本發(fā)明涉及一種產(chǎn)膽鹽水解酶的重組畢赤酵母，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
膽鹽水解酶(BSH)是由bsh基因編碼的一種胞內(nèi)酶，廣泛存在于腸道微生物中，是降解膽汁的主要組成成份——共軛膽酸第一步所需的酶。膽酸鹽水解酶可將共軛膽酸水解成?；撬峄蚋拾彼岷陀坞x膽酸，后者可由其它腸道微生物在腸道內(nèi)作進(jìn)一步降解。膽酸鹽水解酶的生理作用體現(xiàn)在兩個(gè)方面：一、影響宿主的脂肪代謝過程，減少脂肪的消化吸收和降低膽固醇水平等；二、膽汁的降解減少了膽汁對(duì)腸道微生物的毒性，改善了微生物生存的腸道環(huán)境；由降解產(chǎn)生的氨基酸和游離脂肪酸還可為微生物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。
利用基因工程的手段來研究膽鹽水解酶的過量表達(dá)，可以提高膽鹽水解酶的水解活性以及產(chǎn)量。這為研究膽鹽水解酶的酶學(xué)性質(zhì)提供了一定的基礎(chǔ)。另外，純化后的膽鹽水解酶可應(yīng)用于研究酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)以及酶與底物的作用機(jī)制。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種產(chǎn)膽鹽水解酶的重組畢赤酵母，是以pPIC9K為載體，在畢赤酵母中表達(dá)SEQ ID NO.1所示膽鹽水解酶基因。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述畢赤酵母包括pichia pastoris GS115、pichia pastoris KM71、pichia pastoris X-33、pichia pastoris SMD1168。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述膽鹽水解酶基因前還融合了SEQ ID NO.2所示信號(hào)肽。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種產(chǎn)膽鹽水解酶的重組畢赤酵母的構(gòu)建方法，所述方法是以pPIC9K為載體，在畢赤酵母中表達(dá)SEQ ID NO.1所示基因。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法具體是：合成SEQ ID NO.1所示基因序列，合成SEQ ID NO.2所示信號(hào)肽序列，將上述序列融合并與載體pPIC9K連接形成重組質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化至畢赤酵母中得到重組畢赤酵母。
本發(fā)明的第三個(gè)目的提供一種膽鹽水解酶胞外分泌表達(dá)的方法，是使用上述方法構(gòu)建的重組畢赤酵母進(jìn)行發(fā)酵，表達(dá)膽鹽水解酶。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是以1～5％體積比接種重組畢赤酵母至培養(yǎng)基中，20～28℃，200～220rpm下培養(yǎng)；所述培養(yǎng)基為BMMY培養(yǎng)基，配方為：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，7-10％甲醇，YNB 13.4g/L，pH6.0的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液。
本發(fā)明還要求保護(hù)所述重組畢赤酵母在食品、醫(yī)藥、保健品領(lǐng)域制備含膽鹽水解酶的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
有益效果：本發(fā)明采用重組DNA技術(shù)將植物乳桿菌來源的膽鹽水解酶基因bsh與信號(hào)肽α-MF融合并與載體pPIC9K連接，并轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中，獲得產(chǎn)膽鹽水解酶的重組畢赤酵母。將本發(fā)明構(gòu)建的重組畢赤酵母接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，20～28℃發(fā)酵5～7d，酶活可達(dá)到8.17U/mL。這為膽鹽水解酶的大規(guī)模生產(chǎn)及其作為功能食品來降低血清膽固醇奠定了良好的基礎(chǔ)。
附圖說明
圖1為重組畢赤酵母產(chǎn)膽鹽水解酶的酶活。
具體實(shí)施方式
LB培養(yǎng)基：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。
YPD培養(yǎng)基：胰蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L。
MD培養(yǎng)基：YNB 13.4g/L、葡萄糖20g/L、生物素4×10-4g/L。
BMGY培養(yǎng)基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，甘油40g/L，YNB 13.4g/L，pH6.0的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液。
BMMY培養(yǎng)基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，7-10％甲醇，YNB 13.4g/L，pH6.0的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液。
膽鹽水解酶酶活測(cè)定方法：取10μL酶液用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)稀釋至90μL，加入10μL結(jié)合膽鹽(200mM)混合，于37℃孵育30min，加入等體積的15％(w/v)三氯乙酸終止反應(yīng)，離心后取10μL上清液與190μL茚三酮試劑混合，于100℃反應(yīng)15min，冷卻后于570nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。其中，茚三酮試劑的組成為：0.5mL 1％(w/v)茚三酮(溶解于0.5M、pH5.5檸檬酸鹽緩沖液)，1.2mL甘油，0.2mL 0.5M、pH5.5的檸檬酸緩沖液。
具體實(shí)施方式中選用?；敲撗踅Y(jié)合膽鹽測(cè)定酶活。
實(shí)施例1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
通過化學(xué)合成獲得序列如SEQ ID NO.1所示序列，設(shè)計(jì)引物，通過融合PCR將SEQ ID NO.1所示序列與信號(hào)肽α-MF連接，柱回收產(chǎn)物獲得融合片段。將融合片段αMF-bsh和pPIC9K質(zhì)粒16℃過夜連接。連接產(chǎn)物pPIC9K-αMF-bsh化學(xué)法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化液涂布于含50mg/L卡那霉素的LB平板，提取質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建的重組質(zhì)粒。
實(shí)施例2產(chǎn)膽鹽水解酶的重組畢赤酵母的構(gòu)建
將重組質(zhì)粒pPIC9K-αMF-bsh線性化，電擊轉(zhuǎn)化至Pichia pastoris GS115感受態(tài)細(xì)胞，具體方法如下：
(1)接種YPD平板活化的pichia pastoris GS115于25mL/250mL三角瓶，30℃過夜培養(yǎng)；以1％(按體積比)接種上述培養(yǎng)液于含50mL/500mL培養(yǎng)基的三角瓶，培養(yǎng)菌體濃度OD600為1.3～1.5；
(2)5000r/min，4℃離心10min收集菌體，分別用50mL、25mL無菌水懸浮細(xì)胞；
(3)5mL 1M山梨醇重懸上述細(xì)胞，5000r/min，4℃離心10min收集菌體；
(4)500μL 1M山梨醇重懸上述細(xì)胞，分裝80μL/1.5mL EP管用于電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；5)20μL線性化質(zhì)粒與上述80μL感受態(tài)細(xì)胞混合，冰上靜置15min；
(5)上述混合物加入預(yù)冷的無菌電轉(zhuǎn)化杯(0.2cm)，1500V、25μF、200Ω電擊一次，加入1mL1M山梨醇；
(6)取上述混合物150μL涂布MD平板，30℃培養(yǎng)3天；
(7)挑取陽(yáng)性克隆，分別點(diǎn)種在含1、2、3、4mg/mL遺傳霉素的YPD平板中，挑選在4mg/mL遺傳霉素平板中的單菌落用于搖瓶發(fā)酵。
實(shí)施例3重組畢赤酵母的培養(yǎng)和搖瓶發(fā)酵
將本發(fā)明構(gòu)建的工程菌作為生產(chǎn)菌株，以未連接信號(hào)肽的重組畢赤酵母菌為對(duì)照，在YPD平板活化。種子液培養(yǎng)，接種50mL/250mL種子培養(yǎng)基，30℃，220r/min培養(yǎng)24h。離心種子液，按發(fā)酵培養(yǎng)基中種子終濃度為OD600＝1接種發(fā)酵培養(yǎng)基，20～28℃，220r/min培養(yǎng)7d。每隔24h取樣測(cè)膽鹽水解酶的酶活。結(jié)果顯示，未連接信號(hào)肽的重組畢赤酵母胞外膽鹽水解酶分泌量?jī)H為0.02U/mL，本發(fā)明構(gòu)建的含有信號(hào)肽α-MF的重組畢赤酵母發(fā)酵5d，膽鹽水解酶胞外酶活提高至7.92U/mL，發(fā)酵168h可達(dá)8.17U/mL(圖1)。
雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
SEQUENCE LISTING
<110> 曹書華
<120> 一種產(chǎn)膽鹽水解酶的重組畢赤酵母
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<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
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