專利名稱：一種膽鹽水解酶及其生產(chǎn)方法與專用生產(chǎn)菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種膽鹽水解酶及其生產(chǎn)方法與專用生產(chǎn)菌株。
背景技術(shù)：
益生菌是指對人和動物機(jī)體有益的微生物。它們通過改善腸道微生物生態(tài)平衡，控制腸道感染，降低血清膽固醇水平，提高乳糖不耐癥人對乳糖的利用，并能刺激特異性或非特異性免疫反應(yīng)，具有增強(qiáng)免疫的作用。益生菌制品的活菌代謝穩(wěn)定，活性較強(qiáng)，通過消化道后大量存活，進(jìn)入腸道后發(fā)揮益生菌作用。早在1963年人們就證實乳桿菌發(fā)酵的酸奶具有降低膽固醇的能力。許多研究也表明了一些乳桿菌能夠降低總膽固醇的含量和低密度脂蛋白膽固醇含量。攝取含有某種乳桿菌或者雙歧桿菌的酸奶能夠降低血清膽固醇的含量。
大量的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常食用含有益生菌(主要是乳酸菌)的發(fā)酵制品有助于血清膽固醇含量的降低。Mann和Spoerry發(fā)現(xiàn)非洲Massai warrios部落里的人，由于長期大量飲用由當(dāng)?shù)匾吧樗峋l(fā)酵的牛奶，血清膽固醇的含量明顯比普通人群低。這一現(xiàn)象引起了營養(yǎng)學(xué)、醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)等各界人士的注意，從而掀起了乳酸菌降低膽固醇作用的研究熱潮。迄今為止，大量的研究發(fā)現(xiàn)和證實了不同種類的乳酸菌具有降低膽固醇作用的效果。
關(guān)于乳酸菌降低血清膽固醇的機(jī)理，目前尚未有明確答案。國內(nèi)外研究者的觀點(diǎn)主要集中在以下幾點(diǎn)(1)乳酸菌菌體細(xì)胞直接吸收膽固醇；(2)乳酸菌降解結(jié)合態(tài)膽鹽轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)膽鹽，后者溶解度下降與膽固醇發(fā)生共沉淀；降解后的膽鹽為游離膽鹽，且其在腸道的溶解度和被吸收能力均比結(jié)合態(tài)膽鹽差，可以糞便的形式排出體外，由此導(dǎo)致了膽固醇的代謝加速，達(dá)到降低血清膽固醇水平的效果；(3)其他理論。
膽鹽水解酶是乳酸菌在人體內(nèi)的一種代謝產(chǎn)物，該酶能水解結(jié)合態(tài)膽鹽，使結(jié)合膽鹽降解為游離態(tài)膽鹽，后者的溶解度比前者有所降低，因此能使膽固醇以沉淀的形式排出體外，其代謝產(chǎn)物為氨基酸，對人體無害。
Klaver等利用多株乳桿菌和雙歧桿菌進(jìn)行的降膽固醇研究證實乳酸菌產(chǎn)生的膽鹽水解酶可以使結(jié)合膽鹽分解為游離膽鹽，游離膽鹽與膽固醇形成復(fù)合物共同沉淀下來，從而導(dǎo)致環(huán)境中膽固醇含量的降低。
Verstrate認(rèn)為乳酸菌的高膽鹽水解酶活力這一特征在降低膽固醇含量方面起著重要作用。此外，Ahn認(rèn)為乳酸菌的膽鹽水解酶在降低膽固醇方面具有重要作用。
國內(nèi)關(guān)于干酪乳桿菌的研究主要是其降血脂、抗高血壓、治療過敏性疾病等保健功效上，如曹性根所申請的中國專利新穎的抗幽門螺桿菌和大腸桿菌157H7的類干酪乳桿菌類干酪亞種菌株的抗細(xì)菌劑(專利申請?zhí)枮镃N01805665.2)；熱爾韋·達(dá)諾尼公司所申請的干酪乳桿菌在免疫刺激肽中的應(yīng)用(專利申請?zhí)枮镃N01810051.1)；上海光明乳業(yè)股份有限公司申請的干酪乳桿菌Bd-II菌株及其在降低血脂方面的應(yīng)用(專利申請?zhí)枮镃N03128995.9)；干酪乳桿菌LC2W菌株及其在抗高血壓方面的應(yīng)用(專利申請?zhí)枮镃N03129450.2)。此外還有景岳生物科技股份有限公司申請的新的微生物株類干酪乳桿菌GM-080及其治療過敏相關(guān)疾病的用途(專利申請?zhí)枮镃N200410038566.X)。
國外關(guān)于干酪乳桿菌的專利也主要是集中在干酪乳桿菌作為益生菌對各種疾病的防治作用上，主要有遺傳性過敏性疾病、癌癥、口臭、新陳代謝綜合癥、益生菌療法等，較之國內(nèi)其研究的范圍更廣泛。干酪乳桿菌還可以作為生物保護(hù)劑，用其抑制病原菌的生長(2005024439)。Glenn；Matthew等從乳酸菌中分離得到的多肽類物質(zhì)是對乳酸菌所產(chǎn)生的特殊功效物質(zhì)的研究。而國內(nèi)無任何乳酸菌產(chǎn)膽鹽水解酶的文章報道和專利報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種乳酸菌膽鹽水解酶(Bile Salt Hydrolase，BSH)及其生產(chǎn)方法與專用生產(chǎn)菌株。
本發(fā)明所提供的膽鹽水解酶的專用生產(chǎn)菌株，是干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)KTx，已于2006年06月23日保藏于中國微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號)，保藏號為CGMCC №.1739。
干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx分離自東北普通家庭的開菲爾。在MRS培養(yǎng)基上，干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx的菌落為乳白色或微帶黃色，略有凸起。個體形態(tài)為不規(guī)則G+無芽孢桿菌，呈現(xiàn)桿狀。
本發(fā)明所提供的膽鹽水解酶，是發(fā)酵干酪乳桿菌KTx CGMCC №.1739得到的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)膽鹽水解酶的方法，包括下述步驟1)發(fā)酵干酪乳桿菌KTx CGMCC №.1739，收集菌體；
2)破碎菌體，收集蛋白，得到膽鹽水解酶。
所述方法中，所述步驟1)中發(fā)酵干酪乳桿菌KTx CGMCC №.1739的培養(yǎng)基的碳源和氮源分別為葡萄糖和大豆蛋白胨。所述培養(yǎng)基優(yōu)選為1L中含有葡萄糖2％～4％，大豆蛋白胨0.5％～3％，MnSO40.025％，牛肉膏1.00％、酵母膏0.5％、吐溫800.10％，磷酸氫二鉀0.20％，乙酸鈉0.50％，檸檬酸銨0.20％，硫酸鎂0.058％的培養(yǎng)基；所述百分含量均為質(zhì)量百含量。
所述培養(yǎng)基優(yōu)選為1L中含有葡萄糖添加量2％、大豆蛋白胨添加量3％、MnSO40.025％、牛肉膏1.00％、酵母膏0.5％、吐溫80 0.10％、磷酸氫二鉀0.20％、乙酸鈉0.50％、檸檬酸銨0.20％、硫酸鎂0.058％的培養(yǎng)基；所述百分含量均為質(zhì)量百分含量。
所述方法中，所述步驟1)中發(fā)酵干酪乳桿菌KTx CGMCC №.1739的溫度可為30～40℃，發(fā)酵時間可為10～12h，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值可為5.0～7.0。
所述步驟1)中所述發(fā)酵干酪乳桿菌KTx CGMCC №.1739的溫度優(yōu)選為37℃，發(fā)酵時間優(yōu)選為12h、發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值優(yōu)選為6.0。
所述方法中，還包括將步驟2)獲得的膽鹽水解酶采用陰離子層析法純化，得到純化的膽鹽水解酶；所述分離條件為以DEAE-Sepharose Fast Flow為凝膠填料，0.05mol/L NaCl作為洗脫劑，收集280nm吸收峰處樣品。
本發(fā)明的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx，發(fā)酵可產(chǎn)生高活性的膽鹽水解酶，其產(chǎn)生膽鹽水解酶活力可達(dá)8.85U/2×107cfu，純化后的比活力達(dá)到1259.84U/mg。本發(fā)明的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx對人體具有可靠的安全性，制成活菌制劑，可省去常規(guī)發(fā)酵、提取等繁瑣工藝。本發(fā)明的干酪乳桿菌生產(chǎn)的膽鹽水解酶，可以作為添加劑添加到食品或藥品中達(dá)到降膽固醇的目的，是高效、無毒副作用的新型生物功能添加劑；該膽鹽水解酶還可以以酶制劑的方式直接食用，同樣可降低膽固醇的含量。由本發(fā)明的干酪乳桿菌生產(chǎn)膽鹽水解酶的方法，對設(shè)備要求低，操作簡單，成本較低，適于工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為干酪乳桿菌KTx發(fā)酵產(chǎn)生的膽鹽水解酶活力隨pH值的變化。
圖2為干酪乳桿菌KTx發(fā)酵產(chǎn)生的膽鹽水解酶活力隨溫度的變化。
圖3為干酪乳桿菌KTx發(fā)酵產(chǎn)生的膽鹽水解酶活力隨底物濃度的變化。
圖4為干酪乳桿菌KTx發(fā)酵產(chǎn)生的膽鹽水解酶的Km值。
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實施例1、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx分離和鑒定1、菌株的篩選開菲爾濾液5ml加入45ml生理鹽水(帶玻璃珠)制成菌懸液，然后10倍梯度稀釋106～108倍，取1ml傾注到平板(含有CaCO3的MRS瓊脂平板)于37℃培養(yǎng)24h，挑取有溶解圈的菌落置于MRS液體管中37℃增菌培養(yǎng)12h，Grans染色，視其純度，吸取增菌液以2％(體積比)的接種量接種于以膽固醇為唯一碳源的I號培養(yǎng)基(含有鹽溶液I 1L和膽固醇1.0g的培養(yǎng)基；鹽溶液I(g/L)KH2PO40.25；MgSO4·7H2O 0.25；FeSO45mg；NaCl 5mg；制備時，將膽固醇溶于鹽溶液I后用超聲波細(xì)胞粉粹機(jī)500w震蕩乳化20min；調(diào)pH值至7.0，121℃滅菌20min)中37℃培養(yǎng)20h，鄰苯二甲醛法測膽固醇剩余量，根據(jù)I號培養(yǎng)基中膽固醇含量的降低，初篩獲得的具有降膽固醇功能的菌株。
將初篩后獲得的能降膽固醇的菌株，用牛津杯法接種于含有0.3％的牛磺膽鹽、0.1％膽固醇、0.2％CaCl2的MRS瓊脂培養(yǎng)基中(1L中含有牛肉膏10g，酵母提取物5g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，檸檬酸二銨2g，乙酸鈉5g，吐溫801mL，K2HPO42g，MnSO40.25g，MgSO4·7H2O 0.58g，瓊脂15g)在牛津杯中加入0.1ml的MRS培養(yǎng)菌液，于37℃厭氧罐中培養(yǎng)72h后觀察牛津杯周圍是否有不透明的沉淀圈產(chǎn)生。以不含?；悄扄}、0.1％膽固醇、0.2％CaCl2的MRS瓊脂培養(yǎng)基作為對照。將牛津杯周圍白色沉淀物輕輕刮下，溶解于少量蒸餾水的試管中，滴加茚三酮顯色液，觀察是否有藍(lán)紫色反應(yīng)，以此初步確定菌株是否產(chǎn)生膽鹽水解酶。通過實驗獲得一株產(chǎn)膽鹽水解酶的菌株，命名為KTx。將茚三酮反應(yīng)陽性的菌株劃線接種于MRS斜面試管，培養(yǎng)后保存?zhèn)溆谩?br> 2、菌株KTx的鑒定將步驟1獲得的產(chǎn)膽鹽水解酶的菌株KTx，接種于MRS液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，進(jìn)行下述鑒定。
糖醇類發(fā)酵試驗，接觸酶(H2O2酶)試驗，硝酸鹽還原試驗，甲基紅試驗，V-P試驗，耐鹽試驗(7.5％NaCl)，不同溫度試驗(10℃、30℃、40℃)。
鑒定結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，菌株KTx為乳桿菌屬。進(jìn)一步采用Biolog全自動微生物鑒定儀分析鑒定，表明，菌株KTx為Lactobacillus casei，即干酪乳桿菌。該菌株已于2006年06月23日保藏于中國微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號)，保藏號為CGMCC №.1739。在MRS培養(yǎng)基上，干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx的菌落為乳白色或微帶黃色，略有凸起。個體形態(tài)為不規(guī)則G+無芽孢桿菌，呈現(xiàn)桿狀。
表1.菌株KTx屬的鑒定指標(biāo)與鑒定結(jié)果

注“+”表示反應(yīng)陽性，“-”表示反應(yīng)陰性。
實施例2、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx的發(fā)酵條件的優(yōu)化以及發(fā)酵獲得的膽鹽水解酶的檢測一、干酪乳桿菌(Lac tobacillus casei)KTx的發(fā)酵條件的優(yōu)化1、基本培養(yǎng)基的選擇將干酪乳桿菌KTx CGMCC №.1739采用2％(V/V)的接種量，分別接種在MRS液體培養(yǎng)基，改良MRS液體培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基加質(zhì)量含量為3～4‰玉米漿和質(zhì)量含量為0.3～0.4‰的半胱氨酸鹽酸鹽)，MRS肉湯培養(yǎng)基(MRS-broth液體培養(yǎng)基)(胰蛋白胨5g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，葡萄糖10g，檸檬酸三銨1g，乙酸鈉2.5g，吐溫800 .5mL，Na2HPO41g，MnSO40.025g，MgSO4·7H2O0.05g，蒸餾水500mL)，在37℃下培養(yǎng)12h后，測其生長量以及產(chǎn)膽鹽水解酶的量，產(chǎn)膽鹽水解酶的量按照下述膽鹽水解酶的提取和檢測方法測量。
膽鹽水解酶的提取和檢測方法將干酪乳桿菌KTx CGMCC №.1739的發(fā)酵液在4℃下冷凍離心收集沉淀；用無菌生理鹽水洗滌菌體沉淀，10000rpm(10750g)離心，收集菌體沉淀；加入到0.1mol/L pH6.5磷酸緩沖液，菌液濃度調(diào)到A600nm為1；菌體懸浮液在冰浴中進(jìn)行超聲波破碎，500w，3min/5ml，收集粗酶液。將0.1ml粗酶液加入1.8ml的磷酸鈉緩沖液(pH6.0)和0.1ml的結(jié)合膽鹽(6mmol/L?；悄懰徕c)，振蕩1min混勻，混合物在37℃培養(yǎng)30min加入三氯乙酸中止反應(yīng)(0.5ml反應(yīng)液/0.5ml的三氯乙酸)，然后4℃，10000rpm離心10min。取反應(yīng)上清液1ml，加入1ml pH5.4，2mol/L醋酸緩沖液和1ml茚三酮顯色液，混勻后在100℃沸水浴中加熱15min，冷卻，室溫放置5min后，加入3ml 60％乙醇稀釋，搖勻后測定A570nm，生成的顏色在60min內(nèi)穩(wěn)定。每分鐘生成1mmol的氨基酸定義為一個酶活力單位。
結(jié)果表明，MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)的干酪乳桿菌KTx，其生長量最大，產(chǎn)膽鹽水解酶的量最大，表明MRS肉湯培養(yǎng)基(MRS-broth液體培養(yǎng)基)為最適宜生產(chǎn)膽鹽水解酶的基本培養(yǎng)基。
2、pH值的優(yōu)選以MRS肉湯培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別以pH值為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0或7.0為初始pH值，按照接種量2％(1.0×105cfu/ml培養(yǎng)基)的量接種干酪乳桿菌KTx，在37℃下培養(yǎng)12小時后，按照步驟1所述的方法提取膽鹽水解酶，并檢測膽鹽水解酶的活力，結(jié)果表明當(dāng)初始pH為6.0時，培養(yǎng)干酪乳桿菌KTx獲得的膽鹽水解酶的活力最高。
3、溫度條件的優(yōu)選以MRS肉湯培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，初始pH值為6.0，接種量為2.0％(1.0×105cfu/ml培養(yǎng)基)分別以發(fā)酵溫度為42℃、37℃、35℃、30℃或25℃培養(yǎng)干酪乳桿菌KTx，培養(yǎng)12小時后，按照步驟1所述的方法提取膽鹽水解酶，并檢測膽鹽水解酶的活力，結(jié)果表明當(dāng)發(fā)酵溫度為37℃時，培養(yǎng)干酪乳桿菌KTx獲得的膽鹽水解酶的活力最高。
4、接種量的優(yōu)選以MRS肉湯培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，初始pH值為6.0，接種量分別為0.5％(2.5×104cfu/ml發(fā)酵液)、1.0％(5.0×104cfu/ml發(fā)酵液)、2.0％(1.0×105cfu/ml發(fā)酵液)、3.0％(1.5×105cfu/ml發(fā)酵液)或4.0％(2.0×105cfu/ml發(fā)酵液)，在37℃培養(yǎng)干酪乳桿菌KTx，12小時后，按照步驟1所述的方法提取膽鹽水解酶，并檢測膽鹽水解酶的活力，結(jié)果表明接種量為2％時，膽鹽水解酶的活力最高，說明2％為最適接種量。
通過上述步驟1、2和3的試驗，確定了最佳的培養(yǎng)溫度37℃、培養(yǎng)基的初始pH值6.0和接種量2.0％。
5、培養(yǎng)基成分的確定分別對比不同種類的碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、蜜二糖、果糖、纖維二糖、棉籽糖和山梨醇)、氮源(大豆蛋白胨、普通蛋白胨、聚蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨)、表面活性劑(吐溫80、吐溫20和聚乙二醇)對膽鹽水解酶活力的影響，確定最佳培養(yǎng)基成分。實驗結(jié)果表明最佳的碳源、氮源、表面活性劑分別為葡萄糖、大豆蛋白胨、吐溫80。
根據(jù)上述培養(yǎng)基成分選擇的結(jié)果，以葡萄糖添加量、大豆蛋白胨添加量、培養(yǎng)溫度和接種量為因素，設(shè)計四元四次正交實驗(表2)，其它的因素(培養(yǎng)條件)根據(jù)上述實驗得到的結(jié)論設(shè)置。按照表2的因素實驗發(fā)酵得到的發(fā)酵液，按照步驟1所述的方法檢測按照步驟1所述的方法提取膽鹽水解酶粗酶液，檢測膽鹽水解酶的活力。
表2.四元四次正交設(shè)計因素水平表

結(jié)果表明，干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx接種于培養(yǎng)基為1L中含有葡萄糖添加量2％、大豆蛋白胨添加量3％、MnSO40.025％、牛肉膏1.00％、酵母膏0.5％、吐溫80 0.10％、磷酸氫二鉀0.20％、乙酸鈉0.50％、檸檬酸銨0.20％、硫酸鎂0.058％，培養(yǎng)溫度37℃，接種量2％，初始pH值為6.0，培養(yǎng)12小時的條件下的發(fā)酵液(109cfu/ml發(fā)酵液)酶活最高，膽鹽水解酶的酶活力為8.85U/2×107cfu，是優(yōu)化前(MRS培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)12小時，接種量2％(1.0×105cfu/ml培養(yǎng)基)，培養(yǎng)結(jié)束，膽鹽水解酶活力達(dá)到0.66U/2×107cfu)的13.4倍。
將在上述最優(yōu)培養(yǎng)條件下得到的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx發(fā)酵液，按照步驟1的方法提取得到粗酶液，將得到的粗酶液中加入固體硫酸銨，使其飽和度分別達(dá)到10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，每加完一次硫酸銨后，將粗酶液于冰箱內(nèi)放置24h，然后于10000rpm，離心20min，將每次的沉淀離心分別收集，用約2倍體積的50mmol/L，pH6.5的磷酸鈉緩沖液溶解后，裝入透析袋中，于相同的緩沖液中透析至透析液經(jīng)BaCl2無沉淀為止(每隔12h換一次緩沖液至透析完全)，分別測定酶活力與蛋白濃度，計算比活力(U/mg)，結(jié)果表明，70％硫酸銨分離沉淀效果最佳，上清液中的蛋白含量最少，說明70％的飽和硫酸銨能最大程度沉淀蛋白，合并比活力高的部分，并用聚乙二醇20000吸取透析帶內(nèi)的水分，達(dá)到樣品濃縮1～2倍，做進(jìn)一步純化；然后采用陰離子層析柱進(jìn)行純化，所述凝膠層析法的分離條件為以DEAE-Sepharose Fast Flow為凝膠填料，加樣0.5mL，0.05mol/L NaCl作為洗脫劑，以1mL/min的流速洗脫，收集280nm吸收峰處樣品，得到干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx的膽鹽水解酶的純品，采用SDS-PAGE電泳檢測純度。經(jīng)檢測膽鹽水解酶的電泳圖譜為一條帶，分子量為30kDa。比活力可達(dá)到1259.84(U/mg)，純度是原粗酶液的17倍。
二、膽鹽水解酶特性研究(1)酶的最佳反應(yīng)pH按照步驟一中的步驟1的方法測步驟一純化獲得的粗酶液的酶活，其中，將粗酶液稀釋后，分別取1ml加在不同pH(pH 4.0～8.0)的緩沖液中，37℃保溫30min。結(jié)果如圖1所示，表明BSH的最適pH為6.0，反應(yīng)條件為偏酸性。說明了酶的最適反應(yīng)pH值和產(chǎn)酶的最適pH值相一致。
(2)酶的最適反應(yīng)溫度的測定按照步驟一中的步驟1的方法測定步驟一純化獲得的粗酶液在不同反應(yīng)溫度下的酶活。其中，將粗酶液稀釋后，分別取1ml加入到提前置于10℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃的水浴中預(yù)熱10min的磷酸緩沖液、結(jié)合膽鹽混合液中，保溫30min，即使酶反應(yīng)溫度分別為10℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，測定酶活。結(jié)果如圖2所示，表明酶的最適反應(yīng)溫度為30～40℃。
(3)最適底物濃度的測定按照步驟一中的步驟1的方法測步驟一純化獲得的粗酶液的酶活。將底物?；悄懰徕c配制成濃度分別為4mmol/L，5mmol/L，6mmol/L，7mmol/L，8mmol/L的溶液，然后每管加入1ml經(jīng)稀釋后的步驟一純化獲得的粗酶液，37℃保溫30min，反應(yīng)結(jié)束后測酶活。結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明干酪乳桿菌KTx發(fā)酵產(chǎn)生的膽鹽水解酶的最適底物濃度為6mmol/L。
(4)化學(xué)抑制劑對酶活性的影響按照步驟一中的步驟1的方法測步驟一純化獲得的膽鹽水解酶粗酶液的酶活。在底物中分別加入0.5％EDTA、1％SDS、4mol/L尿素，每管加入經(jīng)過稀釋的粗酶液1ml，以不加化學(xué)試劑的反應(yīng)體系為對照，于37℃水浴保溫30min，測定酶活。結(jié)果如表3所示，EDTA和SDS對干酪乳桿菌KTx發(fā)酵產(chǎn)生的膽鹽水解酶的影響不大，而尿素的加入，完全抑制了干酪乳桿菌KTx發(fā)酵產(chǎn)生的膽鹽水解酶的酶活。
表3.不同抑制劑對酶活的影響

(5)金屬離子對酶活的影響按照步驟一中的步驟1的方法測步驟一純化獲得的膽鹽水解酶粗酶液的酶活。將Cu2+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、AL3+、Zn2+、Mn2+均以30mmol/L的濃度添加到反應(yīng)體系(含1ml稀釋的粗酶液)中，其他反應(yīng)條件不變，以不加金屬離子的反應(yīng)液為對照，測酶活。結(jié)果如表4所示。
表4.不同激活劑對酶活的影響

(6)動力學(xué)常數(shù)的測定按照步驟一中的步驟1的方法測步驟一純化獲得的膽鹽水解酶粗酶液的酶活。在不同底物濃度(表5所示)的反應(yīng)體系中，37℃反應(yīng)5min，測定A570nm，以計算酶反應(yīng)的初速度，1/V對1/[S](1/V是縱軸)作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，外推至與橫軸相交，橫軸截距(-X)即為1/Km值。用Michaelie-Menten方程(米氏方程)可以確定酶反應(yīng)速度和底物濃度之間的定量關(guān)系，并滿足雙曲線的特征[汪家政、范明主編.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊.科學(xué)出版社.200.4]。
測得的數(shù)據(jù)如表5所示，根據(jù)表5作圖，結(jié)果如圖4所示，由圖4結(jié)合米氏方程，計算得到膽鹽水解酶在本試驗條件下的動力學(xué)常數(shù)Km為4.57mmol/L。
表5.Km值的測定

權(quán)利要求
1.干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx CGMCC №.1739。
2.一種膽鹽水解酶，是發(fā)酵權(quán)利要求1所述的干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)KTx CGMCC №.1739得到的產(chǎn)物。
3.一種生產(chǎn)膽鹽水解酶的方法，包括下述步驟1)發(fā)酵干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx CGMCC №.1739，收集菌體；2)破碎菌體，收集蛋白，得到膽鹽水解酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟1)中發(fā)酵干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx CGMCC №.1739的培養(yǎng)基的碳源和氮源分別為葡萄糖和大豆蛋白胨。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基為1L中含有葡萄糖2％～4％，大豆蛋白胨0.5％～3％，MnSO40.025％，牛肉膏1.00％、酵母膏0.5％、吐溫80 0.10％，磷酸氫二鉀0.20％，乙酸鈉0.50％，檸檬酸銨0.20％，硫酸鎂0.058％的培養(yǎng)基；所述百分含量均為質(zhì)量百分含量。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基為1L中含有葡萄糖2％、大豆蛋白胨3％、MnSO40.025％、牛肉膏1.00％、酵母膏0.5％、吐溫80 0.10％、磷酸氫二鉀0.20％、乙酸鈉0.50％、檸檬酸銨0.20％、硫酸鎂0.058％的培養(yǎng)基；所述百分含量均為質(zhì)量百分含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟1)中發(fā)酵干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx CGMCC №.1739的發(fā)酵溫度為30～37℃，發(fā)酵時間為10～12h，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為5.0～7.0。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵時間為12h、發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為6.0。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述方法中，還包括將步驟2)獲得的膽鹽水解酶采用陰離子層析法純化，得到純化的膽鹽水解酶；所述分離條件為以DEAE-Sepharose Fast Flow為凝膠填料，0.05mol/L NaCl作為洗脫劑，收集280nm吸收峰處樣品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乳酸菌膽鹽水解酶及其生產(chǎn)方法與專用生產(chǎn)菌株。該膽鹽水解酶，是發(fā)酵其專用生產(chǎn)菌株－干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx CGMCC№.1739得到的。該生產(chǎn)膽鹽水解酶的方法，包括下述步驟1)發(fā)酵干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx CGMCC№.1739，收集菌體；2)將步驟1)得到的菌體用磷酸緩沖液懸浮，在冰浴中進(jìn)行超聲波破碎，收集得到粗酶液，用硫酸銨沉淀蛋白后，離心收集得到膽鹽水解酶。本發(fā)明的生產(chǎn)膽鹽水解酶的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx，發(fā)酵可產(chǎn)生大量的膽鹽水解酶，由該菌株生產(chǎn)的膽鹽水解酶具有很高的活性。
文檔編號C12N9/14GK1908158SQ20061011269
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月30日
發(fā)明者李平蘭, 王玉文, 王延祥, 周偉, 劉慧 , 李偉欣, 靳志強(qiáng) 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)