個一實施方式中，該果膠酶的氨基酸序列是序列編號8的氨基酸序列。

又，該果膠酶的用途為用于制造食品、制酒、造紙、紡織或制造飼料。

附圖說明

圖1顯示PcPEL的核苷酸序列以及氨基酸序列。

圖2顯示PcPEL的蛋白結(jié)構(gòu)。

圖3顯示突變引物序列。

圖4顯示S181F的核苷酸序列以及氨基酸序列。

圖5顯示S181M的核苷酸序列以及氨基酸序列。

圖6顯示S181L的核苷酸序列以及氨基酸序列。

圖7顯示PcPEL原始蛋白及S181F、S181M、S181L三種突變蛋白的耐熱性分析。

具體實施方式

體現(xiàn)本申請?zhí)卣髋c優(yōu)點的一些典型實施例將在后段的說明中詳細敘述。應(yīng)理解的是本申請能夠在不同的態(tài)樣上具有各種的變化，其均不脫離本申請的范圍，且其中的說明及圖示在本質(zhì)上用作說明之用，而非用以限制本申請。

本申請的果膠裂解酶(PcPEL)是從嗜堿性細菌坎皮納斯類芽孢桿菌(Paenibacillus campinasensis BL-11)菌株中所分離出來的基因。根據(jù)先前文獻中指出，該果膠裂解酶的最適活性是在50℃以及pH 10的條件之下。為了提升此果膠裂解酶的耐熱性，本申請欲通過結(jié)構(gòu)分析以及點突變技術(shù)(site-directed mutagenesis)對其進行改造。因此，本申請利用X-ray結(jié)晶學(xué)技術(shù)去解開PcPEL的蛋白三級結(jié)構(gòu)，進而闡明其詳細的結(jié)構(gòu)信息。為了提升PcPEL的耐熱性，本申請根據(jù)其結(jié)構(gòu)分析挑選位于活性區(qū)附近的第181個氨基酸的絲氨酸(serine)，利用點突變技術(shù)，分別單一突變成苯丙氨酸(phenylalanine)、甲硫氨酸(methionine)以及亮氨酸(leucine)，因而成功地提高其耐熱性，也進一步地增加此果膠裂解酶的工業(yè)應(yīng)用價值。以下將詳述本申請改造果膠裂解酶的方法及其所得到的改良果膠裂解酶蛋白。

首先，PcPEL基因被構(gòu)建在pPICZαA的載體上，其中如圖1所示，PcPEL基因包含858個堿基(不含終止密碼子，核苷酸序列以序列編號1標(biāo)示)以及286個氨基酸(氨基酸序列以序列編號2標(biāo)示)。線性化之后的質(zhì)粒DNA接著被轉(zhuǎn)化到畢赤酵母(Pichia pastoris)中，再利用含有0.1mg/ml zeocin抗生素的YPD平板，在30℃中培養(yǎng)2天，篩選出成功轉(zhuǎn)化的細胞。接著挑選菌落，分別接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基中增生，再進一步地將菌分離出來，轉(zhuǎn)移到含有0.5％甲醇的BMMY培養(yǎng)基內(nèi)，進而誘導(dǎo)其目標(biāo)蛋白的表達。經(jīng)由離心步驟，收集含有表達出的目標(biāo)蛋白的上清液。為了后續(xù)的蛋白純化步驟，本申請利用含有25mM Tris；pH 7.5的緩沖液進行兩次透析。再利用FPLC系統(tǒng)以及DEAE純化管柱，純化出PcPEL蛋白。最后，為了后續(xù)的結(jié)晶實驗，純化的蛋白再濃縮至10mg/ml的濃度。

為了利用X-ray結(jié)晶學(xué)技術(shù)解析蛋白結(jié)構(gòu)，必須先得到蛋白晶體。本 申請利用座滴式蒸氣擴散法以及結(jié)晶試劑盒篩選出成功結(jié)晶的條件，再進行調(diào)整之后，得到適當(dāng)?shù)慕Y(jié)晶條件是在0.1M Bis-Tris；pH 6.5、0.2M Lithium sulfate以及25％PEG3350的環(huán)境中，在室溫下培養(yǎng)2天。而相位角問題則是通過分子置換法(molecular replacement)解開，經(jīng)由計算機運算之后，得到PcPEL的蛋白結(jié)構(gòu)。

如圖2所示，PcPEL的蛋白結(jié)構(gòu)屬于典型PL10家族的(α/α)₃barrel蛋白折疊。本申請欲利用增加PcPEL蛋白的疏水性作用力(hydrophobic interaction)，來進一步提升其耐熱性。通過結(jié)構(gòu)分析，本申請?zhí)暨x位于活性區(qū)附近第181位置的絲氨酸(serine)分別突變成苯丙氨酸(phenylalanine)、甲硫氨酸(methionine)以及亮氨酸(leucine)，亦即，本申請利用點突變技術(shù)獲得PcPEL的三種突變基因，分別是S181F、S181M以及S181L。

突變方式為利用PCR分別取得三種突變基因，而當(dāng)中所用到的突變引物列在圖3。原始的模板DNA則利用限制酶DpnI移除掉。突變基因個別送入大腸桿菌內(nèi)復(fù)制放大，再通過DNA測序，確認突變的成功與否。最后，突變基因分別送入畢赤酵母中表達出突變蛋白，如同前述的蛋白表達步驟。

三種突變基因的核苷酸序列以及氨基酸序列分別如圖4、圖5及圖6所示。圖4顯示S181F的突變序列，其核苷酸序列以序列編號3標(biāo)示，氨基酸序列則以序列編號4標(biāo)示。圖5顯示S181M的突變序列，其核苷酸序列以序列編號5標(biāo)示，氨基酸序列則以序列編號6標(biāo)示。圖6顯示S181L的突變序列，其核苷酸序列以序列編號7標(biāo)示，氨基酸序列則以序列編號8標(biāo)示。

果膠裂解酶的活性測定是利用檢測聚半乳糖醛酸(polygalacturonic acid)底物在C4與C5之間的分解，進而產(chǎn)生的不飽和鍵結(jié)，被波長235nm所吸收。大致而言，反應(yīng)混合物包含了0.5ml適當(dāng)稀釋的蛋白樣本以及0.2％聚半乳糖醛酸作為底物，在含有0.6mM氯化鈣的pH 9.4glycine-NaOH緩沖液環(huán)境中于45℃下作用10分鐘。接著，加入3ml 30mM的磷酸以停止反應(yīng)。最后，檢測在OD235nm波長的吸收值，進而求出果膠裂解酶的活性。

至于耐熱性分析方面，突變蛋白以及原始蛋白分別在65℃、68℃、70 ℃以及75℃下作用2分鐘。接著放在冰上5分鐘降溫，再置于室溫下5分鐘回復(fù)。最后，再檢測高溫處理過的樣本所剩余的酶活性。

圖7顯示PcPEL原始蛋白及S181F、S181M、S181L三種突變蛋白的耐熱性分析，其中未熱處理的樣本的果膠裂解酶活性設(shè)定為100％。由圖7可知，S181F、S181M及S181L三種突變蛋白的耐熱性均高于原始蛋白(wild type)。相較于未熱處理的蛋白，原始蛋白在68℃高溫處理之下所剩余的活性還有約50％，而三種突變蛋白在相同68℃高溫處理之下則保留了80％的活性。此外，在70℃高溫處理之下，原始蛋白幾乎失去全部的活性，然而三種突變蛋白還保留了約40％的活性。以上結(jié)果顯示出，這三種突變蛋白S181F、S181M及S181L相較于原始蛋白，具有較高的耐熱性，也表示具有較大潛力的工業(yè)應(yīng)用價值。

綜上所述，為了增加果膠裂解酶的工業(yè)應(yīng)用價值，本申請利用邏輯性的突變設(shè)計去增加果膠裂解酶的耐熱性，根據(jù)PcPEL的結(jié)構(gòu)分析并利用點突變技術(shù)，將位于活性區(qū)附近的第181個位置的絲氨酸(serine)分別單一突變成苯丙氨酸(phenylalanine)、甲硫氨酸(methionine)以及亮氨酸(leucine)，而得到S181F、S181M及S181L三種突變蛋白。由耐熱性分析結(jié)果可知，S181F、S181M及S181L三種突變蛋白的耐熱性均高于原始蛋白，故本申請成功地設(shè)計出較具耐熱性的PcPEL突變蛋白，不但提高果膠裂解酶的耐熱性，也進一步地增加此果膠裂解酶的工業(yè)應(yīng)用價值。

盡管本發(fā)明已利用上述實施例進行了詳細敘述而可由本領(lǐng)域技術(shù)人員任施匠思而進行各種修飾，但其均不超出如所附的申請專利范圍所要保護的內(nèi)容。