一種發(fā)酵唾液乳酸桿菌提取膽鹽水解酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種唾液乳酸桿菌中膽鹽水解酶(BSH)的提取方法，適用于功能性乳制品中以BSH作為功能因子，開發(fā)生產(chǎn)新型的功能食品。包括以下步驟：利用產(chǎn)BSH的唾液乳酸桿菌(LactobacillussalivariusLMG14476)，通過優(yōu)化發(fā)酵條件和提取方法得到乳酸菌膽鹽水解酶。采用適宜的超聲波細胞破碎提取方法，解決了胞內(nèi)膽鹽水解酶較難提取的問題，提高了BSH的提取率。本發(fā)明制得BSH的發(fā)酵工藝與提取方法簡單，發(fā)酵周期較短，對設備要求低，成本較低，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】—種發(fā)酵唾液乳酸桿菌提取膽鹽水解酶的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明公開了一項利用超聲波進行細胞破壁結(jié)合硫酸銨沉淀提取唾液乳酸桿菌中膽鹽水解酶的方法，所得BSH制品適用于在功能性乳制品中作為功能因子，開發(fā)生產(chǎn)新型的功能食品。
【背景技術】
[0002]血清中高膽固醇含量是誘發(fā)高血壓、冠心病等心血管疾病的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，不同種類的益生菌都具有降低膽固醇的作用，這種作用與其所產(chǎn)生的膽鹽水解酶(Bilesalt hydrolase, BSH, EC 3.5.1.24)密切相關。
[0003]BSH酶廣泛存在于腸道微生物中，在其它環(huán)境的微生物中較少被發(fā)現(xiàn)。目前，很多BSHs酶已經(jīng)從多種微生物中得以純化和鑒定。在被常規(guī)認作益生菌的乳酸菌、雙歧桿菌和部分腸道共生菌，如類菌體梭菌、腸球菌等細菌中都發(fā)現(xiàn)存在BSH活性。目前為止，尚未在生活環(huán)境缺乏膽鹽的細菌中發(fā)現(xiàn)具有BSH活性的菌株。除了兩株類菌體以外的BSH活性陽性細菌均為革蘭氏陽性菌。在其他所有腸道革蘭氏陰性菌中，包括大腸桿菌Escherichiacoli以及腸道沙門氏菌Salmonella enterica等均未發(fā)現(xiàn)BSH活性,也沒有找到BSH同源基因。
[0004]膽鹽水解酶是由BSH基因編碼的一種胞內(nèi)酶，是腸道微生物為了抵抗膽鹽得以生存而產(chǎn)生的一種代謝產(chǎn)物，該酶能夠水解腸道內(nèi)的結(jié)合膽鹽形成氨基酸和游離膽汁酸，經(jīng)BSH酶作用后產(chǎn)生的去結(jié)合型膽鹽比結(jié)合型膽鹽重吸收效率低，導致大量的去結(jié)合型膽鹽從糞便中排出，而膽固醇的主要去路是轉(zhuǎn)變成膽酸，因此通過膽鹽水解酶的水解作用可以使膽固醇不斷向合成結(jié)合膽鹽的方向進行以保證腸道內(nèi)結(jié)合膽鹽與脂質(zhì)物質(zhì)的平衡，從而消耗體內(nèi)更多的膽固醇，達到降低血清膽固醇的目的。
[0005]雖然目前BSH酶對宿主細胞的作用沒有公認的結(jié)論，也存在各種假說，如降低膽固醇，減弱脂肪酸和甘油一酯酸的吸收等等。但國內(nèi)外大量臨床實驗證實，服用益生菌及其相關制品具有減少人體血清膽固醇含量，降低心血管疾病發(fā)病率的功效，這與益生菌產(chǎn)生的膽鹽水解酶BSH可能存在密切的聯(lián)系。正常人膽汁中的膽汁酸按結(jié)構(gòu)可分為兩大類:一類為游離型膽汁酸，包括膽酸、脫氧膽酸、鵝去氧膽酸和少量的石膽酸；另一類為結(jié)合型膽汁酸，主要包括甘氨膽酸、甘氨鵝去氧膽酸、牛磺膽酸及?；蛆Z去氧膽酸等。根據(jù)資料顯示，人體內(nèi)六種主要的結(jié)合膽鹽和三種膽酸分別參與了不同的代謝活動，通過激活不同的信號傳導途徑，可以分別起到調(diào)節(jié)體內(nèi)能量代謝平衡、控制肥胖的作用以及抑制腸道細菌過度增殖等作用。其中，甘氨膽酸能夠顯著抑制IgM、IgG的含量，并增加IL- 2及TNF-A的含量，提高CD4+/ CD8+比值，提高非特異體性免疫功能。De Boever等人猜測甘氨與?；敲撗跄懰岬膶δ懰岬母咝式怆x可能是使膽汁酸的毒性降低的重要原因。甘氨鵝脫氧膽酸可誘導原代培養(yǎng)的大鼠肝細胞凋亡，這為臨床治療膽汁淤積性肝病提供了新的思路和理論基礎。?；蛆Z脫氧膽酸可通過減少NO、LTB4的產(chǎn)生，直接發(fā)揮抗炎作用。此外David A.Wenger等人發(fā)現(xiàn)牛磺鵝脫氧膽酸能夠促進乳糖苷神經(jīng)酰胺β -半乳糖苷酶的活性，這對研究克拉貝氏病具有指向性意義。因此，通過膽鹽水解酶的水解作用，影響膽汁酸的組成和流量對于治療高膽固醇相關的糖尿病、肥胖癥等許多疾病，維護人類健康有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種乳酸菌膽鹽水解酶及其提取方法。
[0007]本發(fā)明所提供的乳酸菌膽鹽水解酶的提取方法是由唾液乳酸桿菌得到的膽鹽水解酶。
[0008](I)乳酸菌發(fā)酵液以8 000 r/min, 4 ° C離心8 min,收集沉淀菌泥；
(2)用生理鹽水離心洗滌菌體沉淀2次(條件同上)；
(3)加入0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)至發(fā)酵液原體積，細胞懸浮液于冰浴中進行超聲波破碎15 min (功率400~450 W，工作I S，間歇2 s)；
(4)以10000 r/min, 4 ° C離心10 min除去細胞碎片，收集含酶上清液。
[0009](5)上清液用70%~75%飽和濃度的硫酸按于4 ° C鹽析24 h，以10 000 r/min，4 ° C離心15~20 min,收集沉淀的蛋白物質(zhì)；
(6)用0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)溶解蛋白物質(zhì)，再以預處理的透析袋于4 ° C透析至透析液經(jīng)BaC12檢驗無沉淀為止，透析液即為膽鹽水解酶提取液。
[0010](7)將50 m l或100 ml的膽鹽水解酶提取液注入500 ml無菌凍干瓶內(nèi)，在_25° C條件下預凍至凍結(jié)狀態(tài)(16~24 h)，在博醫(yī)康冷凍真空干燥機上于0.22、.24 mBar真空度、冷阱溫度為-55 ° C條件下升華干燥36~72 h，其干燥物即為乳酸菌膽鹽水解酶粗品O
[0011]唾液乳酸桿菌屬于益生菌，具有可靠性和安全性，其產(chǎn)生的膽鹽水解酶水解結(jié)合態(tài)膽鹽的產(chǎn)物為游離態(tài)膽鹽和氨基酸，對人體無害。本發(fā)明用該乳酸菌菌株提取的膽鹽水解酶，其原料來源方便，提取工藝簡單，發(fā)酵周期短，操作簡單，成本較低，對設備要求低，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0012]下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0013]下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為體積百分含量。
[0014]實施例1、
用于培養(yǎng)唾液乳桿菌高產(chǎn)膽鹽水解酶的培養(yǎng)基成分(W/V):葡萄糖1%，酪蛋白陳1%，七水硫酸錳0.02%,牛肉浸取物1%，酵母膏提取液0.5%，吐溫80 0.1%，磷酸氫二鉀0.2%，乙酸鈉0.5%，檸檬酸二胺0.2%，七水硫酸鎂0.058%,碳酸鈣2%，蒸餾水1000 ml, 0.07 MPa滅菌20 min。高產(chǎn)膽鹽水解酶的發(fā)酵工藝條件:發(fā)酵溫度37 ° C，發(fā)酵時間20 h，培養(yǎng)基的初始pH值6.5，接種量2%。
[0015]在此發(fā)酵條件下，唾液乳酸桿菌的膽鹽水解酶活力是優(yōu)化前的2.25倍。
[0016]實施例2、
利用唾液乳桿菌發(fā)酵液提取膽鹽水解酶，膽鹽水解酶的分離純化目的是將該目的胞內(nèi)酶提取出來，經(jīng)過純化使之達到要求的純度。提取的關鍵技術是選擇破碎細胞的有效方法。將在上述發(fā)酵條件下得到的乳酸菌發(fā)酵液以8 000 r/min, 4 ° C離心8 min，棄上清液，菌體用無菌生理鹽水離心洗滌2次(條件同上)，棄上清液，加入0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)至發(fā)酵液原體積，細胞懸浮液于冰浴中進行超聲波破碎15 min (功率400-450w,工作I s,間歇2 s),以10 000 r/min, 4 ° C離心10 min,除去細胞碎片，收集含膽鹽水解酶的上清液；上清液用70%~75%飽和濃度的硫酸按于4 ° C鹽析24 h，以10 000 r/min,4° C離心15~20min，收集沉淀的蛋白物質(zhì)；以0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)溶解蛋白物質(zhì)(加緩沖液的量為初始發(fā)酵液體積的一半)，用預處理的透析袋于4 ° C透析至透析液經(jīng)BaC12檢驗無沉淀為止，即透析完全(期間每隔12 h換一次無菌磷酸鹽緩沖液)，透析液即為膽鹽水解酶提取液。上述采用適宜的超聲波破碎細胞的提取方法，解決了胞內(nèi)膽鹽水解酶較難提取的問題。
[0017]實施例3、
改良了發(fā)酵液及提取液中膽鹽水解酶的酶活力的測定方法，用于微量測定。取20 μL含膽鹽水解酶的溶液，加入等體積的濃度為1%的豬膽鹽，于旋渦混合器上振蕩混勻I min，將混合液于37 ° C振蕩酶解30 min。酶反應完畢，立即加入40 μL 15%三氯乙酸，混勻，中止酶反應I min后離心(條件同上)，上清液即為酶反應液。對照組為20 μL含膽鹽水解酶的溶液于37 ° C振蕩30 min，加入40 μL 15%三氯乙酸后立即加入20 μL濃度為1%的豬膽鹽，后續(xù)操作同樣品處理。膽鹽水解酶活力的測定是通過結(jié)合膽鹽降解后釋放的氨基酸量的多少來衡量。即該酶活力與氨基酸的生成量成正比?？刹捎密崛@色法測定氨基酸的含量。取?ο μL酶反應液，加入茚三酮顯色劑190 μL，混勻后于沸水浴中加熱15 min,自來水冷卻；對照組同上操作并作為空白對照調(diào)0，于酶標儀中570 nm處測得吸光值A(生成的顏色在30 min內(nèi)穩(wěn)定)。膽鹽水解酶于每分鐘生成I Mmol的氨基酸定義為一個酶活力單位。
[0018]實施例4、唾液乳桿菌膽鹽水解酶制品的真空冷凍干燥
將50 ml或100 ml的膽鹽水解酶提取液注入500 ml無菌凍干瓶內(nèi)，在_25 ° C條件下預凍至凍結(jié)狀態(tài)(16~24 h )，在博醫(yī)康冷凍真空干燥機上于0.22、.24 mBar真空度、冷阱溫度為-55 ° C條件下升華干燥36~72 h，其干燥物即為乳酸菌膽鹽水解酶粗品。
[0019]以上所述，僅為本發(fā)明的【具體實施方式】，并不局限于此，任何熟悉本【技術領域】的技術人員在本發(fā)明揭露的技術范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種利用唾液乳酸桿菌(Lactobaicillus salivarius) LMG14476發(fā)酵提取膽鹽水解酶的方法，其特征在于采用超聲波處理與硫酸銨沉淀結(jié)合的方法提取唾液乳酸桿菌中的膽鹽水解酶。
2.如權(quán)利要求1所述的利用超聲波輔助法處理乳酸菌發(fā)酵后菌體細胞提取細胞內(nèi)溶物，其特征在于包括如下步驟: (1)所述乳酸菌的發(fā)酵液以8000 r/min,4 ° C離心8 min,收集沉淀菌泥； (2)用生理鹽水離心洗滌步驟(1)中的菌體沉淀2次，條件同上； (3)向步驟(2)的沉淀中加入0.02 mol/L的pH 6.0的磷酸鹽緩沖液至發(fā)酵液原體積，細胞懸浮液于冰浴中進行超聲波破碎15 min，功率40(T450 W，工作I S，間歇2 s ； (4)以10000 r/min，4 ° C離心8 min，除去步驟(3)所得懸浮液中的細胞碎片，收集含膽鹽水解酶的上清液。
3.如權(quán)利要求2所述的含膽鹽水解酶的上清液經(jīng)硫酸銨處理的方法，其特征在于:權(quán)利2所得含膽鹽水解酶的上清液用70%~75%飽和濃度的硫酸銨于4 ° C鹽析24 h，以10，000r/min, 4 ° C離心15~20 min,收集沉淀的蛋白物質(zhì)。
4.如權(quán)利要求3所述的蛋白沉淀經(jīng)溶解透析的方法，其特征在于:以0.02 mol/L的pH6.0的磷酸鹽緩沖液溶解權(quán)利3所得蛋白物質(zhì)，用預處理的透析袋于4 ° C透析至透析液經(jīng)BaC12檢驗無沉淀為止，透析液即為膽鹽水解酶提取液。
5.如權(quán)利要求4所述的透析液經(jīng)冷凍干燥制備酶制品的方法，其特征在于:將50ml或100mL的權(quán)利要求4所得膽鹽 水解酶透析液注入500 ml無菌凍干瓶內(nèi)，在-25 ° C條件下16~24 h預凍至凍結(jié)狀態(tài)，在博醫(yī)康FD-1A-50冷凍真空干燥機上于0.22、.24 mBar真空度、冷阱溫度為-55 ° C條件下升華干燥36~72 h，其干燥物即為乳酸菌膽鹽水解酶粗制品O
【文檔編號】C12R1/225GK103865910SQ201410138333
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月9日
【發(fā)明者】齊宏濤 申請人:青島博之源生物技術有限公司