本發(fā)明涉及一種酶活及熱穩(wěn)定性改善的凝乳酶突變體，屬于酶工程技術領域。

背景技術：

凝乳酶是一種最早在未斷奶的小牛胃中發(fā)現(xiàn)的天門冬氨酸蛋白酶，可專一地切割乳中κ-酪蛋白的Phe105-Met106之間的肽鍵，破壞酪蛋白膠束使牛奶凝結，凝乳酶的凝乳能力及蛋白水解能力使其成為干酪生產中形成質構和特殊風味的關鍵性酶，被廣泛地應用于奶酪和酸奶的制作。

增強凝乳酶的凝乳能力，降低對蛋白的水解能力以及降低耐熱性一直是凝乳酶蛋白改造的熱門方向。Chitpinityol等(1998)利用定點突變技術對77位點進行蘇氨酸到天冬氨酸的改變，導致突變子較重組野生型凝乳酶活力有所下降；目前為止，對于小牛凝乳酶等動物凝乳酶及微小毛霉等真菌凝乳酶研究較多，對于細菌源凝乳酶定點突變的研究國內暫未發(fā)現(xiàn)。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種凝乳酶突變體，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1～3所示。

本發(fā)明的第二個目的是提供編碼所述凝乳酶突變體的基因。

本發(fā)明的第三個目的是提供表達所述凝乳酶突變體的基因工程菌，所述基因工程菌以pPIC9K-cMCE為載體，以畢赤酵母為宿主，表達SEQ ID NO.1～3任一所示的凝乳酶突變體。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因工程菌以畢赤酵母GS115為宿主。

本發(fā)明的第四個目的是提供構建所述基因工程菌的方法，所述方法是將pPIC9K-cMCE與編碼所述凝乳酶突變體的基因連接，轉化至畢赤酵母中。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述pPIC9K-cMCE的構建方法公開于專利申請?zhí)枮?01611157248.4的發(fā)明專利申請中；所述畢赤酵母是畢赤酵母GS115。

本發(fā)明的第五個目的是提供一種提高凝乳酶酶活的方法，是將SEQ ID NO.4所示的凝乳酶第75位亮氨酸突變?yōu)楣劝滨０帆@得SEQ ID NO.1所示突變體，或將第222位的蛋氨酸替換為蘇氨酸獲得SEQ ID NO.2所示突變體。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法是將SEQ ID NO.4所示的凝乳酶第75位亮氨酸突變?yōu)楣劝滨０?，并將?22位的蛋氨酸替換為蘇氨酸獲得SEQ ID NO.3所示突變體。

本發(fā)明的第六個目的是提供一種產凝乳酶的方法，是將所述基因工程菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，25～30℃培養(yǎng)24～96h。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵通過流加甲醇高效誘導畢赤酵母胞外表達凝乳酶。

本發(fā)明還提供所述凝乳酶突變體在食品、生物、醫(yī)藥領域的應用。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應用具體為制備奶酪等乳制品。

有益效果：(1)本發(fā)明首次在解淀粉芽孢桿菌源凝乳酶基因上進行定點突變，采用PCR介導的一步法，進行單位點突變以及雙重突變，整個過程簡潔清晰，成功率達到90％以上。(2)Leu75Gln與Met222Thr雙重突變效果最好，粗酶液凝乳酶活，C/P值均提升了155.6％和195.0％，熱穩(wěn)定性也得到了降低，相比出發(fā)菌株降低了13.6％。提升了此類凝乳酶的商業(yè)價值，拓寬了商業(yè)領域，為獲得優(yōu)良的工業(yè)凝乳酶產品奠定了重要基礎。

附圖說明

圖1突變重組質粒雙酶切驗證；其中，M，15000bp Marker；0，出發(fā)菌株P-Cmce；1～6分別對應重組質粒pPIC9K-cMCE-Leu75Gln，pPIC9K-cMCE-Val81Asp，pPIC9K-cMCE-Met222Thr，pPIC9K-cMCE-Leu75Gln-Val81Asp，pPIC9K-cMCE-Leu75Gln-Met222Thrp，和PIC9K-cMCEVal81Asp-Met222Thr；

圖2為突變轉化子搖瓶培養(yǎng)96h粗酶液的SDS-PAGA圖；其中，M，Marker；0，出發(fā)菌株P-Cmce；1～6，分別對應重組質粒pPIC9K-cMCE-Leu75Gln，pPIC9K-cMCE-Val81Asp，pPIC9K-cMCE-Met222Thr，pPIC9K-cMCE-Leu75Gln-Val81Asp，pPIC9K-cMCE-Leu75Gln-Met222Thrp，和PIC9K-cMCEVal81Asp-Met222Thr；

圖3為突變體與對照的熱穩(wěn)定性比較。

具體實施方式

1)凝乳活力測定

根據(jù)MAGDA方法，將脫脂乳粉用0.01mol/L CaCl₂配制10％復原脫脂乳溶液35℃條件下取待測酶液0.2mL加入2mL復原脫脂乳中并混勻，開始計時，至絮狀凝集顆粒出現(xiàn)為止(即40min凝固1mL 100g/L的脫脂乳所需的酶量定義為一個酶活力單位)。

酶活力(soxhelt unit,SU)＝(脫脂乳量mL/凝乳酶量mL)×D×2400/T

注：D為酶液稀釋倍數(shù)；T為凝乳時間。

2)蛋白水解活力測定

初酶液和酪蛋白溶液40℃水浴中預熱2min，取1mL酪蛋白溶液與1mL酶液混勻，40℃精確保溫10min，時間終止立即加入0.4mol/L三氯乙酸2mL，終止反應，繼續(xù)使其在水浴中保溫20min，離心去除沉淀，取上清1min，加入0.4mol/L碳酸鈉5mL 0.67moL/L的福林試劑1mL，搖勻，反應20min后光密度(OD₆₆₀)測定?？瞻自诩永业鞍字凹尤?.4mol/L三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入酪蛋白。

3)熱穩(wěn)定性測定

將待測樣品分別放在40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃溫度下保溫120min，每隔10min取樣一次，冰浴冷卻后在35℃下測定凝乳酶的剩余凝乳活力，以未經熱處理的凝乳活力為100％。

4)培養(yǎng)基

BMGY培養(yǎng)基：10g/L酵母粉，20g/L蛋白陳，3g/L磷酸氫二鉀，11.8g/L磷酸二氫鉀，13.4g/L YNB，4×10^-4g/L生物素，10g/L甘油。

BMMY培養(yǎng)基：10g/L酵母粉，20g/L蛋白陳，3g/L磷酸氫二鉀，11.8g/L磷酸二氫鉀，13.4g/L YNB，4×10^-4g/L生物素，5ml/L無水甲醇。

MM培養(yǎng)基：13.4g/L YNB，4×10^-4g/L生物素，5ml/L甲醇，15g/L瓊脂。

MD培養(yǎng)基：13.4g/L YNB，4×10^-4g/L生物素，20g/L葡萄糖，0.4g/L組氨酸，15g/L瓊脂。

實施例1

(1)確定解淀粉芽孢桿菌源凝乳酶基因定點突變位點

通過計算機對微小毛霉凝乳酶基因進行三級結構模擬，同時與牛凝乳酶三級結構及核酸序列對比，選定3個關鍵位點進行定點突變，分別選定可能與水解或熱穩(wěn)定性相關的位點75、81位點和222位點。

75位點原為亮氨酸，81位點原為纈氨酸，222位點原為蛋氨酸，本發(fā)明預將75位點突變?yōu)楣劝滨０罚?1位點突變?yōu)樘於彼幔?22位點突變?yōu)樘K氨酸，通過PCR介導的一步法進行點突變。

通過DNAMAN對選定的突變位點設計引物，如表1所示。

表1定點突變所用的引物序列

(2)PCR介導的一步法定點突變

用杭州寶賽生物科技有限公司的試劑盒(PE01)提取大腸桿菌JM109-cMCE的重組質粒pPIC9K-cMCE(公開于申請?zhí)枮?01611157248.4的發(fā)明專利申請中)。以Leu75Gln-F和Leu75Gln-R為引物對凝乳酶第75位亮氨酸進行突變，構建重組質粒pPIC9K-cMCE-Leu75Gln；以Val81Asp-F和Val81Asp-R為引物，對凝乳酶第81位纈氨酸進行突變，構建重組質粒pPIC9K-cMCE-Val81Asp；以Met222Thr-F和Met222Thr-R為引物，對凝乳酶第222位蛋氨酸進行突變，構建重組質粒pPIC9K-cMCE-Met222Thr。

PCR反應體系如下：super pfu PCR Master Mix 50μL，ddH2O 50μL，20μM/L上、下游引物各2μL，模板DNA 2μL，總體積100μL，分裝10管，每管10μL。反應條件:94℃預變性3min；98℃變性40s，60℃退火1min，68℃延伸11min；18次circle；72℃延伸10min。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1所示。

在單位點突變成功后，以單位點突變質粒為模板，用另一對突變引物，按照同樣的PCR體系，引入第二個突變位點，即構建雙重突變位點Leu75Gln-Val81Asp，Leu75Gln-Met222Thr，Val81Asp-Met222Thr。

PCR反應結束后，直接在PCR反應體系中加入1μL Dpn I，混勻后37℃金屬浴孵育1h。

用杭州寶賽生物科技有限公司的試劑盒(PE03)純化PCR產物，重組載體轉化到大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，獲得重組菌，挑取重組菌單克隆，提取質粒pPIC9K-cMCE-Leu75Gln，pPIC9K-cMCE-Val81Asp，pPIC9K-cMCE-Met222Thr，pPIC9K-cMCE-Leu75Gln-Val81Asp，pPIC9K-cMCE-Leu75Gln-Met222Thrp，和PIC9K-cMCEVal81Asp-Met222Thr。

用EcoR I和Not I雙酶切重組載體pPIC9K-cMCE-Leu75Gln，pPIC9K-cMCE-Val81Asp，pPIC9K-cMCE-Met222Thr，pPIC9K-cMCE-Leu75Gln-Val81Asp，pPIC9K-cMCE-Leu75Gln-Met222Thrp，和PIC9K-cMCEVal81Asp-Met222Thr后，進行瓊脂糖凝膠電泳，如圖1，載體和目的片段的長度分別都相等。

挑選酶切鑒定正確的重組載體送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，擴增的凝乳酶基因的核苷酸序列以及與原序列比對結果的一致性達到99.82％，除突變位點之外的核苷酸序列完全一致。。

實施例2

(1)凝乳酶突變體在畢赤酵母里的表達

凝乳酶突變體在畢赤酵母里的表達步驟參照申請?zhí)枮?01611157248.4的專利申請實施例一的相關操作步驟。

重組載體pPIC9K-cMCE-Leu75Gln，pPIC9K-cMCE-Val81Asp，pPIC9K-cMCE-Met222Thr，pPIC9K-cMCE-Leu75Gln-Val81Asp，pPIC9K-cMCE-Leu75Gln-Met222Thrp，和PIC9K-cMCEVal81Asp-Met222Thr用Sac I酶切線性化后，2500V，5ms電轉化畢赤酵母GSll5感受態(tài)細胞先后涂布到MM和MD平板上，篩選出His⁺和Mut⁺型轉化子P-cMCE。

挑選轉化子進行菌落PCR驗證，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，挑選轉化子于BMGY培養(yǎng)基中，30℃/300rpm培養(yǎng)至0D600＝2～6；收集菌體，用BMMY重懸菌體，使OD600＝5.0左右，向培養(yǎng)基中添加無水甲醇至終濃度為0.5％(v/v，5mL甲醇/L培養(yǎng)基)；每12h添加終濃度0.5％(v/v)的甲醇，96h后結束誘導，濃縮誘導96h后發(fā)酵液上清。

(2)重組凝乳酶的純化

取畢赤酵母P-cMCE誘導96小時的發(fā)酵液100mL，然后加入飽和過硫酸銨溶液至過硫酸銨終濃度為60％，4℃放置過夜。10000rpm離心10min，收集蛋白沉淀，真空冷凍干燥，得到P-cMCE酶制劑0.566g。10mL磷酸緩沖鹽溶液復溶，取20ul樣品進行SDS-PAGE電泳檢測。

SDS-PAGE電泳結果如圖2所示，在分子量27kDa處有明顯的條帶，基本符合原菌凝乳酶蛋白大小。

實施例3

(1)凝乳酶活，蛋白酶活及C/P值性質的比較

C/P值是指單位質量的純酶粉其凝乳酶活性與蛋白酶活性的比率。能切實準確的表征凝乳酶的凝乳能力。

突變質粒Leu75Gln，Val81Asp，Met222Thr，Leu75Gln-Val81Asp，Leu75Gln-Met222Thr，Val81Asp-Met222Thr轉化畢赤酵母GS115，隨機挑取30個轉化子，接種量0.5％，以未進行突變的出發(fā)菌株P-cMCE作為對照，經BMGY培養(yǎng)和甲醇誘導，pH處于6.5～6.7，發(fā)酵溫度30℃在BMMY培養(yǎng)基中發(fā)酵96h，離心取上清，測定粗酶液凝乳酶活力，蛋白水解活力，計算C/P比值，結果如表2所示。

由表2可以看出，在單位點突變中，Leu75Gln突變凝乳酶凝乳活性增高最多，達到25.0SU/mL，相比出發(fā)菌株提高了138.9％，Val81Asp突變凝乳酶蛋白水解活性明顯降低最為顯著，但凝乳活性極低，不利于凝乳作用；在雙重突變位點中，Leu75Gln-Met222Thr雙重突變凝乳酶凝乳活性增高最多，達到28.0SU/mL，蛋白水解活性降低，同時，C/P比值大幅有提高，相比出發(fā)菌株提高了188.2％。

表2為三種定點突變轉化子與出發(fā)菌株的酶活力比較

(2)熱穩(wěn)定性的比較

對凝乳酶突變體Leu75Gln和Met222Thr以及這兩個突變位點組合的突變體Leu75Gln-Met222Thr進行熱穩(wěn)定性的復篩，結果如圖3所示。

由圖3可以看出，Leu75Gln和Met222Thr兩個位點的突變，均使突變凝乳酶熱穩(wěn)定性變弱，均弱于出發(fā)菌株。受到凝乳酶在應用方面的特性影響，當凝乳酶的熱穩(wěn)定性變差，其在較低溫度下發(fā)生失活的現(xiàn)象，從而使乳制品(例如奶酪等)在存放過程中不被水解成為乳清。相對于Leu75Gln位突變凝乳酶，T218S位突變凝乳酶具有更弱的熱穩(wěn)定性。Met222Thr位突變凝乳酶45℃處理60min后，相對凝乳活力為62.0％。Leu75Gln與Met222Thr雙重突變凝乳酶熱穩(wěn)定性弱化程度雖不如Met222Thr單位點突變凝乳酶，但相比出發(fā)菌株P-cMCE弱化了16％。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學

<120> 一種酶活及熱穩(wěn)定性改善的凝乳酶突變體

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 275

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu

1 5 10 15

His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp

20 25 30

Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala

35 40 45

Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His

50 55 60

Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Gln Asn Asn Ser Ile Gly

65 70 75 80

Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu

85 90 95

Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu

100 105 110

Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly

115 120 125

Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala

130 135 140

Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly

145 150 155 160

Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala

165 170 175

Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val

180 185 190

Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr

195 200 205

Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser

210 215 220

Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn

225 230 235 240

Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys

245 250 255

Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala

260 265 270

Ala Ala Gln

275

<210> 2

<211> 275

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu

1 5 10 15

His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp

20 25 30

Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala

35 40 45

Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His

50 55 60

Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly

65 70 75 80

Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu

85 90 95

Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu

100 105 110

Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly

115 120 125

Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala

130 135 140

Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly

145 150 155 160

Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala

165 170 175

Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val

180 185 190

Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr

195 200 205

Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Ser

210 215 220

Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn

225 230 235 240

Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys

245 250 255

Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala

260 265 270

Ala Ala Gln

275

<210> 3

<211> 275

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu

1 5 10 15

His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp

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Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala

35 40 45

Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His

50 55 60

Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Gln Asn Asn Ser Ile Gly

65 70 75 80

Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu

85 90 95

Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu

100 105 110

Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly

115 120 125

Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala

130 135 140

Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly

145 150 155 160

Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala

165 170 175

Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val

180 185 190

Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr

195 200 205

Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Ser

210 215 220

Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn

225 230 235 240

Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys

245 250 255

Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala

260 265 270

Ala Ala Gln

275

<210> 4

<211> 275

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu

1 5 10 15

His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp

20 25 30

Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala

35 40 45

Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His

50 55 60

Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly

65 70 75 80

Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu

85 90 95

Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu

100 105 110

Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly

115 120 125

Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala

130 135 140

Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly

145 150 155 160

Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala

165 170 175

Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val

180 185 190

Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr

195 200 205

Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser

210 215 220

Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn

225 230 235 240

Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys

245 250 255

Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala

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Ala Ala Gln

275

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agttgcggct caaaataact caa 23

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttgagttatt ttgagccgca act 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctcaatcggt aacttaggcg ttg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caacgcctaa gttaccgatt gag 23

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cggtacgtca atggcatctc cgc 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcggagatgc cattgacgta ccg 23