專利名稱：一種果膠酶的固定化載體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種果膠酶的固定化載體及其制備方法與應(yīng)用，屬酶工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
磁性高分子微球是一類性能優(yōu)良的功能高分子材料，是以合成高分子或生物高分子為載體，通過吸附和包埋Fe2O3、！^e3O4或其它磁性粒子，形成具有磁性的功能高分子材料。 磁性高分子微球是核殼式結(jié)構(gòu)的微小膠囊，制備磁性微球的磁核主要是!^e3O4等金屬氧化物，殼層主要由兩類物質(zhì)組成一類是合成高分子，主要有聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酞胺、 聚乙烯醇、硝化纖維及聚乙烯醉縮丁醛等，不可生物降解；另一類是生物高分子，主要有淀粉、明膠、白蛋白、聚乳酸、藻酸鈣等，可生物降解。磁性高分子微球的殼層與磁核的結(jié)合主要是通過范德華力、氫鍵、配位鍵的作用，高分子借助于這些作用力，牢牢地束縛于金屬氧化物晶體表面，形成堅(jiān)實(shí)的球狀結(jié)構(gòu)，作為固定化酶載體的順磁性高分子微球。果膠酶(Pectinase，ΡΕ)被廣泛用于食品、釀酒、環(huán)保、醫(yī)藥及紡織工業(yè)領(lǐng)域，已成為世界四大酶制劑之一。但游離果膠酶在使用過程中易隨環(huán)境的變化變性失活，且不易從反應(yīng)體系中分離重復(fù)使用。因此，酶工程領(lǐng)域中果膠酶的固定化載體和制備方法向來是重要研究課題。其中固定化載體主要有一、化學(xué)方法的水解法(即共沉淀法)，將一定比例的 FeCl3和FeCl2和到合成高分子溶液中，加上堿性溶液，使生成!^e3O4磁性粒子，該方法制得的磁性高分子微球粒子的粒徑分布較寬，不均勻；二、物理方法中包括高能球磨方法、懸浮聚合法與反相懸浮再生法的三種，其獲得磁性高分子材料中的磁性粒子互相作用，極易團(tuán)聚，難以實(shí)現(xiàn)超順磁性能。關(guān)于果膠酶磁性固定化載體的研究有CN102010858A(—種果膠酶固定化的載體及固定化方法)，主要是以海藻酸鈉磁性微球?yàn)檩d體，該載體有狗304磁粉、海藻酸鈉、戊二醛三部分組成，專門加入!^e3O4磁粉，屬物理方法合成，因此極易團(tuán)聚，粒徑較大，難以實(shí)現(xiàn)超順磁性能，外部形貌成片狀，不利于果膠酶的結(jié)合，官能團(tuán)特征不明顯，不利于定向選擇交聯(lián)劑。所以尋求更加實(shí)用和有效的果膠酶固定化載體，進(jìn)一步優(yōu)化酶固定化工藝是非常必要的。由于鵝源草酸青霉果膠酶是從鵝腸道提取的一種草酸青霉發(fā)酵產(chǎn)生的果膠酶，是屬于動(dòng)物源果膠酶，與由黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的市售果膠酶來源不同，已有技術(shù)至今未有更適合的載體，因此探求也能為鵝源草酸青霉果膠酶的科學(xué)利用，提供更優(yōu)的載體是非常必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種果膠酶的固定化載體及其制備方法，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的另一目的是將該載體不但應(yīng)用于果膠酶的固定化，特別是將其應(yīng)用于鵝源草酸青霉果膠酶的固定化，為動(dòng)物源果膠酶的科學(xué)高效利用提供新方法，以用來彌補(bǔ)傳統(tǒng)技術(shù)的不足。本發(fā)明是對(duì)共沉淀法的改進(jìn)，即利用混合共沉淀法制備納米級(jí)磁性淀粉微球載體，在溶解有 ^2+、 ^3+的混合溶液中加入沉淀劑堿溶液，并與淀粉乳混合反應(yīng)，生成組分均勻的沉淀，沉淀熱分解得到納米級(jí)磁性淀粉微球。以達(dá)到其一通過溶液中的各種化學(xué)反應(yīng)直接得到組分均一的納米粉體，其二是容易制備粒度小而且分布均勻的納米粉體，增大比表面積，利于載體官能團(tuán)與果膠酶非活性基團(tuán)的緊密結(jié)合，也利于和果膠酶的緊密結(jié)合。本發(fā)明中又進(jìn)一步利用超聲波作用，不但彌補(bǔ)共沉淀法中粒徑不均勻的不足，而且可以通過改變超聲波處理時(shí)間、頻率、功率條件來有效控制粒徑的大小，從而得到需要的目標(biāo)粒徑的納米級(jí)磁性淀粉微球，以進(jìn)一步提高微粒作為載體的靶向性，以實(shí)現(xiàn)有目的的選擇不同粒徑的載體進(jìn)行不同種酶的固定。本發(fā)明的載體還能對(duì)鵝源草酸青霉果膠酶進(jìn)行固定化，鵝源草酸青霉果膠酶是青島農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)質(zhì)水禽研究所從鵝盲腸篩選到的1株真菌F67 (2006年)，經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所鑒定為草酸青霉，以該菌為發(fā)酵菌種制備的果膠酶，由于制酶菌種不同，最適溫度、最適PH等理化條件不同。研究鵝源草酸青霉果膠酶的固定化，研究其固定化后的重復(fù)使用率及最適作用條件，對(duì)于經(jīng)濟(jì)高效、科學(xué)合理的利用鵝源草酸青霉果膠酶有重大意義。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種果膠酶固定化載體，其特征在于該載體是具有對(duì)果膠酶實(shí)現(xiàn)均勻酶解、異相回收、重復(fù)利用能力的載體，其特征在于該載體是含鐵量50% 70%的、粒徑可受超聲波控制的、且粒徑范圍為IOnm SOnm的納米級(jí)磁性淀粉微球；該載體的粒徑是通過超聲波的頻率、功率和時(shí)間控制，且與時(shí)間呈線性正相關(guān)。上述果膠酶固定化載體(即納米級(jí)磁性淀粉微球載體)的制備方法，其制備步驟如下(1)首先用去離子水和淀粉攪拌分散成濃度為30% 50%的淀粉乳；(2)按1 1 1 2的比例稱取可溶性鹽為狗(13、！^eCl2，用去離子水溶解定容至淀粉乳的10 15倍，倒入淀粉乳，置65°C水浴中升溫，滴加0. 5M堿溶液調(diào)至pH值為9 13 ；(3)將上述調(diào)好pH的混合液體用超聲波處理20min 50min ；將混勻后的液體置于65°C水浴中攪拌使各組分充分結(jié)合，靜置冷卻至室溫，用酸溶液中和至中性；(4)將上述中和后的固液混合物用95%乙醇洗滌3次，然后利用剩余磁化強(qiáng)度為 12. 3T的磁鐵使磁性淀粉微球與液體分離，傾去上清液，在_20°C -45°C、201^ 1001 下真空冷凍干燥即得到該載體——納米級(jí)磁性淀粉微球。本發(fā)明的固定化載體應(yīng)用于果膠酶的固定化，特別是應(yīng)用于動(dòng)物源果膠酶的固定化——鵝源草酸青霉果膠酶固定化。其適用范圍廣泛。所述步驟⑴中的淀粉為谷類淀粉、薯類淀粉或者其他類淀粉。其淀粉乳PH值為自然pH。所述步驟(2)中的可溶性鹽為Fii2 (SO4) 3、FeSO4 或者 FeP04、Fe3 (PO4) 2。所述步驟O)中的堿溶液為NaOH、KOH及其他堿溶液，也可為堿性鹽溶液。所述步驟(3)中的超聲處理?xiàng)l件為IOW 950W、20KHz 25KHz、20min 50min， 超聲處理時(shí)間越長，功率越大，納米級(jí)磁性淀粉微球載體的粒徑越小。
所述步驟(3)中的酸溶液為醋酸、稀硫酸或者稀鹽酸。所述步驟(4)中的真空冷凍干燥條件為-20°C -45°C、20Pa lOOPa。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有如下的優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明的載體，采用可生物降解、對(duì)環(huán)境友好、含有大量羥基的天然再生資源淀粉作為殼層，具有良好的生物兼容性，可以很好地保持酶的活性和穩(wěn)定性，提高了酶的使用效率。(2)本發(fā)明的載體，直接利用FeCl3與!^eCl2在堿性作用下反應(yīng)生成!^e3O4磁分子， 與淀粉在反應(yīng)過程中結(jié)合，且無需在厭氧環(huán)境下進(jìn)行，使磁分子與淀粉結(jié)合更緊密，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)，降低成本。(3)本發(fā)明的載體，利用真空冷凍干燥，減少鼓風(fēng)加熱干燥中載體中羥基、羧基官能團(tuán)的活性損失，制備的載體中有效官能團(tuán)回收率更高。(4)本發(fā)明的載體可以使果膠酶重復(fù)使用，能夠降低原材料和能源消耗，減少工業(yè)廢渣廢液排放，防止環(huán)境污染，可廣泛用于果汁、蔬菜汁加工等領(lǐng)域，是一項(xiàng)具有廣譜重大開發(fā)價(jià)值的酶固定化載體。


圖1本發(fā)明超聲處理50min的納米級(jí)磁性淀粉微球載體的粒徑圖。(經(jīng)超聲處理 50min的微球粒徑30 60nm比例較大，分布范圍窄)圖2本發(fā)明的掃描電鏡下未經(jīng)超聲處理的納米級(jí)磁性淀粉微球載體形態(tài)圖。(粒徑不均勻，呈片狀，結(jié)團(tuán)，分散程度差。)圖3本發(fā)明的掃描電鏡下超聲處理的納米級(jí)磁性淀粉微球載體形態(tài)圖。(粒徑均勻，球形，團(tuán)聚少，結(jié)晶良好，分散程度好。)圖4本發(fā)明淀粉FT-IR圖譜。(淀粉Ie^cnT1羥基、3421cm—1羧基特征吸收峰)圖5本發(fā)明納米級(jí)磁性淀粉微球載體FT-IR圖譜。(磁性淀粉微球含有1628CHT1 羥基、3421CHT1羧基、580011-1! 特征吸收峰)
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1用去離子水和可溶性淀粉攪拌分散成濃度為30%的淀粉乳。按1 1. 5的比例稱取狗(13、！^eCl2，用去離子水溶解定容至淀粉乳的10倍，倒入淀粉乳，置65°C水浴中升溫。達(dá)到溫度后滴加0. 5M NaOH溶液調(diào)pH值為10，25KHz、900W功率下超聲處理30min。將處理后的液體置于65°C水浴中攪拌1.5h，反應(yīng)結(jié)束后靜置冷卻至室溫，用冰醋酸中和至中性，用 95%乙醇洗滌3次，利用剩余磁化強(qiáng)度為12. 3T的磁鐵使磁性淀粉微球與液體分離，傾去上清液，在_45°C、2(^a下真空干燥，得到納米級(jí)果膠酶磁性淀粉微球載體。該載體經(jīng)激光衍射粒度儀檢測(cè)，粒徑為10. 29nm 80. 45nm,具有順磁性，未經(jīng)超聲處理的粒徑較大，且60 140nm比例較大，又經(jīng)傅里葉紅外光譜儀檢測(cè)，如圖5所示，該載體有較明顯的580Cm_Ve304、 1628cm-1羥基、3421cm—1羧基特征吸收峰，是果膠酶固定化的良好載體，如圖3所示掃描電鏡照片，該載體粒徑均勻、團(tuán)聚少、結(jié)晶良好，是果膠酶的固定化的良好載體。實(shí)施例2
用去離子水和玉米淀粉攪拌分散成濃度為40%的淀粉乳。按1 2的比例稱取 Fe2(SO4)3^ FeSO4，用去離子水溶解定容至淀粉乳的15倍，倒入淀粉乳，置65°C水浴中升溫。 達(dá)到溫度后滴加0. 5M KOH溶液調(diào)pH值為ll，20KHz、450W功率下超聲處理20min。將處理后的液體置于65°C水浴中攪拌2h，反應(yīng)結(jié)束后靜置冷卻至室溫，用稀鹽酸溶液中和至中性，用95%乙醇洗滌3次，利用剩余磁化強(qiáng)度為12. 3T的磁鐵使磁性淀粉微球與液體分離， 傾去上清液，在-45°C、2(^a下真空干燥，得到納米級(jí)果膠酶磁性淀粉微球載體。經(jīng)激光衍射粒度儀檢測(cè)，該載體粒徑為14. 35nm 80. 31nm,具有順磁性，未經(jīng)超聲處理的粒徑60 140nm比例較大，經(jīng)傅里葉紅外光譜儀檢測(cè)，如圖5所示，該微球有較明顯的580(31^^ . 1628cm-1羥基、3421cm—1羧基特征吸收峰，如圖3所示掃描電鏡照片，該載體粒徑均勻、團(tuán)聚少、結(jié)晶良好，是果膠酶的固定化的良好載體。實(shí)施例3用去離子水和玉米淀粉攪拌分散成濃度為50%的淀粉乳。按1 1的比例稱取 FePO4,狗3(PO4)2，用去離子水溶解定容至淀粉乳的13倍，倒入淀粉乳，置65°C水浴中升溫。 達(dá)到溫度后滴加0. 5M醋酸鈉溶液調(diào)pH值為9，20KHz、650W功率下超聲處理25min。將處理后的液體置于65°C水浴中攪拌2. 5h，反應(yīng)結(jié)束后靜置冷卻至室溫，用稀硫酸溶液中和至中性，用95%乙醇洗滌3次，利用剩余磁化強(qiáng)度為12. 3T的磁鐵使磁性淀粉微球與液體分離， 傾去上清液，在-45°C、2(^a下真空干燥，得到納米級(jí)果膠酶磁性淀粉微球載體。經(jīng)激光衍射粒度儀檢測(cè)，該載體粒徑為15. 25nm 75. 45nm,具有順磁性，未經(jīng)超聲處理的粒徑60 140nm比例較大，經(jīng)傅里葉紅外光譜儀檢測(cè)，如圖5所示，該微球有較明顯的580(31^^ . 1628cm-1羥基、3421cm—1羧基特征吸收峰，如圖3所示掃描電鏡照片，該載體粒徑均勻、團(tuán)聚少、結(jié)晶良好，是果膠酶的固定化的良好載體。實(shí)施例4 利用本發(fā)明的載體固定化市售果膠酶稱取5%戊二醛交聯(lián)的活化納米級(jí)果膠酶磁性淀粉微球載體1份、的市售黑曲霉果膠酶溶液3份，用pH為4的緩沖液定容至25倍體積，于30°C、轉(zhuǎn)速200r/min下在搖床中振蕩反應(yīng)池，用剩余磁化強(qiáng)度為12. 3T的磁鐵使磁性淀粉微球與液體分離，傾去上清液，用緩沖液反復(fù)洗滌直至上清液中檢測(cè)不到蛋白質(zhì)為止，在-20°C -45°C、20I^ IOOPa 下真空冷凍干燥，即得磁性固定化果膠酶。利用激光衍射粒度儀、掃描電鏡、傅里葉紅外光譜儀、X衍射儀測(cè)得結(jié)果可知，固定化果膠酶與磁性淀粉微球載體相比粒徑變大，官能團(tuán)有所變化，說明果膠酶已交聯(lián)到磁性淀粉載體上。用次碘酸鈉法測(cè)定酶活回收率，酶活回收率為84. 7%，適用pH為3 5，游離酶在40°C以后酶活顯著下降，而固定化酶在45°C時(shí)顯著下降，果膠酶固定化重復(fù)使用5次相對(duì)酶活仍為69. 4%，重復(fù)使用8次相對(duì)酶活為58. 9%。 表明，本發(fā)明也可以應(yīng)用于其它來源的果膠酶。實(shí)施例5利用本發(fā)明的載體固定化鵝源草酸青霉果膠酶稱取2. 5%戊二醛交聯(lián)的納米級(jí)果膠酶磁性淀粉微球載體5份、的鵝源草酸青霉果膠酶溶液5份，用pH為4的緩沖液定容至25倍體積，于30°C、轉(zhuǎn)速200r/min下在搖床中振蕩反應(yīng)6h，用剩余磁化強(qiáng)度為12. 3T的磁鐵使磁性淀粉微球與液體分離，傾去上清液， 用緩沖液反復(fù)洗滌直至上清液中檢測(cè)不到蛋白質(zhì)為止，在_20°C -45°C、20I^ 100 下真空冷凍干燥，即得磁性固定化果膠酶。利用激光衍射粒度儀、掃描電鏡、傅里葉紅外光譜儀、X衍射儀測(cè)得結(jié)果可知，固定化果膠酶與磁性淀粉微球載體相比粒徑變大，官能團(tuán)有所變化，說明果膠酶已交聯(lián)到磁性淀粉載體上。用次碘酸鈉法測(cè)定酶活回收率，酶活回收率為 86%，適用pH為3 5，游離酶在40°C以后酶活顯著下降，而固定化酶在50°C時(shí)顯著下降， 果膠酶固定化重復(fù)使用5次相對(duì)酶活仍為70. 2%，重復(fù)使用8次相對(duì)酶活為60. 4%。
權(quán)利要求
1.一種果膠酶固定化載體，是具有對(duì)果膠酶實(shí)現(xiàn)均勻酶解、異相回收、重復(fù)利用能力的載體，其特征在于該載體是含鐵量50% 70%的、粒徑可受超聲波控制的、且粒徑范圍為 10 SOnm的納米級(jí)磁性淀粉微球；該載體的粒徑是通過超聲波的頻率、功率和時(shí)間控制， 且與時(shí)間呈線性正相關(guān)。
2.權(quán)利要求1的固定化載體的制備方法，其特征在于制備步驟如下(1)首先用去離子水和淀粉攪拌分散成濃度為30% 50%的淀粉乳；(2)按1 1 1 2的比例稱取可溶性鹽*i^Cl3、FeCl2，用去離子水溶解定容至淀粉乳的10 15倍，倒入淀粉乳，置65°C水浴中升溫，滴加0. 5M堿溶液調(diào)至pH值為9 13 ；(3)將上述調(diào)好pH的混合液體用超聲波處理20min 50min；將混勻后的液體再置于 65°C水浴中攪拌，然后靜置冷卻至室溫，用酸溶液中和至中性；(4)將上述中和后的固液混合物用95%乙醇洗滌3次，然后利用剩余磁化強(qiáng)度為12.3T 的磁鐵使磁性淀粉微球與液體分離，傾去上清液，在-200C -450C、20Pa 100 下真空冷凍干燥即得到該載體——納米級(jí)磁性淀粉微球。
3.如權(quán)利要求2所述的固定化載體的制備方法，其特征在于上述步驟(3)中的超聲處理?xiàng)l件為10W 950W、20KHz 25KHz、20min 50min。
4.如權(quán)利要求2所述的固定化載體的制備方法，其特征在于上述步驟中的真空冷凍干燥條件為-20°C -45 、20Ι^ lOOPa。
5.如權(quán)利要求2所述的固定化載體的制備方法，其特征在于上述步驟O)中的可溶性鹽為 Fe2 (SO4) 3、FeSO4 或者 FePO4、Fe3 (PO4)20
6.如權(quán)利要求2所述的固定化載體的制備方法，其特征在于上述步驟O)中的堿溶液為NaOH、KOH及其他堿溶液，或者為堿性鹽溶液。
7.如權(quán)利要求2所述的固定化載體的制備方法，其特征在于上述步驟(3)中的酸溶液為醋酸、稀硫酸或者稀鹽酸。
8.權(quán)利要求1的固定化載體的用途，其特征在于該微球載體應(yīng)用于果膠酶的固定化， 特別是應(yīng)用于鵝源草酸青霉果膠酶固定化。
全文摘要
一種果膠酶的固定化載體及其制備方法與應(yīng)用。是具有對(duì)果膠酶實(shí)現(xiàn)均勻酶解、異相回收、重復(fù)利用能力的載體，是含鐵量50％～70％的、粒徑可受超聲波控制的、且粒徑范圍為10～80nm的納米級(jí)磁性淀粉微球；該載體的粒徑是通過超聲波的頻率、功率和時(shí)間控制，且與時(shí)間呈線性正相關(guān)。制備用去離子水和淀粉調(diào)制成淀粉乳，按比例加入FeCl3、FeCl2，用去離子水溶解定容，倒入淀粉乳，調(diào)pH值，超聲處理后攪拌，酸中和，95％乙醇洗滌，磁鐵分離，真空冷凍干燥得到。本發(fā)明的載體應(yīng)用于果膠酶，特別是應(yīng)用于進(jìn)行動(dòng)物源果膠酶的固定化。能夠降低原材料和能源消耗，減少工業(yè)廢渣廢液排放，防止環(huán)境污染，可廣泛用于果汁、蔬菜汁加工等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C08K3/32GK102337257SQ20111030344
公開日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月10日
發(fā)明者盧燕燕, 岳斌, 張名愛, 王寶維, 葛文華 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)