本發(fā)明涉及一種提高膽鹽水解酶分泌效率的方法，屬于基因工程技術領域。
背景技術：
膽鹽水解酶(BSH)是由bsh基因編碼的一種胞內酶，廣泛存在于腸道微生物中，是降解膽汁的主要組成成份——共軛膽酸第一步所需的酶。膽酸鹽水解酶可將共軛膽酸水解成牛磺酸或甘氨酸和游離膽酸，后者可由其它腸道微生物在腸道內作進一步降解。膽酸鹽水解酶的生理作用體現(xiàn)在兩個方面：一、影響宿主的脂肪代謝過程，減少脂肪的消化吸收和降低膽固醇水平等；二、膽汁的降解減少了膽汁對腸道微生物的毒性，改善了微生物生存的腸道環(huán)境；由降解產生的氨基酸和游離脂肪酸還可為微生物提供營養(yǎng)物質。
由于膽鹽水解酶通常來源于乳酸菌等微生物中，其生長環(huán)境和發(fā)酵強度不適合大規(guī)模工業(yè)化生產。另一方面，目前報道的多數(shù)膽鹽水解酶表達量低，易形成包涵體。因此，篩選一種能夠酶活較高并能高效表達的膽鹽水解酶基因對于工業(yè)化生產膽鹽水解酶，及運用膽鹽水解酶調節(jié)生物機體健康狀況具有重要意義。
畢赤酵母宿主雖然具有表達蛋白易于純化等優(yōu)點，然而目前的膽鹽水解酶在畢赤酵母中表達時，存在表達量不高或者是外源基因原始核苷酸序列并不十分適合于畢赤酵母宿主的問題，從而限制了膽鹽水解酶在畢赤酵母中的高效表達，酵母真核表達系統(tǒng)中存在的糖基化現(xiàn)象對堿性果膠酶的高效表達及性質存在極大影響。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種提高膽鹽水解酶分泌效率的方法，所述方法在產膽鹽水解酶的畢赤酵母的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加80～120mg/L的粟精胺、30～60mg/L Fe2+，并將所述畢赤酵母在30℃，200～220rpm發(fā)酵24～48h。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述產膽鹽水解酶的畢赤酵母是以pichia pastoris GS115為宿主，以pPIC9K為載體，表達SEQ ID NO.1所示基因的重組畢赤酵母。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組畢赤酵母還具有α-MF信號肽。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵是以按體積比1-5％的接種量將畢赤酵母接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，20～28℃，200～220rpm下發(fā)酵。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方包括：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，7-10％甲醇，YNB 13.4g/L。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述Fe2+為FeCl2。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵前還進行活化。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述活化是挑取畢赤酵母單菌落，接種至BMGY培養(yǎng)基中，30℃，200～220r/min培養(yǎng)16-24h。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述BMGY培養(yǎng)基含有蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，甘油40g/L，YNB 13.4g/L，
本發(fā)明還提供所述的方法在制備含膽鹽水解酶的產品中的應用。
有益效果：本發(fā)明提供了一種利用粟精胺和Fe2+提高畢赤酵母膽鹽水解酶分泌效率的方法，使發(fā)酵3d膽鹽水解酶酶活達14.96U/mL，與未外源添加物質相比(實施例3)提高了1.74倍。
具體實施方式
LB培養(yǎng)基：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。
YPD培養(yǎng)基：胰蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L。
MD培養(yǎng)基：YNB 13.4g/L、葡萄糖20g/L、生物素4×10-4g/L。
BMGY培養(yǎng)基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，甘油40g/L，YNB 13.4g/L，pH6.0的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液。
BMMY培養(yǎng)基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，7-10％甲醇，YNB 13.4g/L，pH6.0的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液。
膽鹽水解酶酶活測定方法：取10μL酶液用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)稀釋至90μL，加入10μL結合膽鹽(200mM)混合，于37℃孵育30min，加入等體積的15％(w/v)三氯乙酸終止反應，離心后取10μL上清液與190μL茚三酮試劑混合，于100℃反應15min，冷卻后于570nm處測定吸光值，根據(jù)甘氨酸標準曲線進行計算。其中，茚三酮試劑的組成為：0.5mL 1％(w/v)茚三酮(溶解于0.5M、pH5.5檸檬酸鹽緩沖液)，1.2mL甘油，0.2mL 0.5M、pH5.5的檸檬酸緩沖液。
具體實施方式中選用?；敲撗踅Y合膽鹽測定酶活。
實施例1重組質粒的構建及鑒定
將植物乳桿菌來源的bsh基因(NCBI登錄號為)進行密碼自由化，并通過化學合成獲得序列如SEQ ID NO.1所示序列，設計引物，通過融合PCR將SEQ ID NO.1所示序列與信號肽α-MF連接，柱回收產物獲得融合片段。將融合片段αMF-bsh和pPIC9K質粒16℃過夜連接。連接產物pPIC9K-αMF-bsh化學法轉化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞。將轉化液涂布于含50mg/L卡那霉素的LB平板，提取質粒測序驗證構建的重組質粒。
實施例2產膽鹽水解酶的重組畢赤酵母的構建
將重組質粒pPIC9K-αMF-bsh線性化，電擊轉化至pichia pastoris GS115感受態(tài)細胞，具體方法如下：
(1)接種YPD平板活化的pichia pastoris GS115于25mL/250mL三角瓶，30℃過夜培養(yǎng)；以1％(按體積比)接種上述培養(yǎng)液于含50mL/500mL培養(yǎng)基的三角瓶，培養(yǎng)菌體濃度OD600為1.3～1.5；
(2)5000r/min，4℃離心10min收集菌體，分別用50mL、25mL無菌水懸浮細胞；
(3)5mL 1M山梨醇重懸上述細胞，5000r/min，4℃離心10min收集菌體；
(4)500μL 1M山梨醇重懸上述細胞，分裝80μL/1.5mL EP管用于電轉化感受態(tài)細胞；5)20μL線性化質粒與上述80μL感受態(tài)細胞混合，冰上靜置15min；
(5)上述混合物加入預冷的無菌電轉化杯(0.2cm)，1500V、25μF、200Ω電擊一次，加入1mL1M山梨醇；
(6)取上述混合物150μL涂布MD平板，30℃培養(yǎng)3天；
(7)挑取陽性克隆，分別點種在1、2、3、4mg/mL(遺傳霉素)YPD平板中，挑選在4mg/mL遺傳霉素平板中的單菌落用于搖瓶發(fā)酵。
實施例3
將本發(fā)明構建的工程菌作為生產菌株，在YPD平板活化。種子液培養(yǎng)，接種50mL/250mL種子培養(yǎng)基，30℃，220r/min培養(yǎng)24h。離心種子液，按發(fā)酵培養(yǎng)基中種子終濃度為OD600＝1接種發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃，220r/min培養(yǎng)3d。測定膽鹽水解酶胞外酶活為5.46U/mL。
實施例4
按實施例3的方法培養(yǎng)和發(fā)酵，其區(qū)別在于，分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加100mg/L的粟精胺、苦馬豆素和衣霉素，發(fā)酵結束后測定膽鹽水解酶酶活，結果顯示，添加粟精胺、苦馬豆素和衣霉素后發(fā)酵3d膽鹽水解酶酶活分別為7.49U/mL，5.18U/mL，6.16U/mL。
實施例5
按實施例3的方法培養(yǎng)和發(fā)酵，其區(qū)別在于，分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加20～140mg/L(每20mg/L為一個梯度)的粟精胺，發(fā)酵結束后測定膽鹽水解酶酶活，結果如表1所示，添加80～120mg/L的粟精胺可將膽鹽水解酶酶活提高了125％以上。
表1不同濃度粟精胺對膽鹽水解酶酶活的影響
實施例6
按實施例3的方法培養(yǎng)和發(fā)酵，其區(qū)別在于，分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加50mg/L的金屬鹽離子，以未添加金屬鹽離子的胞外酶活為100％，測定培養(yǎng)基添加不同金屬鹽離子后膽鹽水解酶酶活，結果如表2所示。添加鐵離子的發(fā)酵液中膽鹽水解酶酶活提高至159.17％。
表2各種金屬離子對膽鹽水解酶酶活的影響
實施例7
按實施例3的方法培養(yǎng)和發(fā)酵，其區(qū)別在于，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加50mg/L的Fe2+離子，并添加100mg/L粟精胺，測定發(fā)酵結束后膽鹽水解酶酶活，結果顯示，發(fā)酵3d膽鹽水解酶酶活達14.96U/mL，與未外源添加物質相比(實施例3)提高了1.74倍。
雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
SEQUENCE LISTING
<110> 曹書華
<120> 一種提高膽鹽水解酶分泌效率的方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
<213> 人工序列
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