一種具核梭桿菌酪氨酸酚裂解酶突變體、基因、載體、工程菌及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號：12411721閱讀：343來源：國知局

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本發(fā)明涉及一種來源于具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)的酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine Phenol Lyase，TPL)突變體、編碼基因及其在催化合成左旋多巴(L-DOPA)中的應(yīng)用。

(二)

背景技術(shù)：

左旋多巴(β-3,4-二羥苯基-α-丙氨酸，3,4-dihydroxylphenylalanine-L-alanine，L-DOPA)是生物體內(nèi)重要的生物活性物質(zhì)。它能夠通過血腦屏障，到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在體內(nèi)脫羧酶的作用下，轉(zhuǎn)化為多巴胺，進而發(fā)揮治療帕金森綜合癥的作用。隨著現(xiàn)代社會生活壓力的增加以及人口老齡化的加劇，帕金森病患者數(shù)日益升高，左旋多巴作為帕金森綜合癥治療的首選藥物，其需求量不斷增加。

傳統(tǒng)制備左旋多巴的主要方法包括從植物如藜豆、貓豆中提取以及化學(xué)法不對稱合成等。其中，從植物中提取左旋多巴受到原料來源的限制，并且提取步驟繁雜、產(chǎn)量低，遠不能滿足市場需求；而化學(xué)不對稱合成法由于反應(yīng)條件苛刻、轉(zhuǎn)化率及立體選擇性低、環(huán)境不友好等問題，在工業(yè)生產(chǎn)中受到限制。生物催化因其反應(yīng)條件溫和、過程高效、高度立體、區(qū)域和化學(xué)選擇性等優(yōu)點，已成為左旋多巴工業(yè)化生產(chǎn)的重要方法。

酶法合成左旋多巴的生物催化劑主要包括酪氨酸酶、氨基?；浮-羥基苯乙酸3-羥化酶、酪氨酸酚裂解酶等。酪氨酸酶催化L-酪氨酸合成左旋多巴的酶活較低，且由于酪氨酸酶同時具有二酚氧化活性，會將左旋多巴進一步氧化生成副產(chǎn)物多巴醌。氨基?；竸恿W(xué)拆分N-乙酰-3-(3,4-二甲氧苯基)丙氨酸水解合成3-(3,4-二甲氧苯基)丙氨酸，其甲氧基經(jīng)HBr去保護后合成左旋多巴。該工藝路線長，且使用和產(chǎn)生有毒氣體MeBr，安全隱患大。p-羥基苯乙酸3-羥化酶催化L-酪氨酸合成左旋多巴時，需輔因子NADH參與催化反應(yīng)，生產(chǎn)成本高。與上述酶法工藝相比，酪氨酸酚裂解酶(TPL)工藝以鄰苯二酚、丙酮酸和氨為底物，通過C-C鍵形成反應(yīng)合成左旋多巴，原子經(jīng)濟性高。由于左旋多巴在水中的溶解度低，在生物催化反應(yīng)中不斷析出，有利于該可逆反應(yīng)向產(chǎn)物生成方向進行，達到較高的轉(zhuǎn)化率，因而具有重要的工業(yè)開發(fā)前景。

TPL廣泛存在于各種微生物中，目前已報道用于左旋多巴合成的TPL來源包括弗氏檸檬酸菌(Citrobacterfreundii)，草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)以及嗜熱菌(Symbiobacterium sp.)等。

由于TPL催化合成左旋多巴的底物之一鄰苯二酚并非該酶的天然底物，其催化效率有待提高。另一方面，鄰苯二酚是強蛋白質(zhì)變性劑，在高強度工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境下，高濃度鄰苯二酚會對TPL產(chǎn)生抑制作用，甚至使其不可逆失活。因此，開發(fā)新的高活力及高鄰苯二酚耐受能力的TPL對實現(xiàn)左旋多巴的工業(yè)化生產(chǎn)具有十分重要的意義。

(三)

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是通過定向進化手段對具核梭桿菌來源的酪氨酸酚裂解酶進行改造，提供一種突變體蛋白，提高蛋白活力，以鄰苯二酚、丙酮酸和氨為底物，高效催化合成左旋多巴。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種具核梭桿菌酪氨酸酚裂解酶突變體(即TPL突變體)，所述突變體是將SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第84位和129位進行易錯PCR雙突變獲得的。具體所述雙突變是將第84位的谷氨酸(E)突變?yōu)橘嚢彼?K)，同時將第129位的蘇氨酸突變(T)為異亮氨酸(I)，所述突變體氨基酸序列為SEQ ID NO.4所示。任何對SEQ ID NO.4所示氨基酸序列中氨基酸經(jīng)過缺失、插入或替換一個或幾個氨基酸且具有TPL活性的，仍屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明從具核梭桿菌(F.nucleatum，CGMCC 1.2526，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)提取其基因組為模板，成功克隆了編碼TPL的基因(Fn-TPL)，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌(Escherichia coli)后進行了該基因的表達。進一步從大腸桿菌中提取含F(xiàn)n-TPL質(zhì)粒，使用多輪易錯PCR方法對TPL基因進行隨機突變，連接于表達載體后，同樣表達于大腸桿菌，通過篩選獲得活力提高的突變體，能夠用于左旋多巴的工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明對SEQ ID NO.1編碼的TPL進行突變，可采用常規(guī)的分子改造手段。優(yōu)先地，通過易錯PCR擴增，改變PCR體系內(nèi)Mg²⁺濃度，以及添加Mn²⁺，以獲得突變DNA序列SEQ ID NO.3，其氨基酸序列為SEQ ID NO.4。

本發(fā)明還提供一種所述具核梭桿菌TPL突變體的編碼基因，所述編碼基因核苷酸序列為SEQ ID NO.3所示。

本發(fā)明還涉及一種所述編碼基因構(gòu)建的重組載體以及由所述重組載體轉(zhuǎn)化制備的重組基因工程菌。

本發(fā)明可通過本領(lǐng)域常規(guī)方法將本發(fā)明的TPL突變體的核苷酸序列連接于各種載體上構(gòu)建而成。本發(fā)明的重組載體沒有限制，只要其可以在原核和/或真核細胞的各種宿主細胞中保持其復(fù)制或自主復(fù)制，所述載體可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種載體，如各種質(zhì)粒、噬菌體或病毒載體等，優(yōu)選pET-28a。較佳地，可通過下述方法獲得本發(fā)明的重組表達載體：將獲得的野生型TPL及突變體基因產(chǎn)物與載體pET-28a連接，構(gòu)建本發(fā)明的TPL突變基因重組表達質(zhì)粒pET28a-FnTPL和pET28a-FnTPLM。

引入編碼本發(fā)明的TPL突變體的DNA的宿主細胞沒有限制，只要已經(jīng)為其建立了重組表達系統(tǒng)，滿足重組表達載體可以穩(wěn)定自我復(fù)制且所攜帶的本發(fā)明的TPL突變基因可以有效表達。例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌、放線菌、曲霉菌，以及動物細胞和高等植物細胞。本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌，更優(yōu)選大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。將重組質(zhì)粒pET28a-FnTPL和pET28a-FnTPLM轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中，獲得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-FnTPL和E.coli BL21(DE3)/pET28a-FnTPLM。

本發(fā)明重組TPL突變體的制備包括培養(yǎng)本發(fā)明的重組表達轉(zhuǎn)化體，誘導(dǎo)獲得重組TPL突變蛋白。其中，所述的培養(yǎng)重組表達轉(zhuǎn)化體所用的培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域可使轉(zhuǎn)化體生長并產(chǎn)生本發(fā)明的TPL的培養(yǎng)基，優(yōu)選LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化鈉10g/L，溶劑為水，pH 7.2。培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件沒有特殊限制，只要使轉(zhuǎn)化體能夠生長并產(chǎn)生TPL即可。優(yōu)選下述方法：將本發(fā)明涉及的重組E.coli BL21(DE3)/pET28a-FnTPLM接種至含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至光密度OD₆₀₀達到0.5～0.7時，在終濃度為0.1～1.0mM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的誘導(dǎo)下，即可高效表達本發(fā)明的TPL突變蛋白。

本發(fā)明還提供一種所述具核梭桿菌TPL突變體在合成左旋多巴中的應(yīng)用，具體所述應(yīng)用以含具核梭桿菌TPL突變體編碼基因的重組基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑，以鄰苯二酚、丙酮酸鈉和醋酸銨為底物，以亞硫酸鈉和EDTA·Na₂為助劑，以磷酸吡哆醛(Pyridoxal 5’-phosphate,PLP)為輔酶，以pH5.0～9.0(優(yōu)選pH8.0)的緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系，在溫度5～30℃(優(yōu)選15℃)條件下進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液分離純化，獲得左旋多巴。

進一步，所述轉(zhuǎn)化體系中，初始時，鄰苯二酚加入終濃度5～50g/L(優(yōu)選5g/L)，丙酮酸鈉加入終濃度5～50g/L(優(yōu)選8g/L)，醋酸銨加入終濃度5～100g/L(優(yōu)選50g/L)，亞硫酸鈉加入終濃度0.5～10g/L(優(yōu)選1g/L)，EDTA·Na₂加入終濃度0.5～10g/L(優(yōu)選2g/L)，磷酸吡哆醛加入終濃度0.05～5mM(優(yōu)選1mM)，濕菌體用量為2～50g/L(優(yōu)選20g/L)。

進一步，所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程中對鄰苯二酚、丙酮酸鈉和醋酸銨進行補料，每隔0.5～4h補料一次，其中鄰苯二酚每次補料0.1～10g/L(優(yōu)選5g/L)，丙酮酸鈉每次補料0.1～10g/L(優(yōu)選5g/L)，醋酸銨每次補料1～20g/L(優(yōu)選3.5g/L)。

本發(fā)明提供的TPL突變體可以以游離酶、固定化酶以及重組游離細胞的形式催化合成左旋多巴。

進一步，所述催化劑按如下方法制備：

(1)斜面培養(yǎng)：將含具核梭桿菌TPL突變體編碼基因的重組基因工程菌接種至含50μg/ml卡那霉素的斜面培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)8～16h，獲得斜面菌體；所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，1.5％瓊脂，溶劑為去離子水，pH 7.0。使用前加入50μg/ml卡那霉素。

(2)種子培養(yǎng)：將斜面菌體接種至種子培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)8～10h，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，50μg/ml卡那霉素，溶劑為去離子水，pH 7.0。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液以體積濃度3％的接種量接種至無菌的裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L機械攪拌通風(fēng)通用式發(fā)酵罐中，將已滅菌的終濃度為15g/L乳糖直接添加到發(fā)酵罐中于28℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)。待培養(yǎng)6～8h后放罐收集濕菌體。所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl10g/L，甘油15g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 1.36g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2.28g/L，MgSO₄·7H₂O 0.375g/L，溶劑為去離子水，pH。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：本發(fā)明所提供的具核梭桿菌TPL突變體與野生型相比較，具有更優(yōu)良的催化性能。TPL突變體合成左旋多巴累積濃度高達140g/L以上，與野生型相比提高了17％～25％，光學(xué)純度大于99.5％；底物鄰苯二酚的轉(zhuǎn)化率達到99.8％以上，與野生型相比較提高了15％-20％。

(四)附圖說明

圖1為含野生型及突變體TPL全細胞催化合成左旋多巴的反應(yīng)進程。

(五)具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此：

實施例1 TPL基因的獲得

用DNA提取試劑盒提取具核梭桿菌(F.nucleatum subsp.CGMCC 1.2526，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)的全基因組DNA，以該DNA為模板，上游引物(5’GCTGAGGATCCATGAGATTTGAAGATTATCCAGC3’)和下游引物(5’GCATCCTCGAGTTATTTTTTTATTCCAAATCTAGC3’)為作用引物進行PCR擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系各組分加入量(總體積50μL)：5×PrimeSTARTM HS DNA polymerase Buffer 10μL，10mMdNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)4μL，濃度為50μM的上游引物、下游引物各1μL，基因組DNA 1μL，PrimeSTARTM HS DNA polymerase 0.5μL，無核酸水32.5μL。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃1min，然后進入溫度循環(huán)95℃10s，56℃90s，72℃1min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min，終止溫度為4℃。測序分析結(jié)果表明，經(jīng)上述過程擴增得到的核苷酸序列長度為1383bp(其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)，該序列編碼一個完整的開放閱讀框，編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

實施例2 易錯PCR構(gòu)建TPL突變文庫

以實施例1獲得的TPL基因為模板，通過易錯PCR擴增，獲得突變序列。擴增引物為(5’GCTGAGGATCCATGAGATTTGAAGATTATCCAGC3’)和(5’GCATCCTCGAGTTATTTTTTTATTCCAAATCTAGC3’)。

擴增體系為：50μl反應(yīng)體系：

10xTaq polymerase buffer：5μL；

Mg²⁺(25mM)：2-8μL；

Mm²⁺(25mM):2-8μL；

10mMdNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)4μ；

濃度為50μM的上游引物、下游引物各1μL，

DNA模板：1μL；

Taq DNA聚合酶：10U；

用雙蒸水補足體系。

PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃1min，然后進入溫度循環(huán)95℃10s，56℃90s，72℃1min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min，終止溫度為4℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析和切膠回收，由BamHI/XhoI進行雙酶切，與同樣進行酶切處理的pET28a連接，連接液電擊轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞，涂布含卡那霉素(50μg/ml)的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，得到TPL的突變文庫。

實施例3 TPL突變文庫的篩選

TPL突變文庫的篩選同文獻所述(Choi,et al.,Kor.J.Microbiol.2006,34:58-62)。以突變前的酶為參照，初篩獲得活力提高的陽性克隆，進一步通過液相色譜測定。通過第一輪突變后，獲得活性最高的突變體，測序表明獲得的突變體為E84K。提取含E84K突變體的質(zhì)粒為模板，進行第二輪易錯PCR，如實施例2，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌后，再進行突變文庫的篩選，獲得活力較E84K提高的突變體，經(jīng)測序表明獲得的突變體為雙突變體E84K/T129I，其氨基酸序列如SEQ ID No.4，核苷酸序列為SEQ ID No.3。

實施例4 野生型和突變體TPL工程菌的誘導(dǎo)表達

分別將含野生型(SEQ ID No.1)和突變體TPL(SEQ ID No.3)重組質(zhì)粒的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-FnTPL和E.coli BL21(DE3)/pET28a-FnTPLM接種至含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，再以1％(v/v)接種量接種到含50μg/mL卡那霉素的50mL LB培養(yǎng)基中，37℃、200rpm培養(yǎng)至菌體濃度OD₆₀₀至0.6左右，加入終濃度為0.1mM的IPTG，28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6～8h后，4℃、8000rpm離心10min收集濕菌體，于-80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

實施例5 TPL突變體催化劑的制備

(1)斜面培養(yǎng)：將含具核梭桿菌TPL突變體編碼基因的重組基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-FnTPLM接種至含50μg/ml卡那霉素的斜面培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)16h，獲得斜面菌體；所述斜面培養(yǎng)基質(zhì)量終濃度組成為：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，1.5％瓊脂，溶劑為去離子水，pH 7.0，使用前加入50μg/ml卡那霉素。

實施例6 野生型及突變體TPL催化合成左旋多巴

以實施例4獲得的突變體菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-FnTPLM和出發(fā)菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-FnTPL細胞分別測定催化合成左旋多巴的能力。

(1)在500ml反應(yīng)體系中添加鄰苯二酚5g/L，丙酮酸鈉5g/L，醋酸銨5g/L，亞硫酸鈉0.5g/L，EDTA·Na₂0.5g/L，磷酸吡哆醛(PLP)0.05mM，氨水調(diào)pH至8.0，實施例5制備的TPL突變體重組細胞濃度5g/L(濕重)；溫度15℃條件下進行反應(yīng)。反應(yīng)過程采用補料的方式進行，每隔0.5h補料一次，其中鄰苯二酚每次補料0.5g/L，丙酮酸鈉每次補料0.8g/L，醋酸銨每次補料2g/L轉(zhuǎn)化24h。反應(yīng)結(jié)束后用高效液相色譜進行檢測，檢測條件如下：

流動相:A:B＝9:1(A:0.02M KH2PO4-6M HCl,pH＝2.6；B:甲醇)

色譜柱:C18(Welchrom 4.6*250mm)

檢測波長:280nm

柱溫:34℃

進樣量:10μL

流速:1ml/min

TPL突變體菌株細胞催化合成左旋多巴，目標產(chǎn)物濃度達到20g/L，轉(zhuǎn)化率達45％，產(chǎn)率39％，左旋多巴光學(xué)純度大于99.5％；野生型TPL菌株細胞催化合成左旋多巴，目標產(chǎn)物濃度達到15g/L，轉(zhuǎn)化率達36％，產(chǎn)率達29％，左旋多巴光學(xué)純度大于99.5％。

(2)在500ml反應(yīng)體系中添加鄰苯二酚5g/L，丙酮酸鈉8g/L，醋酸銨50g/L，亞硫酸鈉1g/L，EDTA·Na₂2g/L，磷酸吡哆醛(PLP)1mM，氨水調(diào)pH至8.0，實施例5制備的TPL突變體重組細胞濃度20g/L(濕重)；溫度15℃條件下進行反應(yīng)。反應(yīng)過程采用補料的方式進行，每隔1h補料一次，其中鄰苯二酚每次補料5g/L，丙酮酸鈉每次補料5g/L，醋酸銨每次補料3.5g/L轉(zhuǎn)化17h。TPL突變體菌株細胞催化合成左旋多巴，目標產(chǎn)物濃度達到140g/L(圖1)，轉(zhuǎn)化率達99.8％，產(chǎn)率高于91％，左旋多巴光學(xué)純度大于99.5％；而野生型TPL菌株細胞催化合成左旋多巴，目標產(chǎn)物濃度達到120g/L(圖1)，轉(zhuǎn)化率達85％，產(chǎn)率達78％，左旋多巴光學(xué)純度大于99.5％。

(3)在500ml反應(yīng)體系中添加鄰苯二酚20g/L，丙酮酸鈉20g/L，醋酸銨60g/L，亞硫酸鈉5g/L，EDTA·Na₂5g/L，磷酸吡哆醛(PLP)3.5mM，氨水調(diào)pH至8.0，TPL突變體重組細胞濃度35g/L(濕重)；溫度15℃條件下進行反應(yīng)。反應(yīng)過程采用補料的方式進行，每隔2h補料一次，其中鄰苯二酚每次補料8g/L，丙酮酸鈉每次補料8g/L，醋酸銨每次補料15g/L轉(zhuǎn)化20h。TPL突變體菌株細胞催化合成左旋多巴，目標產(chǎn)物濃度達到58g/L，轉(zhuǎn)化率達41％，產(chǎn)率達35％，左旋多巴光學(xué)純度大于99.5％；而野生型菌株細胞催化合成左旋多巴，目標產(chǎn)物濃度達到45g/L，轉(zhuǎn)化率達35％，產(chǎn)率達27％，左旋多巴光學(xué)純度大于99.5％。

(4)在500ml反應(yīng)體系中添加鄰苯二酚50g/L，丙酮酸鈉50g/L，醋酸銨100g/L，亞硫酸鈉10g/L，EDTA·Na₂10g/L，磷酸吡哆醛(PLP)5mM，氨水調(diào)pH至8.0，實施例5制備的TPL突變體重組細胞濃度50g/L(濕重)；溫度15℃條件下進行反應(yīng)。反應(yīng)過程采用補料的方式進行，每隔3h補料一次，其中鄰苯二酚每次補料10g/L，丙酮酸鈉每次補料10g/L，乙酸銨每次補料20g/L轉(zhuǎn)化9h。TPL突變體菌株細胞催化合成左旋多巴，目標產(chǎn)物濃度達到45g/L，轉(zhuǎn)化率達35％，產(chǎn)率達28％，左旋多巴光學(xué)純度大于99.5％；而野生型菌株細胞催化合成左旋多巴，目標產(chǎn)物濃度達到30g/L，轉(zhuǎn)化率達25％，產(chǎn)率達19％，左旋多巴光學(xué)純度大于99.5％。

本發(fā)明不受上述具體文字描述的限制。本發(fā)明可在權(quán)利要求書所概括的范圍內(nèi)作各種改變，這些改變均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工業(yè)大學(xué)

<120> 一種具核梭桿菌酪氨酸酚裂解酶突變體、基因、載體、工程菌及其應(yīng)用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1383

<212> DNA

<213> Fusobacteriumnucleatum

<400> 1

atgagatttg aagattatcc agcagagcca tttagaatta aaagtgtaga aactgttaaa 60

atgattgata aggcagcaag agaagaagta attaaaaaag caggatataa tactttctta 120

attaactctg aagatgttta cattgattta ttaactgata gtggaactaa tgctatgagt 180

gataaacaat ggggtggatt aatgcaaggt gatgaagctt atgcaggaag tagaaatttc 240

ttccacttag aagaaactgt aaaagaaata tttgggttta aacatatagt tcctactcac 300

caaggaagag gagcagaaaa tattttatct caaatagcta taaaacctgg acaatatgtt 360

cctggaaata tgtattttac aactactaga tatcaccaag aaagaaatgg tggaatattt 420

aaagatatta tcagagatga ggcacatgat gctactctta atgttccttt caaaggagat 480

attgacttaa ataaattaca aaaattaata gatgaagttg gagcagaaaa cattgcttat 540

gtttgtttag ctgtaactgt aaaccttgct ggtggacaac cagtttctat gaaaaatatg 600

aaagcagtta gagaactaac taaaaaacat ggaataaaag ttttctatga tgcaactaga 660

tgtgttgaaa atgcttactt cattaaagaa caagaagaag gatatcaaga taaaactata 720

aaggaaatag tgcatgaaat gtttagctat gctgatggat gtactatgag tggtaaaaaa 780

gattgtcttg ttaatatagg tggattttta tgtatgaatg atgaagattt attcttagct 840

gcaaaagaaa tagttgttgt ttatgaaggt atgccatctt atggtggact tgctggtaga 900

gatatggaag ctatggcaat agggttaaga gaatctttac aatatgaata cattagacat 960

agaattttac aagttagata cttaggagaa aaattaaaag aagctggtgt acctatactt 1020

gaaccagttg gaggacatgc tgtattccta gatgctagaa gattctgtcc tcatatccca 1080

caagaagaat tcccagctca agctcttgca gcagctatct atgttgaatg tggtgtaaga 1140

actatggaaa gaggaataat ttctgctggt agagatgtaa aaactggtga aaaccataaa 1200

cctaaactag aaactgttag agttactatt ccaagaagag tttatactta taaacatatg 1260

gatgtagtag cagaaggtat aatcaaatta tataaacata aagaagatat aaaaccatta 1320

gaatttgtat atgaaccaaa acaattaaga ttctttacag ctagatttgg aataaaaaaa 1380

taa 1383

<210> 2

<211> 460

<212> PRT

<213> Fusobacteriumnucleatum

<400> 2

Met Arg Phe Glu Asp Tyr Pro Ala Glu Pro Phe Arg Ile Lys Ser Val

1 5 10 15

Glu Thr Val Lys Met Ile Asp Lys Ala Ala Arg Glu Glu Val Ile Lys

20 25 30

Lys Ala Gly Tyr Asn Thr Phe Leu Ile Asn Ser Glu Asp Val Tyr Ile

35 40 45

Asp Leu Leu Thr Asp Ser Gly Thr Asn Ala Met Ser Asp Lys Gln Trp

50 55 60

Gly Gly Leu Met Gln Gly Asp Glu Ala Tyr Ala Gly Ser Arg Asn Phe

65 70 75 80

Phe His Leu Glu Glu Thr Val Lys Glu Ile Phe Gly Phe Lys His Ile

85 90 95

Val Pro Thr His Gln Gly Arg Gly Ala Glu Asn Ile Leu Ser Gln Ile

100 105 110

Ala Ile Lys Pro Gly Gln Tyr Val Pro Gly Asn Met Tyr Phe Thr Thr

115 120 125

Thr Arg Tyr His Gln Glu Arg Asn Gly Gly Ile Phe Lys Asp Ile Ile

130 135 140

Arg Asp Glu Ala His Asp Ala Thr Leu Asn Val Pro Phe Lys Gly Asp

145 150 155 160

Ile Asp Leu Asn Lys Leu Gln Lys Leu Ile Asp Glu Val Gly Ala Glu

165 170 175

Asn Ile Ala Tyr Val Cys Leu Ala Val Thr Val Asn Leu Ala Gly Gly

180 185 190

Gln Pro Val Ser Met Lys Asn Met Lys Ala Val Arg Glu Leu Thr Lys

195 200 205

Lys His Gly Ile Lys Val Phe Tyr Asp Ala Thr Arg Cys Val Glu Asn

210 215 220

Ala Tyr Phe Ile Lys Glu Gln Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Lys Thr Ile

225 230 235 240

Lys Glu Ile Val His Glu Met Phe Ser Tyr Ala Asp Gly Cys Thr Met

245 250 255

Ser Gly Lys Lys Asp Cys Leu Val Asn Ile Gly Gly Phe Leu Cys Met

260 265 270

Asn Asp Glu Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Glu Ile Val Val Val Tyr

275 280 285

Glu Gly Met Pro Ser Tyr Gly Gly Leu Ala Gly Arg Asp Met Glu Ala

290 295 300

Met Ala Ile Gly Leu Arg Glu Ser Leu Gln Tyr Glu Tyr Ile Arg His

305 310 315 320

Arg Ile Leu Gln Val Arg Tyr Leu Gly Glu Lys Leu Lys Glu Ala Gly

325 330 335

Val Pro Ile Leu Glu Pro Val Gly Gly His Ala Val Phe Leu Asp Ala

340 345 350

Arg Arg Phe Cys Pro His Ile Pro Gln Glu Glu Phe Pro Ala Gln Ala

355 360 365

Leu Ala Ala Ala Ile Tyr Val Glu Cys Gly Val Arg Thr Met Glu Arg

370 375 380

Gly Ile Ile Ser Ala Gly Arg Asp Val Lys Thr Gly Glu Asn His Lys

385 390 395 400

Pro Lys Leu Glu Thr Val Arg Val Thr Ile Pro Arg Arg Val Tyr Thr

405 410 415

Tyr Lys His Met Asp Val Val Ala Glu Gly Ile Ile Lys Leu Tyr Lys

420 425 430

His Lys Glu Asp Ile Lys Pro Leu Glu Phe Val Tyr Glu Pro Lys Gln

435 440 445

Leu Arg Phe Phe Thr Ala Arg Phe Gly Ile Lys Lys

450 455 460

<210> 3

<211> 1383

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

atgagatttg aagattatcc agcagagcca tttagaatta aaagtgtaga aactgttaaa 60

atgattgata aggcagcaag agaagaagta attaaaaaag caggatataa tactttctta 120

attaactctg aagatgttta cattgattta ttaactgata gtggaactaa tgctatgagt 180

gataaacaat ggggtggatt aatgcaaggt gatgaagctt atgcaggaag tagaaatttc 240

ttccacttag aaaaaactgt aaaagaaata tttgggttta aacatatagt tcctactcac 300

caaggaagag gagcagaaaa tattttatct caaatagcta taaaacctgg acaatatgtt 360

cctggaaata tgtattttac aactattaga tatcaccaag aaagaaatgg tggaatattt 420