專(zhuān)利名稱(chēng)：：兩種酵母菌膽鹽水解酶提取方法與功能性牛奶酒生產(chǎn)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及兩種酵母菌膽鹽水解酶(BileSaltHydrolase，BSH)的提取方法與功能性牛奶酒的生產(chǎn)技術(shù)，適用于發(fā)酵乳制品中功能性牛奶酒和酸牛奶酒的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
：益生菌(Probiotics)是指一類(lèi)通過(guò)腸道定殖作用改善宿主特定部位微生態(tài)平衡并兼有若干其他有益生理功能的微生物。它們通過(guò)改善腸道微生物生態(tài)平衡，控制腸道感染，降低血清膽固醇水平，提高乳糖不耐癥人對(duì)乳糖的利用，并能刺激特異性或非特異性免疫反應(yīng)，具有免疫增強(qiáng)的作用。益生菌制品的活菌應(yīng)該代謝穩(wěn)定，活性較強(qiáng)，通過(guò)消化道后大量存活，進(jìn)入腸道后發(fā)揮益生菌作用。目前用于生產(chǎn)益生菌劑的優(yōu)良菌種有雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、酵母屬、克魯維酵母屬等。早在1963年人們就證實(shí)攝取含有某種乳桿菌或者雙歧桿菌發(fā)酵的酸奶具有降低血清膽固醇的含量。迄今，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)于乳酸菌降低膽固醇的作用機(jī)理尚存在不同觀點(diǎn)，主要集中于以下三點(diǎn)(l)乳酸菌菌體細(xì)胞直接吸收同化膽固醇；(2)乳酸菌的膽鹽水解酶活性使結(jié)合態(tài)膽鹽降解為游離態(tài)膽鹽，后者溶解度下降與膽固醇發(fā)生共同沉淀作用；(3)其他理論，如吸收同化與共沉淀聯(lián)合作用。膽鹽水解酶(BSH)是乳酸菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。Klaver等利用多株乳桿菌和雙歧桿菌進(jìn)行的降膽固醇研究證實(shí)乳酸菌產(chǎn)生的膽鹽水解酶能在人體肝腸循環(huán)中將結(jié)合態(tài)膽鹽降解產(chǎn)生氨基酸與溶解度較低的游離態(tài)膽鹽。后者能與膽固醇結(jié)合形成沉淀復(fù)合物而排出體外，從而降低血清總膽固醇的含量。酵母菌包括乳糖發(fā)酵性和乳糖非發(fā)酵性二類(lèi)。乳糖發(fā)酵性酵母有克魯維酵母屬(如馬克斯克魯維酵母、脆壁克魯維酵母、乳酸克魯維酵母、保加利亞克魯維酵母)、假絲酵母屬(如乳酒假絲酵母)和酒香酵母屬等，它們能產(chǎn)生P-半乳糖苷酶，在乳中生長(zhǎng)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)生乙醇和C02，是制作乳酒的良好菌種。有關(guān)酵母菌的益生性也有文獻(xiàn)報(bào)道。酵母菌作為益生菌的應(yīng)用起源于飼料，如Sacc/2aramyc"Zow/aW/z'被用于不同類(lèi)型痢疾的治療。Psomas等(2003年)研究了&"/^0^^60"^必具有降低膽固醇的功能。也有啤酒酵母拮抗大腸桿菌、志賀氏菌、沙門(mén)氏菌等腸道病原菌生長(zhǎng)的報(bào)道。啤酒酵母能夠通過(guò)腸道存活，進(jìn)一步說(shuō)明了它被作為益生菌的可能性。Submmanian等(1983年)研究了應(yīng)用嗜酸乳桿菌和乳糖發(fā)酵性酵母——馬克斯克魯維酵母和Om^Vfe戸ei^Wra;7/c^fc共生發(fā)酵生產(chǎn)嗜酸酵母乳產(chǎn)品，發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)受酵母菌存在的刺激。利用酵母菌在生長(zhǎng)過(guò)程中的呼吸作用，以生物法耗氧，創(chuàng)造一個(gè)適合于嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)繁殖、產(chǎn)酸代謝的厭氧環(huán)境。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)關(guān)于馬克斯克魯維酵母菌具有高效降低膽固醇及高產(chǎn)膽鹽水解酶的相關(guān)文章報(bào)道和專(zhuān)利報(bào)道。而關(guān)于馬克斯克魯維酵母菌膽鹽水解酶的提取方法及利用降膽固醇的酵母菌應(yīng)用于功能性牛奶酒生產(chǎn)亦未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道和專(zhuān)利報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供兩種具有高效降膽固醇及高產(chǎn)膽鹽水解酶的酵母菌。本發(fā)明所提供的酵母菌是馬克斯克魯維酵母(尺/^yveram^"mam'""—Kl和M3菌株。已于2006年9月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC)。保藏號(hào)分別為CGMCCW2l812(菌株Kl)，CGMCC地1811(菌株M3)。馬克斯克魯維酵母(《/w^yveram;;cMwao:&"M"Kl和M3分離篩選自吉林省白城市普通家庭的藏靈菇(又稱(chēng)開(kāi)菲爾粒)。在含有抗生素的馬鈴薯乳糖(PDA)選擇性培養(yǎng)基上馬克斯克魯維酵母(《/w;n;erawycesmw:dww力Kl和M3菌落大小為34mm，表面光滑，邊緣整齊，呈圓形，有光澤，微隆起，乳白色，不透明；個(gè)體形態(tài)呈卵圓形或短橢圓形(K1菌株)、長(zhǎng)橢圓形或圓柱形(M3菌株)，不形成假菌絲；無(wú)性繁殖為多邊芽殖，在馬鈴薯乳糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)出芽高，有性繁殖形成子囊孢子；有很強(qiáng)的發(fā)酵能力，能產(chǎn)生P-半乳糖苷酶，在牛奶中發(fā)酵乳糖產(chǎn)乙醇量可達(dá)3.0°/。(m/m)以上。上述方法得到馬克斯克魯維酵母K1和M3菌株具有高效降低膽固醇及高產(chǎn)膽鹽水解酶屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供兩種酵母菌膽鹽水解酶及其提取方法。本發(fā)明所提供酵母菌膽鹽水解酶的提取方法是由馬克斯克魯維酵母C^/wyveram，ycasmwx/a"^)Kl和M3菌株得到的膽鹽水解酶。(1)馬克斯克魯維酵母發(fā)酵液以10000r/min，4'C離心10min，收集沉淀菌泥；(2)用生理鹽水離心洗滌菌體沉淀2次(條件同上)；(3)加入去離子水至發(fā)酵液原體積，充分混合，冰浴冷卻30min后，細(xì)胞懸浮液于冰浴中進(jìn)行超聲波破碎16min(功率800850w，工作3s，間歇3s);(4)單染色鏡檢細(xì)胞破碎率達(dá)到80%以上，以10000r/min，4。C離心10min除去細(xì)胞碎片，收集膽鹽水解酶的粗酶液。上述方法得到酵母菌膽鹽水解酶及其專(zhuān)用生產(chǎn)菌株與超聲波破碎酵母細(xì)胞的提取方法也屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供兩種酵母菌制備功能性牛奶酒生產(chǎn)技術(shù)。本發(fā)明所提供制備功能性牛奶酒的方法是由高產(chǎn)膽鹽水解酶和發(fā)酵乳糖高產(chǎn)乙醇的馬克斯克魯維酵母(A7wjvera附3;c^mam'am^)Kl和M3酵母菌制得。所述方法中，用于制備功能性牛奶酒的發(fā)酵工藝條件是主發(fā)酵技術(shù)參數(shù)菌株Kl禾flM3接種比例為1:1，總接種量為4%8%，蔗糖添加量為5%6%(w/v);發(fā)酵溫度2830'C，發(fā)酵時(shí)間2422h，靜置或攪拌有氧發(fā)酵；后發(fā)酵技術(shù)參數(shù)發(fā)酵溫度4"C，發(fā)酵時(shí)間2448h，靜置發(fā)酵。所述方法中制備功能性牛奶酒的最佳發(fā)酵工藝條件為主發(fā)酵技術(shù)參數(shù)菌株K1和M3接種比例為1:1，總接種量為8%，蔗糖添加量為5%6%(w/v);發(fā)酵溫度2830°C，發(fā)酵時(shí)間2422h，靜置發(fā)酵；后發(fā)酵技術(shù)參數(shù)發(fā)酵溫度f(wàn)C，發(fā)酵時(shí)間48h，靜置發(fā)酵。在此優(yōu)化發(fā)酵條件下，成品牛奶酒爽口醇正，有濃郁的醇香和酯香味，酒精含量可達(dá)3。/。(m/m)左右，酸甜度適中，口感細(xì)膩、殺口，苦味和澀味不明顯；質(zhì)地不分層也不絮凝，呈均勻一致的起泡性乳濁液。在63'Cx30min或72°Cxl5min熱處理?xiàng)l件下進(jìn)行巴氏殺菌，牛奶酒未出現(xiàn)乳清分離和沉淀現(xiàn)象。其風(fēng)味和感官狀態(tài)未發(fā)生變化?？衫卯a(chǎn)膽鹽水解酶和發(fā)酵乳糖產(chǎn)乙醇能力較強(qiáng)的酵母菌株大規(guī)模生產(chǎn)功能性牛奶酒。上述方法得到功能性牛奶酒產(chǎn)品及其專(zhuān)用生產(chǎn)菌株也屬本發(fā)明保護(hù)范圍。應(yīng)用馬克斯克魯維酵母(K/""e/WMjc"wflm'朋"s)Kl和M3制備功能性牛奶酒工藝流程圖說(shuō)明如下(1)原料乳制作牛奶酒的原料乳要求菌數(shù)一般低于10A個(gè)/mL，不含抗生素和消毒藥，不宜選用患乳房炎乳。(2)凈化以離心機(jī)除去牛乳中的白細(xì)胞和其他肉眼可見(jiàn)的雜質(zhì)。(3)標(biāo)準(zhǔn)化原料乳的主要成分指標(biāo)應(yīng)符合食品衛(wèi)生國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5408-85。其總干物質(zhì)應(yīng)不低于11.5%，脂肪含量根據(jù)產(chǎn)品不同大體調(diào)整為4種3.2%、2.5%、1.0%和<0.1%，可通過(guò)脫除奶油或添加1%3%的脫脂奶粉或稀奶油以調(diào)整總干物質(zhì)或脂肪含量。(4)預(yù)熱、配料和過(guò)濾將原料乳加熱至607(TC，加入5。/。(w/v)的蔗糖，溶解后過(guò)濾除雜。(5)均質(zhì)在均質(zhì)機(jī)中于1315MPa壓力下對(duì)預(yù)熱的原料乳進(jìn)行均質(zhì)處理。目的是使牛乳質(zhì)地更加細(xì)膩、平滑，亦可使脂肪球變小而防止脂肪上浮。(6)殺菌將原料乳加熱至9095。C，保溫510min。(7)冷卻經(jīng)殺菌后的原料乳迅速冷卻至30°C，待接種。(8)接種酵母菌加入單一工作發(fā)酵劑的總接種量為8%，馬克斯克魯維酵母K1和M3的單一發(fā)酵劑的接種比例為1:1。(9)保溫主發(fā)酵于發(fā)酵罐中保溫283(TC靜置發(fā)酵2422h。(10)后發(fā)酵將發(fā)酵乳下酒至貯酒罐中，4'C靜置厭氧后發(fā)酵48h;或在發(fā)酵罐中直接降溫至4'C，靜置厭氧后發(fā)酵48h。(11)罐裝與巴氏殺菌將發(fā)酵乳罐裝于瓶中，壓蓋后，于63'C保溫殺菌30min(為保持牛奶酒的生物活性可省去加熱殺菌)，冷卻后即為成品。馬克斯克魯維酵母(《/wyveraw少c"warx/am^)Kl和M3分離篩選于東北普通家庭的藏靈菇(又稱(chēng)開(kāi)菲爾粒)，具有可靠的安全性。用此兩種酵母菌株生產(chǎn)的功能性牛奶酒爽口醇正，有濃郁的醇香和酯香味，酒精度和酸甜度適中，殺口，苦味和澀味不明顯；質(zhì)地不分層也不絮凝，呈均勻一致的起泡性乳濁液。本發(fā)明提取膽鹽水解酶和制作功能性牛奶酒的原料來(lái)源方便，發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，發(fā)酵周期較短，操作簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求低，成本較低，適于工業(yè)化生產(chǎn)。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為體積百分含量。實(shí)施例1、高效降膽固醇及高產(chǎn)膽鹽水解酶的馬克斯克魯維酵母(ii:/i^veramw"m^c/am^)Kl和M3菌株的篩選與鑒定1、高效降膽固醇及高產(chǎn)膽鹽水解酶菌株的篩選取藏靈菇濾液5mL注入帶玻璃珠的45rnL無(wú)菌生理鹽水中，充分振蕩30min，制成菌懸液，而后10倍梯度稀釋成10—410'6的稀釋菌液。以稀釋傾注法接種平板，倒入含抗生素的馬鈴薯乳糖選擇性培養(yǎng)基，28'C培養(yǎng)23d。根據(jù)酵母菌的菌落特征和水浸片鏡檢結(jié)果，將上述平皿目的菌落分別劃線接種于相應(yīng)斜面培養(yǎng)基上，28。C培養(yǎng)23d。轉(zhuǎn)接種于馬鈴薯乳糖液體培養(yǎng)基中，28°。增菌培養(yǎng)23代，再以1%2%接種量分別轉(zhuǎn)接入含膽固醇的I號(hào)培養(yǎng)基與含膽固醇和2%乳糖的1號(hào)培養(yǎng)基中，28'C培養(yǎng)20h后，以鄰苯二甲醛比色法測(cè)定I號(hào)培養(yǎng)基中發(fā)酵前后膽固醇的含量，并計(jì)算膽固醇降低率(％)。根據(jù)膽固醇降低率確定高效降膽固醇的菌株。具體測(cè)定方法將培養(yǎng)前后的10mL發(fā)酵液以10000r/min離心10min，分別取0.4mL離心上清液于比色管中，加入0.2mL鄰苯二甲醛(lmg/mL)和4mL混合酸(冰醋酸、濃硫酸等量混合)，充分混合后室溫靜置10min，以不含膽固醇的I號(hào)培養(yǎng)基為空白調(diào)O，于550nm測(cè)定吸光值(A)，在膽固醇-吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得發(fā)酵前后膽固醇的含量(結(jié)果見(jiàn)表1)。表l不同酵母菌株降低膽固醇的初篩試驗(yàn)結(jié)果菌株代號(hào)I號(hào)培養(yǎng)基-膽固醇吸光值(A550nJ發(fā)酵前發(fā)酵后-膽固醇的降低率(％)Kl無(wú)乳糖0.1180.03570.34Kl有乳糖0.1130.03668.14M3無(wú)乳糖0.1180.02380.51M3有乳糖0.1130細(xì)99.12注表中數(shù)據(jù)為n=3測(cè)定之平均值。研究表明，Kl和M3菌株在含有乳糖與不含乳糖的I號(hào)培養(yǎng)基中降低膽固醇能力有所不同。Kl菌株在無(wú)乳糖的I號(hào)培養(yǎng)基比有乳糖的降低膽固醇的百分率相對(duì)較高；相反，M3菌株在有乳糖的I號(hào)培養(yǎng)基比無(wú)乳糖的降低膽固醇的百分率相對(duì)較高。初篩試驗(yàn)總體比較，M3菌株比K1菌株降低膽固醇能力較強(qiáng)。將初篩后獲得的具有降膽固醇的菌株，在含0.1%膽固醇和0.3%牛黃膽酸鈉的馬鈴薯乳糖培養(yǎng)基平板上(分別以含0.1%膽固醇的馬鈴薯乳糖培養(yǎng)基、含0.3%牛黃膽酸鈉的馬鈴薯乳糖培養(yǎng)基作為對(duì)照)，對(duì)稱(chēng)放置牛津杯，加入O.lmL馬鈴薯乳糖培養(yǎng)菌液，于28"C厭氧培養(yǎng)3d后，再經(jīng)4"C冷藏7d，分別測(cè)定牛津杯周?chē)囵B(yǎng)基內(nèi)沉淀圈的大小，其結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)沉淀圈的大小初步確定菌株是否產(chǎn)生膽鹽水解酶及其活力和產(chǎn)量的高低。將產(chǎn)膽鹽水解酶的菌株劃線接種于馬鈴薯乳糖斜面試管，培養(yǎng)后保存?zhèn)溆谩１?產(chǎn)膽鹽水解酶酵母菌株復(fù)篩試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表1和表2結(jié)果顯示，沉淀圈的大小與膽鹽水解酶的活力和降低膽固醇的百分率成正比，而且發(fā)現(xiàn)冷藏溫度下一周內(nèi)沉淀圈會(huì)繼續(xù)擴(kuò)散，說(shuō)明冷藏溫度下酵母菌的膽鹽水解酶活性比適宜生長(zhǎng)溫度條件下要高。復(fù)篩試驗(yàn)總體比較，M3菌株比K1菌株產(chǎn)生的膽鹽水解酶活力較高。高效降低膽固醇的酵母菌株源于其產(chǎn)生多量或高活力的膽鹽水解酶?？衫眠@些高產(chǎn)膽鹽水解酶的酵母菌株進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研制高效降膽固醇的功能性牛奶酒。2、篩選菌株發(fā)酵乳糖高產(chǎn)乙醇的性能鑒定挑取28t:活化23代馬鈴薯乳糖斜面酵母菌培養(yǎng)物1環(huán)轉(zhuǎn)接入10mL滅菌牛乳(帶小倒管)中，28"C培養(yǎng)1921h，觀察小倒管內(nèi)產(chǎn)氣情況。吸取產(chǎn)氣管的培養(yǎng)液以2%接種量移入裝有100mL滅菌牛乳的三角瓶中，283(TC搖床振蕩培養(yǎng)2022h(轉(zhuǎn)速80100r/min)，測(cè)定培養(yǎng)液中的活菌數(shù)，根據(jù)培養(yǎng)期間的產(chǎn)氣情況和風(fēng)味品質(zhì)評(píng)定，保留產(chǎn)氣較快和活菌數(shù)量較多，具有純正發(fā)酵乳香、醇香和酯香的菌株。將三角瓶棉塞更換為無(wú)菌帶有U形玻璃導(dǎo)管的膠塞，并將其開(kāi)口一端浸入水中，于2830。C厭氧培養(yǎng)48h后，測(cè)定發(fā)酵液的乙醇含量和酸度，其結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù)上述測(cè)定指標(biāo)確定發(fā)酵乳糖高產(chǎn)乙醇的發(fā)酵性能優(yōu)良菌株。將篩選高產(chǎn)膽鹽水解酶和發(fā)酵性能優(yōu)良的馬鈴薯乳糖斜面菌株，接種于各種理化鑒定培養(yǎng)基中，28i:培養(yǎng)進(jìn)行鑒定。表3篩選酵母菌株的發(fā)酵性能測(cè)試結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注表中數(shù)據(jù)為n=3測(cè)定之平均值。研究表明，菌株K1和M3均具有良好的發(fā)酵性能。其中K1菌株牛奶發(fā)酵液有乳香，醇香較濃，殺口，酒精度較高；M3菌株牛奶發(fā)酵液有乳香，酯香較濃，較殺口，酒精度較次之?？衫脙芍昃哂懈咝Ы档湍懝檀寄芰腿樘前l(fā)酵性能互補(bǔ)的優(yōu)勢(shì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研制功能性牛奶酒。3、高效降膽固醇及高產(chǎn)膽鹽水解酶和發(fā)酵乳糖高產(chǎn)乙醇的菌株鑒定常規(guī)生理生化試驗(yàn)鑒定糖類(lèi)發(fā)酵試驗(yàn)，碳源同化試驗(yàn)，氮源同化試驗(yàn)。Biolog全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定挑取28'C培養(yǎng)2d的馬鈴薯乳糖平板上的目的單菌落，劃線接種于BUY平板上，2628'C培養(yǎng)2d得到單菌落后，用無(wú)菌超純水接種液調(diào)整菌懸液的濁度至47±2%丁，接種于YT微量鑒定板中，2628。C培養(yǎng)24h、48h、72h后，于鑒定儀上讀取鑒定結(jié)果。鑒定菌株K1和M3為馬克斯克魯維酵母(《/矽veram;;c"wan:/a"w"。其結(jié)果如表4所示。表4菌株K1、M3的鑒定項(xiàng)目與結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注"+"95%以上的菌株為陽(yáng)性；"-"95%以上的菌株為陰性。實(shí)施例2、利用馬克斯克魯維酵母Kl和M3提取膽鹽水解酶1、高產(chǎn)膽鹽水解酶的發(fā)酵工藝條件用于培養(yǎng)馬克斯克魯維酵母Kl和M3高產(chǎn)膽鹽水解酶的培養(yǎng)基成分(w/v):乳糖2%，馬鈴薯20%(馬鈴薯去皮切塊，加水煮沸1020min，用雙層紗布過(guò)濾)，瓊脂1.5%，蒸餾水1000mL，0.07MPa滅菌20min。高產(chǎn)膽鹽水解酶的發(fā)酵工藝條件M3菌株發(fā)酵溫度為32T:，發(fā)酵時(shí)間為24h，培養(yǎng)基的初始pH值為6.0，接種量為1%。Kl菌株發(fā)酵溫度為32'C，發(fā)酵時(shí)間為18h，培養(yǎng)基的初始pH值為6.0，接種量為2%。在此優(yōu)化發(fā)酵條件下，馬克斯克魯維酵母M3的酶活力比優(yōu)化前提高了50%;馬克斯克魯維酵母K1的酶活力比優(yōu)化前提高了36%。2、發(fā)酵液中膽鹽水解酶的提取方法與酶活力測(cè)定(1)膽鹽水解酶的提取方法將在上述發(fā)酵條件下得到的馬克斯克魯維酵母發(fā)酵液以10000r/min，4。C離心10min，棄上清液，菌體用無(wú)菌生理鹽水離心洗滌2次(條件同上)，棄上清液，沉淀的菌體加入去離子水至發(fā)酵液原體積，充分混合，冰浴冷卻30min后，用SY-1000E型超聲波破碎儀(北京宏祥隆公司產(chǎn))冰浴中破碎16min(800900w，工作3s，間歇3s，探頭位于靠近容器邊緣，并以深入液面1.52.0cm為宜，控制細(xì)胞懸浮液溫度為4。C土2。C)，單染色鏡檢計(jì)算細(xì)胞破碎百分率。若細(xì)胞破碎率達(dá)到80%以上，則以10000r/min，4。C離心lOmin，除去細(xì)胞碎片，其上清液即為膽鹽水解酶液。同時(shí)以意大利和英國(guó)兩種高壓細(xì)胞破碎儀的破碎條件作為對(duì)照，比較不同破碎條件下酵母細(xì)胞破碎率及其膽鹽水解酶的活力。其結(jié)果如表5所示。對(duì)照組1:采用英國(guó)15-40-AE-GA型高壓細(xì)胞破碎儀的破碎條件壓力2650Bar，破碎1次。破碎主機(jī)為夾套式冷卻，通入濃度為10%的_4°(:循環(huán)鹽水，樣品出口溫度為1519°C。對(duì)照組2:采用NiroSoavi型意大利高壓細(xì)胞破碎儀的破碎條件壓力1500Bar，常溫下連續(xù)破碎3次。因高壓產(chǎn)生的熱量可使樣品溫度升至7080°C，而導(dǎo)致酶失活，故每次破碎后的樣品用冰浴迅速冷卻。表5馬克斯克魯維酵母Kl在不同條件下的破碎效果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注表中細(xì)胞破碎率為n=10測(cè)定之平均值；氨基酸A為n==3測(cè)定之平均值。由表5可見(jiàn)，采用超聲波破碎條件，其細(xì)胞破碎率為80.96%，氨基酸吸光值A(chǔ)5衡J酶活力)為0.035，與對(duì)照組1的細(xì)胞破碎效果相同，而略高于對(duì)照組2的細(xì)胞破碎效果。說(shuō)明采用適宜的超聲波破碎方法，可解決酵母細(xì)胞壁破碎較難的問(wèn)題，其細(xì)胞破碎效果可與高壓細(xì)胞破碎儀相媲美。(2)酶活力測(cè)定取膽鹽水解酶液O.lmL，加入1.8mL0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0)和0.1mL的結(jié)合膽鹽(6mmol/L牛黃膽酸鈉)，于旋渦混合器上振蕩混勻lmin，將混合液于37。C振蕩酶解40min。酶反應(yīng)完畢，立即加入80%三氯乙酸(加量與酶液等體積)，混勻，中止酶反應(yīng)lmin后離心(條件同上)，上清液即為酶反應(yīng)液。膽鹽水解酶活力的測(cè)定是通過(guò)結(jié)合膽鹽降解后釋放的氨基酸量的多少來(lái)衡量。即該酶活力與氨基酸的生成量成正比?？刹捎密崛@色法測(cè)定氨基酸的含量。取2mL酶反應(yīng)液，加入茚三酮顯色劑lmL，混勻后于沸水浴中加熱16min，自來(lái)水冷卻，加入5mL稀釋液，搖勻，同上操作以2mL蒸餾水替代酶反應(yīng)液作為空白對(duì)照調(diào)0，于570nm測(cè)吸光值A(chǔ)(生成的顏色在60min內(nèi)穩(wěn)定，最好在30min之內(nèi)完成)。膽鹽水解酶于每分鐘生成l^imol的氨基酸定義為一個(gè)酶活力單位。實(shí)施例3、利用高效降膽固醇及高產(chǎn)膽鹽水解酶和發(fā)酵乳糖產(chǎn)乙醇的菌株生產(chǎn)功能性牛奶酒1、酵母菌的酒母制備將馬克斯克魯維酵母(《/矽veram少casmarj'am)Kl、M3原菌株分別于試管斜面(馬鈴薯乳糖培養(yǎng)基)28。C培養(yǎng)活化3648h，再經(jīng)28'C培養(yǎng)24h活化12代，而后取兩環(huán)接種到lOmL滅菌牛乳中，28'C培養(yǎng)至大量氣泡產(chǎn)生時(shí)(高泡期，培養(yǎng)1920h)，再以2%3%的接種量移入200mL原料乳(115"C滅菌15min)中，283(TC搖床振蕩培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速為80100r/min)20h至菌數(shù)達(dá)到(67)X107個(gè)/mL時(shí)，即為酒母。2、功能性牛奶酒生產(chǎn)發(fā)酵條件的優(yōu)化采用兩步發(fā)酵法制備牛奶酒，主要考察發(fā)酵過(guò)程中乳酸乳球菌乳酸亞種(丄actococcws/ac他subsp./ac&)KS4發(fā)酵劑是否應(yīng)添加及何時(shí)添加的問(wèn)題，以及確定主發(fā)酵與后發(fā)酵的最佳發(fā)酵溫度與時(shí)間。如表6所示，在酵母菌總接種量為8%，菌株K1和M3接種比例為1:1，蔗糖添加量為5。/。6。/。(w/v)的前提下，工藝1、工藝2為不添加乳酸球菌發(fā)酵劑；工藝3為主發(fā)酵之前與酒母一同添加1%乳酸球菌發(fā)酵劑；工藝4為主發(fā)酵之后添加2°/。乳酸球菌發(fā)酵劑。工藝5、工藝6、工藝7為在主發(fā)酵相同條件下，分別比較不同后發(fā)酵溫度和時(shí)間；工藝8為只有主發(fā)酵，而無(wú)后發(fā)酵。試驗(yàn)指標(biāo)為酒精度、pH值和感官綜合評(píng)分(總分50，包括色澤5分、滋味和氣味30分、組織狀態(tài)15分)。為了獲得更大活力和優(yōu)良品質(zhì)的功能性牛奶酒，針對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)不同發(fā)酵工藝試驗(yàn)，以感官綜合評(píng)分為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，酒精度、pH值為參考評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定功能性牛奶酒最佳發(fā)酵條件為工藝2和工藝5(見(jiàn)表7)。即主發(fā)酵技術(shù)參數(shù)菌株K1和M3接種比例為1:1，總接種量為8%，蔗糖添加表6牛奶酒不同發(fā)酵工藝設(shè)計(jì)表工藝酵母菌乳酸球菌乳酸球菌主發(fā)酵后發(fā)酵類(lèi)型接種量/%接種量/%添加時(shí)間溫度廠c時(shí)間/h溫度/'C時(shí)間/h180—302222482803022448381主發(fā)酵前30222248482主發(fā)酵后3022224858028244486802824424780_28241648880—2824一—表7功能性牛奶酒不同發(fā)酵工藝指標(biāo)測(cè)定結(jié)果工藝類(lèi)型感官綜合評(píng)分酒精含量(％，m/m)pH值135.755.3835.259246.753.9985.423325.605.6354.664425.954.9155.170546.782.2075.668643.672.1535.869743.222.4925.555822.001.8005.339量為5%6%(w/v);發(fā)酵溫度283(TC，發(fā)酵時(shí)間2422h，靜置發(fā)酵；后發(fā)酵技術(shù)參數(shù)發(fā)酵溫度4"C，發(fā)酵時(shí)間48h，靜置發(fā)酵。在此優(yōu)化發(fā)酵條件下，成品牛奶酒爽口醇正，有濃郁的醇香和酯香味，酒精含量可達(dá)3y。(m/m)左右，酸甜度適中，口感細(xì)膩、殺口，苦味和澀味不明顯；質(zhì)地不分層亦不絮凝，呈均勻一致的起泡性乳濁液。在63"Cx30min或72°Cxl5min熱處理?xiàng)l件下進(jìn)行巴氏殺菌，牛奶酒未出現(xiàn)乳清分離和沉淀現(xiàn)象。其風(fēng)味和感官狀態(tài)未發(fā)生變化。但是，為了保持牛奶酒的生物活性，可省去加熱殺菌?？衫酶咝Ы的懝檀技案弋a(chǎn)膽鹽水解酶和發(fā)酵乳糖產(chǎn)乙醇的酵母菌株大規(guī)模生產(chǎn)功能性牛奶酒。本專(zhuān)利所屬項(xiàng)目北京市教委農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題"開(kāi)菲爾粒的菌種篩選及其在功能性發(fā)酵牛乳中的應(yīng)用研究"項(xiàng)目編號(hào)KF2003-06項(xiàng)目起止時(shí)間2004.01-2006.12項(xiàng)目負(fù)責(zé)人劉慧權(quán)利要求1、兩種酵母菌膽鹽水解酶提取方法與功能性牛奶酒生產(chǎn)技術(shù)，其技術(shù)特征在于從藏靈菇中篩選獲得兩種高產(chǎn)膽鹽水解酶的酵母菌，且它們均具有高效降低膽固醇和良好的發(fā)酵乳糖性能。利用兩種酵母菌提取膽鹽水解酶，并采用適宜的超聲波破碎酵母細(xì)胞的提取方法，解決了酵母細(xì)胞壁破碎較難問(wèn)題。利用具有高效降膽固醇及高產(chǎn)膽鹽水解酶和發(fā)酵乳糖高產(chǎn)乙醇的兩種酵母菌制得品質(zhì)優(yōu)良的牛奶酒具有降低膽固醇的功能。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的用于生產(chǎn)功能性牛奶酒的兩種具有高效降低膽固醇及高產(chǎn)膽鹽水解酶的酵母菌屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。這兩種酵母菌的分類(lèi)命名是菌株Kl為馬克斯克魯維酵母(ii:/Myverawj^asw"rx^m^)(CGMCCJNM812)，菌株M3為馬克斯克魯維酵母(《/wyvera附;^^wan^m^)(CGMCCW2I8U)。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用兩種酵母菌提取的膽鹽水解酶及其專(zhuān)用生產(chǎn)菌株與超聲波破碎酵母細(xì)胞的提取方法也屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。膽鹽水解酶提取方法馬克斯克魯維酵母發(fā)酵液以10000r/min，4'C離心10min，收集沉淀菌泥；用生理鹽水離心洗滌菌體沉淀2次(條件同上)；加入去離子水至發(fā)酵液原體積，充分混合，冰浴冷卻30min后，細(xì)胞懸浮液于冰浴中進(jìn)行超聲波破碎16min(功率800850w，工作3s，間歇3s);單染色鏡檢細(xì)胞破碎率達(dá)到80%以上，以10000r/min，4。C離心10min除去細(xì)胞碎片，收集膽鹽水解酶的粗酶液。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的利用兩種具有高效降低膽固醇及高產(chǎn)膽鹽水解酶和發(fā)酵乳糖高產(chǎn)乙醇的酵母菌制備品質(zhì)優(yōu)良的功能性牛奶酒的最佳發(fā)酵工藝條件及其產(chǎn)品與專(zhuān)用生產(chǎn)菌株也屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。即利用馬克斯克魯維酵母(K/zon^rawycasmwx/am^)K1和M3兩種酵母菌制備功能性牛奶酒的最佳發(fā)酵工藝條件為主發(fā)酵技術(shù)參數(shù)菌株K1和M3接種比例為1:1，總接種量為8%，蔗糖添加量為5。/。(w/v);發(fā)酵溫度30'C，發(fā)酵時(shí)間22h，靜置發(fā)酵；后發(fā)酵技術(shù)參數(shù)發(fā)酵溫度4。C，后發(fā)酵時(shí)間48h，靜置發(fā)酵。全文摘要本發(fā)明名稱(chēng)為兩種酵母菌膽鹽水解酶(BSH)提取方法與功能性牛奶酒生產(chǎn)技術(shù)，適用于發(fā)酵乳制品中功能性牛奶酒和酸牛奶酒的生產(chǎn)。本發(fā)明采用高通量篩選技術(shù)和鄰苯二甲醛法獲得高效降低膽固醇和發(fā)酵乳糖能力較高的兩種酵母菌，牛津杯法復(fù)篩得到高產(chǎn)BSH的菌株。本發(fā)明優(yōu)化兩種酵母菌產(chǎn)BSH發(fā)酵條件和提取方法，并采用適宜的超聲波破碎方法，解決了酵母細(xì)胞壁破碎較難問(wèn)題，其破碎效果可與高壓細(xì)胞破碎儀媲美。利用具有高效降膽固醇及高產(chǎn)BSH和發(fā)酵乳糖高產(chǎn)乙醇的馬克斯克魯維酵母K1(CGMCC№1812)和M3(CGMCC№1811)制得品質(zhì)優(yōu)良的牛奶酒，具有降膽固醇的功能。本發(fā)明制作功能性牛奶酒的發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，發(fā)酵周期較短，成本較低，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號(hào)C12N1/16GK101333518SQ20071012310公開(kāi)日2008年12月31日申請(qǐng)日期2007年6月28日優(yōu)先權(quán)日2007年6月28日發(fā)明者慧劉申請(qǐng)人:北京農(nóng)學(xué)院