本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檸檬酸產(chǎn)量提高的重組霉菌的構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

黑曲霉是重要的工業(yè)生產(chǎn)菌，目前對(duì)黑曲霉進(jìn)行代謝改造的研究集中于中心代謝通路和呼吸鏈的改造，包括糖酵解途徑、TCA循環(huán)、rTCA循環(huán)的關(guān)鍵酶的單基因表達(dá)和基因協(xié)同表達(dá)，以及交替氧化酶的過(guò)量表達(dá)和敲除，但這些改造對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響甚微，上述方法中只有增強(qiáng)rTCA循環(huán)途徑促進(jìn)了檸檬酸產(chǎn)量的提高。

在檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)中，原料為淀粉，淀粉經(jīng)過(guò)淀粉酶液化后過(guò)濾，得到清液和混液，通過(guò)清液和混液進(jìn)行勾兌得到種子和發(fā)酵培養(yǎng)基，此時(shí)培養(yǎng)基中約一半的碳源為葡萄糖，另一半碳源以多聚葡萄糖的形式存在。而工業(yè)生產(chǎn)菌在發(fā)酵初期合成大量糖化酶，將多聚葡萄糖分解為葡萄糖，因此，在發(fā)酵前期培養(yǎng)基中碳源基本以葡萄糖的形式存在，所以檸檬酸發(fā)酵對(duì)碳源的吸收實(shí)際上是指對(duì)葡萄糖的吸收。

Torres測(cè)定了黑曲霉吸收葡萄糖存在2個(gè)Km值，分別為260μM和3.67mM，說(shuō)明存在高親和力和低親和力兩套轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，而且由低親和力的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)提供檸檬酸發(fā)酵所需的代謝流，但該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)僅在葡萄糖濃度>50g·L^-1時(shí)起作用。因葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)是檸檬酸發(fā)酵的第一個(gè)步驟，該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)對(duì)檸檬酸發(fā)酵有直接的影響，因此調(diào)整檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，有可能增強(qiáng)檸檬酸的產(chǎn)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種檸檬酸產(chǎn)量提高的重組霉菌的構(gòu)建方法及應(yīng)用，通過(guò)啟動(dòng)高親和力葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，以增強(qiáng)葡萄糖在發(fā)酵后期的吸收，進(jìn)而提高了霉菌中檸檬酸的發(fā)酵產(chǎn)量。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

在一方面，本發(fā)明提供了一種檸檬酸產(chǎn)量提高的重組霉菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)構(gòu)建HGT1蛋白表達(dá)框，HGT1蛋白表達(dá)框包含組成型啟動(dòng)子、與組成型啟動(dòng)子連接的HGT1蛋白編碼基因以及與HGT1蛋白編碼基因連接的終止子；

(2)構(gòu)建抗性基因表達(dá)框，抗性基因表達(dá)框包含組成型啟動(dòng)子、與組成型啟動(dòng)子連接的hph基因以及與hph基因連接的終止子；

(3)將步驟(1)HGT1蛋白表達(dá)框和步驟(2)得到的抗性基因表達(dá)框轉(zhuǎn)化到霉菌中，得到重組霉菌。

進(jìn)一步地，在步驟(1)中，HGT1蛋白編碼基因來(lái)源于黑曲霉。

進(jìn)一步地，在步驟(1)中，HGT1蛋白編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

進(jìn)一步地，HGT1蛋白編碼基因具有轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的功能，其編碼的氨基酸序列可發(fā)生1個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失或插入。

優(yōu)選地，HGT1蛋白編碼基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

進(jìn)一步地，在步驟(1)中和步驟(2)中，組成型啟動(dòng)子為PgpdA啟動(dòng)子、gpdA啟動(dòng)子、Pmbf啟動(dòng)子或Pgla啟動(dòng)子。

進(jìn)一步地，PgpdA啟動(dòng)子的序列如SEQ ID NO.3所示。

進(jìn)一步地，在步驟(1)和步驟(2)中，終止子為trp終止子。

進(jìn)一步地，trp終止子的序列如SEQ ID NO.4所示。

進(jìn)一步地，在步驟(2)中，hph基因的序列如SEQ ID NO.5所示。

進(jìn)一步地，在步驟(2)中，構(gòu)建潮霉素抗性基因表達(dá)框，便于陽(yáng)性克隆子的篩選。抗性基因表達(dá)框以pAN7-1為模板克隆得到。

進(jìn)一步地，在步驟(3)中，霉菌為黑曲霉、米曲霉或構(gòu)巢曲霉。

優(yōu)選地，在步驟(3)中，霉菌為黑曲霉Aspergillus niger H915-1，米曲霉100-8或構(gòu)巢曲霉FGSC A4。

進(jìn)一步地，HGT1蛋白表達(dá)框的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)將終止子序列酶切后，連接到pUC19質(zhì)粒上，得到pUC-trp載體；

(2)將組成型啟動(dòng)子序列PgpdA酶切后，連接到pUC-trp載體上，得到pUC-PgpdA-trp載體；組成型啟動(dòng)子序列PgpdA還可以替換為gpdA啟動(dòng)子、Pmbf啟動(dòng)子或Pgla啟動(dòng)子；

(3)將HGT1序列雙酶切后，片段連接到pUC-PgpdA-trp載體上，得到pUC-PgpdA-HGT1-trp表達(dá)框。

進(jìn)一步地，轉(zhuǎn)化方法包括以下步驟：

(1)將HGT1蛋白表達(dá)框和抗性基因表達(dá)框經(jīng)PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入霉菌原生質(zhì)體中；

(2)在潮霉素抗性的高滲軟瓊脂PDA平板上培養(yǎng)得到陽(yáng)性克隆，再將經(jīng)培養(yǎng)4-7天的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)移至含150-180mg/L潮霉素的平板上進(jìn)一步培養(yǎng)得到陽(yáng)性克隆，驗(yàn)證正確的即為重組霉菌。

由于霉菌在發(fā)酵后期通過(guò)表達(dá)高親和力葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)吸收葡萄糖，基于這一研究基礎(chǔ)，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了高親和力葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HGT1在不同霉菌中的表達(dá)，以增強(qiáng)葡萄糖在發(fā)酵后期的吸收。

在另一方面，本發(fā)明提供了一種HGT1蛋白表達(dá)框，包括組成型啟動(dòng)子、與組成型啟動(dòng)子連接的HGT1蛋白編碼基因以及與HGT1蛋白編碼基因連接的終止子。

進(jìn)一步地，組成型啟動(dòng)子為PgpdA啟動(dòng)子、gpdA啟動(dòng)子、Pmbf啟動(dòng)子或Pgla啟動(dòng)子。

進(jìn)一步地，HGT1蛋白編碼基因來(lái)源于黑曲霉，HGT1蛋白編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

進(jìn)一步地，終止子為trp終止子。

在又一方面，本發(fā)明還提供了一種由上述方法構(gòu)建的重組霉菌株。

本發(fā)明還提供了上述方法所構(gòu)建的重組霉菌在發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的重組霉菌發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的條件為：在30-35℃的溫度下發(fā)酵72-120h，優(yōu)選轉(zhuǎn)速為250r/min左右。

借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明利用組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)HGT1蛋白在霉菌中表達(dá)，通過(guò)增強(qiáng)發(fā)酵后期葡萄糖的攝取，從而提高檸檬酸的產(chǎn)量；本發(fā)明方法對(duì)產(chǎn)檸檬酸的黑曲霉菌株具有普遍適用性，可使黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸產(chǎn)量提高近10％，利用Aspergillus niger H915-1作為宿主，檸檬酸產(chǎn)量提高了14.7％，發(fā)酵周期縮短了6h。

附圖說(shuō)明

圖1是黑曲霉菌株中檸檬酸和葡萄糖的含量測(cè)試結(jié)果；

圖2是發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，檸檬酸的比產(chǎn)酸速率測(cè)試結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1 黑曲霉RNA的提取

將黑曲霉孢子接種到檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，35℃下250r/min培養(yǎng)48h，用mirocloth濾布收集菌球，再用無(wú)菌超純水洗滌3遍，濾干水分后迅速在液氮中冷凍。用液氮研磨的方法將組織充分磨碎，采用QIAGEN公司RNeasy Plant Mini Kit試劑盒提取黑曲霉總RNA。用TAKARA公司PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

實(shí)施例2 黑曲霉基因組DNA的提取

將黑曲霉孢子接種到ME液體培養(yǎng)基(3％麥芽提取物，0.5％胰蛋白胨)中，35℃下250r/min培養(yǎng)48h，用mirocloth濾布收集菌球，再用無(wú)菌超純水洗滌3遍，濾干水分后迅速在液氮中冷凍。用液氮研磨的方法將組織充分磨碎，采用QIAGEN公司DNeasy Plant Mini Kit提取絲狀真菌基因組。

實(shí)施例3 HGT1蛋白表達(dá)框和潮霉素抗性表達(dá)框的構(gòu)建

利用引物trp-F(序列如SEQ ID NO.6所示)和trp-R(序列如SEQ ID NO.7所示)以pAN7-1為模板擴(kuò)增trp終止子，序列上下游含Pst I和Hin dIII酶切位點(diǎn)，連接到pMD19上測(cè)序，然后用這兩個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切，將該序列連接到同樣酶切的pUC19上，得到pUC19-trp。

利用引物Pgpd-F(序列如SEQ ID NO.8所示)和Pgpd-R(序列如SEQ ID NO.9所示)從pAN7-1中擴(kuò)增PgpdA啟動(dòng)子，序列兩頭含Eco RI和Kpn I酶切位點(diǎn)，酶切后，將該序列連接到同樣酶切的pUC19-trp，得到pUC-PgpdA-trp。

利用引物HGT1-F(序列如SEQ ID NO.10所示)和HGT1-R(序列如SEQ ID NO.11所示)從實(shí)施例1中得到的黑曲霉cDNA中擴(kuò)增HGT1基因，基因兩頭含Kpn I和Pst I酶切位點(diǎn)，連接到同樣酶切的pUC-PgpdA-trp上，形成PgpdA-HGT1-trp表達(dá)框。

潮霉素抗性表達(dá)框通過(guò)引物gpd-F(序列如SEQ ID NO.12所示)和Ttrp-R-2(序列如SEQ ID NO.13所示)從質(zhì)粒pAN7-1中擴(kuò)增得到。

本實(shí)施例中，擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性3min，隨后進(jìn)行30次循環(huán)94℃20s、55℃20s和72℃3min，最后72℃反應(yīng)10min。

本實(shí)施例中，酶切條件如下：37℃酶切2小時(shí)。

實(shí)施例4 黑曲霉原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化

按3×10⁵/ml的濃度將黑曲霉孢子接種至PDA液體培養(yǎng)基，在30℃下200r/min培養(yǎng)過(guò)夜。用mirocloth濾布收集菌球，并用無(wú)菌水清洗菌球。稱取一定量的裂解酶，并用滲透壓穩(wěn)定劑KMC溶解，用無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。

稱取一定量菌球，加入到酶解液中，37℃、100r/min震蕩培養(yǎng)約3h直至菌絲完全消化為原生質(zhì)體，4℃、1000rpm離心10min，棄上清，加入相同體積預(yù)冷的STC，4℃、1000rpm離心10min，棄上清，洗滌2次，加入100μL STC，混勻。

向100μL黑曲霉原生質(zhì)體中加入10μL線性化核酸片段(HGT1蛋白表達(dá)框和潮霉素抗性表達(dá)框)和330μL PEG緩沖液，冰上放置20min，加入2mL PEG，室溫放置10min，依次加入4mL STC和4mL于48℃預(yù)熱的上層培養(yǎng)基，鋪板于含有180mg/L潮霉素的下層培養(yǎng)基上。平板在35℃倒置培養(yǎng)4-7天，直至出現(xiàn)菌落，挑取單菌落繼代。每個(gè)菌落進(jìn)行3次單孢子繼代。

實(shí)施例5 黑曲霉轉(zhuǎn)化子產(chǎn)量的驗(yàn)證

將黑曲霉接種于PDA培養(yǎng)基上，35℃下生孢培養(yǎng)5-7天，刮取孢子，以10⁶/mL的接種量接種于種子培養(yǎng)基，37℃、250r/min培養(yǎng)24h，以1/10接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，35℃、250r/min發(fā)酵72h。發(fā)酵液離心去除菌體，稀釋10倍，用濾膜過(guò)濾后用HPLC法檢測(cè)檸檬酸含量，HPLC法檢測(cè)條件如下：

儀器：Agilent 1200高效液相色譜儀(配紫外可見(jiàn)檢測(cè)器、示差檢測(cè)器和工作站)；色譜條件：HPX87H色譜柱(4.6×250mm，5μm)，流動(dòng)相為5mM硫酸溶液，流量為0.6mL/min，進(jìn)樣量為10μL，柱溫為30℃，210nm波長(zhǎng)紫外光檢測(cè)。

圖1反映了在不同菌株中，檸檬酸和葡萄糖的含量結(jié)果，其中H915-1代表野生黑曲霉菌株，HGT1代表本發(fā)明的重組菌株，從圖中可以看出，本發(fā)明的重組黑曲霉菌株的檸檬酸產(chǎn)量得到提高，其產(chǎn)量比野生型菌株提高了14.6％左右，且發(fā)酵后期，葡萄糖的含量更低，說(shuō)明HGT1蛋白促進(jìn)了葡萄糖的吸收，且葡萄糖吸收的增強(qiáng)可以增加檸檬酸產(chǎn)量。

圖2是上述兩種菌株的檸檬酸比產(chǎn)酸速率測(cè)試結(jié)果，可以看出，本發(fā)明的重組菌株的檸檬酸產(chǎn)出速率更高，原因是HGT1蛋白的過(guò)量表達(dá)增強(qiáng)了葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，可以提高產(chǎn)酸速率，說(shuō)明葡萄糖吸收是提高檸檬酸產(chǎn)量的限制性步驟。與野生型黑曲霉菌株相比，本發(fā)明的重組黑曲霉菌株的發(fā)酵時(shí)間縮短了6h。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

序列表

<110> 江南大學(xué)

<120> 檸檬酸產(chǎn)量提高的重組霉菌的構(gòu)建方法及應(yīng)用

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1644

<212> DNA

<213> HGT1基因

<400> 1

1 ATGTTGATTG GCAACATCTA CGTGATTGCG AGCGTCGCCG TCGTCGGCGG CGGCTTGTTT

61 GGCTTTGATA TTTCCTCCAT GTCCGCTCAG CTGAGCGAGA ATTCCTATCT ATGCTATTTC

121 AACCAGGGCC CTAAGGGTCC TCCCTTCACT GACGATGAGG ACTGTTCTGG TCCCACATCC

181 CTCAACCAGG GTGGCATCAC GGCAGCCATG GCAGCTGGAT CTTGGCTGGG TGCTTTGATT

241 TCAGGTCCGC TTTCCGATCG CATCGGACGT AAGACGTCCA TCATGGTCGG CTGTGTCGTT

301 TGGCTGATTG GTTCCACCAT TATGTGCGCT TCTCAGAACA TCGGTATGCT CGTTGTTGGG

361 CGGGTCATCA ACGGTCTCGC GGTGGGCATT GAGTCTGCTC AGGTCCCCGT CTACATCAGT

421 GAACTTTCGC CACCCTCCAA GCGCGGTCGG TTCGTAGGTA TGCAGCAATG GGCCATTACA

481 TGGGGTATCC TCATTATGTT CTATATCTCG TATGGCTGCT CCTTCATCGG GGGACAGAAG

541 TCCTACAACT ACAGCACTGC TTCTTGGCGA GTCCCCTGGG GCTTGCAGAT GCTGCCGGCT

601 GTTTTCCTTT TCCTTGGAAT GCTGGTTCTG CCCGAATCTC CTCGTTGGCT GGCGCGCAAG

661 GATCGTTGGG AGGACTGCCA TCGGGTCTTG GCTCTCGTCC ACGCCAAGGG GGATCTCAAC

721 CATCCTTTCG TTGCGCTAGA GTTGCAGGAC ATTCGGGATA TGTGTGAGCT TGAACGTCAG

781 TTCAAAGATG TCACTTACCT TGACCTGTTC AAACCGAGGA TGATCAACCG CACGTTGATC

841 GGTCTGTTCA TGCAGATCTG GTCTCAGCTG ACCGGCATGA ATGTGATGAT GTACTACATC

901 ACGTATCTCT TTTCTATGGC TGGATACACC GGCGATTCCA CCCTCCTTGC CTCCTCCATT

961 CAGTATATTA TCAATGTGTT TATGACCCTC CCGGCACTGA TCTGGATGGA CAAGTGGGGT

1021 CGTCGCATGC CATTGCTGGT TGGCGCAGCT CTGATGGCCA TCTTGATGTA TGCCAATGGT

1081 GCGATCATGG CGGTTCATGG TGTTGTGGTG CCCGGGGGCA TCAATGGGGT TGCAGCTGAG

1141 TCCATGCGTC TTCACGGCGC TCCTGCCAAA GGTTTGATTG CTTGCACATA CCTCTTCGTC

1201 GCGTCGTATG CGCCTACCTG GGGTCCTGTA TCCTGGACGT ACCCCCCTGA GCTGTATCCG

1261 CTGCGGCTGC GTGGTAAGGG AGTGGCTTTG TCGACCTCAG GTAACTGGGC GTTTAACACT

1321 GCATTGGGGC TGTTTACACC CACTGCATTT GAGAACATCC GCTGGAAGAC CTACATCATG

1381 TTTGGGGTGT TCAACACTGC CATGTTCTTG CACGTGCTGT TCCTGTTCCC GGAGACTGCA

1441 GGAAAGACGC TCGAAGAGAC CGAAGCCATG TTCGAGGATC CCAACGGCAT CAAGTACATT

1501 GGCACACCGG CCTGGAAGAC CAAGATGAAG ACCCGGCAGG TGGAGCAGCT GGAGCACGGT

1561 CAAGTGGATA TAGAGTCCAA GATTGAAACC CGCCACGCAG AGACCACTGA GACCGCTCCC

1621 AAATCCCAGG AGGCCACAGC ATAA

<210> 2

<211> 547

<212> 氨基酸

<213> HGT1蛋白編碼基因編碼的氨基酸

<400> 2

Met Leu Ile Gly Asn Ile Tyr Val Ile Ala Ser Val Ala Val Val

1 5 10 15

Gly Gly Gly Leu Phe Gly Phe Asp Ile Ser Ser Met Ser Ala Gln

20 25 30

Leu Ser Glu Asn Ser Tyr Leu Cys Tyr Phe Asn Gln Gly Pro Lys

35 40 45

Gly Pro Pro Phe Thr Asp Asp Glu Asp Cys Ser Gly Pro Thr Ser

50 55 60

Leu Asn Gln Gly Gly Ile Thr Ala Ala Met Ala Ala Gly Ser Trp

65 70 75

Leu Gly Ala Leu Ile Ser Gly Pro Leu Ser Asp Arg Ile Gly Arg

80 85 90

Lys Thr Ser Ile Met Val Gly Cys Val Val Trp Leu Ile Gly Ser

95 100 105

Thr Ile Met Cys Ala Ser Gln Asn Ile Gly Met Leu Val Val Gly

110 115 120

Arg Val Ile Asn Gly Leu Ala Val Gly Ile Glu Ser Ala Gln Val

125 130 135

Pro Val Tyr Ile Ser Glu Leu Ser Pro Pro Ser Lys Arg Gly Arg

140 145 150

Phe Val Gly Met Gln Gln Trp Ala Ile Thr Trp Gly Ile Leu Ile

155 160 165

Met Phe Tyr Ile Ser Tyr Gly Cys Ser Phe Ile Gly Gly Gln Lys

170 175 180

Ser Tyr Asn Tyr Ser Thr Ala Ser Trp Arg Val Pro Trp Gly Leu

185 190 195

Gln Met Leu Pro Ala Val Phe Leu Phe Leu Gly Met Leu Val Leu

200 205 210

Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Ala Arg Lys Asp Arg Trp Glu Asp

215 220 225

Cys His Arg Val Leu Ala Leu Val His Ala Lys Gly Asp Leu Asn

230 235 240

His Pro Phe Val Ala Leu Glu Leu Gln Asp Ile Arg Asp Met Cys

245 250 255

Glu Leu Glu Arg Gln Phe Lys Asp Val Thr Tyr Leu Asp Leu Phe

260 265 270

Lys Pro Arg Met Ile Asn Arg Thr Leu Ile Gly Leu Phe Met Gln

275 280 285

Ile Trp Ser Gln Leu Thr Gly Met Asn Val Met Met Tyr Tyr Ile

290 295 300

Thr Tyr Leu Phe Ser Met Ala Gly Tyr Thr Gly Asp Ser Thr Leu

305 310 315

Leu Ala Ser Ser Ile Gln Tyr Ile Ile Asn Val Phe Met Thr Leu

320 325 330

Pro Ala Leu Ile Trp Met Asp Lys Trp Gly Arg Arg Met Pro Leu

335 340 345

Leu Val Gly Ala Ala Leu Met Ala Ile Leu Met Tyr Ala Asn Gly

350 355 360

Ala Ile Met Ala Val His Gly Val Val Val Pro Gly Gly Ile Asn

365 370 375

Gly Val Ala Ala Glu Ser Met Arg Leu His Gly Ala Pro Ala Lys

380 385 390

Gly Leu Ile Ala Cys Thr Tyr Leu Phe Val Ala Ser Tyr Ala Pro

395 400 405

Thr Trp Gly Pro Val Ser Trp Thr Tyr Pro Pro Glu Leu Tyr Pro

410 415 420

Leu Arg Leu Arg Gly Lys Gly Val Ala Leu Ser Thr Ser Gly Asn

425 430 435

Trp Ala Phe Asn Thr Ala Leu Gly Leu Phe Thr Pro Thr Ala Phe

450 440 445 450

Glu Asn Ile Arg Trp Lys Thr Tyr Ile Met Phe Gly Val Phe Asn

455 460 465

Thr Ala Met Phe Leu His Val Leu Phe Leu Phe Pro Glu Thr Ala

470 475 480

Gly Lys Thr Leu Glu Glu Thr Glu Ala Met Phe Glu Asp Pro Asn

485 490 495

Gly Ile Lys Tyr Ile Gly Thr Pro Ala Trp Lys Thr Lys Met Lys

500 505 510

Thr Arg Gln Val Glu Gln Leu Glu His Gly Gln Val Asp Ile Glu

515 520 525

Ser Lys Ile Glu Thr Arg His Ala Glu Thr Thr Glu Thr Ala Pro

530 535 540

Lys Ser Gln Glu Ala Thr Ala

545

<210> 3

<211> 2310

<212> DNA

<213> PgpdA啟動(dòng)子

<400> 3

1 CAATTCCCTT GTATCTCTAC ACACAGGCTC AAATCAATAA GAAGAACGGT TCGTCTTTTT

61 CGTTTATATC TTGCATCGTC CCAAAGCTAT TGGCGGGATA TTCTGTTTGC AGTTGGCTGA

121 CTTGAAGTAA TCTCTGCAGA TCTTTCGACA CTGAAATACG TCGAGCCTGC TCCGCTTGGA

181 AGCGGCGAGG AGCCTCGTCC TGTCACAACT ACCAACATGG AGTACGATAA GGGCCAGTTC

241 CGCCAGCTCA TTAAGAGCCA GTTCATGGGC GTTGGCATGA TGGCCGTCAT GCATCTGTAC

301 TTCAAGTACA CCAACCCTCT TCTGATCCAG TCGATCATCC CGCTGAAGGG CGCTTTCGAA

361 TCGAATCTGG TTAAGATCCA CGTCTTCGGG AAGCCAGCGA CTGGTGACCT CCAGCGTCCC

421 TTTAAGGCTG CCAACAGCTT TCTCAGCCAG GGCCAGCCCA AGACCGACAA GGCCTCCCTC

481 CAGAACGCCG AGAAGAACTG GAGGGGTGGT GTCAAGGAGG AGTAAGCTCC TTATTGAAGT

541 CGGAGGACGG AGCGGTGTCA AGAGGATATT CTTCGCTCTG TATTATAGAT AAGATGATGA

601 GGAATTGGAG GTAGCATAGC TTCATTTGGA TTTGCTTTCC AGGCTGAGAC TCTAGCTTGG

661 AGCATAGAGG GTCCCTTTGG CTTTCAATAT TCTCAAGTAT CTCGAGTTTG AACTTATTCC

721 CGTGAACCTT TTATTCACCA ATGAGCATTG GAATGAACAT GAATCTGAGG ACTGCAATCG

781 CCATGAGGTT TTCGAAATAC ATCCGGATGT CGAAGGCTTG GGGCACCTGC GTTGGTTGAA

841 TTTAGAACGT GGCACTATTG ATCATCCGAT AGCTCTGCAA AGGGCGTTGC ACAATGCAAG

901 TCAAACGTTG CTAGCAGTTC CAGGTGGAAT GTTATGATGA GCATTGTATT AAATCAGGAG

961 ATATAGCATG ATCTCTAGTT AGCTCACCAC AAAAGTCAGA CGGCGTAACC AAAAGTCACA

1021 CAACACAAGC TGTAAGGATT TCGGCACGGC TACGGAAGAC GGAGAAGCCC ACCTTCAGTG

1081 GACTCGAGTA CCATTTAATT CTATTTGTGT TTGATCGAGA CCTAATACAG CCCCTACAAC

1141 GACCATCAAA GTCGTATAGC TACCAGTGAG GAAGTGGACT CAAATCGACT TCAGCAACAT

1201 CTCCTGGATA AACTTTAAGC CTAAACTATA CAGAATAAGA TGGTGGAGAG CTTATACCGA

1261 GCTCCCAAAT CTGTCCAGAT CATGGTTGAC CGGTGCCTGG ATCTTCCTAT AGAATCATCC

1321 TTATTCGTTG ACCTAGCTGA TTCTGGAGTG ACCCAGAGGG TCATGACTTG AGCCTAAAAT

1381 CCGCCGCCTC CACCATTTGT AGAAAAATGT GACGAACTCG TGAGCTCTGT ACAGTGACCG

1441 GTGACTCTTT CTGGCATGCG GAGAGACGGA CGGACGCAGA GAGAAGGGCT GAGTAATAAG

1501 CGCCACTGCG CCAGACAGCT CTGGCGGCTC TGAGGTGCAG TGGATGATTA TTAATCCGGG

1561 ACCGGCCGCC CCTCCGCCCC GAAGTGGAAA GGCTGGTGTG CCCCTCGTTG ACCAAGAATC

1621 TATTGCATCA TCGGAGAATA TGGAGCTTCA TCGAATCACC GGCAGTAAGC GAAGGAGAAT

1681 GTGAAGCCAG GGGTGTATAG CCGTCGGCGA AATAGCATGC CATTAACCTA GGTACAGAAG

1741 TCCAATTGCT TCCGATCTGG TAAAAGATTC ACGAGATAGT ACCTTCTCCG AAGTAGGTAG

1801 AGCGAGTACC CGGCGCGTAA GCTCCCTAAT TGGCCCATCC GGCATCTGTA GGGCGTCCAA

1861 ATATCGTGCC TCTCCTGCTT TGCCCGGTGT ATGAAACCGG AAAGGCCGCT CAGGAGCTGG

1921 CCAGCGGCGC AGACCGGGAA CACAAGCTGG CAGTCGACCC ATCCGGTGCT CTGCACTCGA

1981 CCTGCTGAGG TCCCTCAGTC CCTGGTAGGC AGCTTTGCCC CGTCTGTCCG CCCGGTGTGT

2041 CGGCGGGGTT GACAAGGTCG TTGCGTCAGT CCAACATTTG TTGCCATATT TTCCTGCTCT

2101 CCCCACCAGC TGCTCTTTTC TTTTCTCTTT CTTTTCCCAT CTTCAGTATA TTCATCTTCC

2161 CATCCAAGAA CCTTTATTTC CCCTAAGTAA GTACTTTGCT ACATCCATAC TCCATCCTTC

2221 CCATCCCTTA TTCCTTTGAA CCTTTCAGTT CGAGCTTTCC CACTTCATCG CAGCTTGACT

2281 AACAGCTACC CCGCTTGAGC AGACATCACC

<210> 4

<211> 771

<212> DNA

<213> trp終止子

<400> 4

1 GATCCACTTA ACGTTACTGA AATCATCAAA CAGCTTGACG AATCTGGATA TAAGATCGTT

61 GGTGTCGATG TCAGCTCCGG AGTTGAGACA AATGGTGTTC AGGATCTCGA TAAGATACGT

121 TCATTTGTCC AAGCAGCAAA GAGTGCCTTC TAGTGATTTA ATAGCTCCAT GTCAACAAGA

181 ATAAAACGCG TTTCGGGTTT ACCTCTTCCA GATACAGCTC ATCTGCAATG CATTAATGCA

241 TTGGACCTCG CAACCCTAGT ACGCCCTTCA GGCTCCGGCG AAGCAGAAGA ATAGCTTAGC

301 AGAGTCTATT TTCATTTTCG GGAGACGAGA TCAAGCAGAT CAACGGTCGT CAAGAGACCT

361 ACGAGACTGA GGAATCCGCT CTTGGCTCCA CGCGACTATA TATTTGTCTC TAATTGTACT

421 TTGACATGCT CCTCTTCTTT ACTCTGATAG CTTGACTATG AAAATTCCGT CACCAGCCCC

481 TGGGTTCGCA AAGATAATTG CACTGTTTCT TCCTTGAACT CTCAAGCCTA CAGGACACAC

541 ATTCATCGTA GGTATAAACC TCGAAAATCA TTCCTACTAA GATGGGTATA CAATAGTAAC

601 CATGGTTGCC TAGTGAATGC TCCGTAACAC CCAATACGCC GGCCGAAACT TTTTTACAAC

661 TCTCCTATGA GTCGTTTACC CAGAATGCAC AGGTACACTT GTTTAGAGGT AATCCTTCTT

721 TCTAGAAGTC CTCGTGTACT GTGTAAGCGC CCACTCCACA TCTCCACTCG A

<210> 5

<211> 1020

<212> DNA

<213> hph終止子

<400> 5

1 ATGCCTGAAC TCACCGCGAC GTCTGTCGAG AAGTTTCTGA TCGAAAAGTT CGACAGCGTC

61 TCCGACCTGA TGCAGCTCTC GGAGGGCGAA GAATCTCGTG CTTTCAGCTT CGATGTAGGA

121 GGGCGTGGAT ATGTCCTGCG GGTAAATAGC TGCGCCGATG GTTTCTACAA AGATCGTTAT

181 GTTTATCGGC ACTTTGCATC GGCCGCGCTC CCGATTCCGG AAGTGCTTGA CATTGGGGAA

241 TTCAGCGAGA GCCTGACCTA TTGCATCTCC CGCCGTGCAC AGGGTGTCAC GTTGCAAGAC

301 CTGCCTGAAA CCGAACTGCC CGCTGTTCTG CAGCCGGTCG CGGAGGCCAT GGATGCGATC

361 GCTGCGGCCG ATCTTAGCCA GACGAGCGGG TTCGGCCCAT TCGGACCGCA AGGAATCGGT

421 CAATACACTA CATGGCGTGA TTTCATATGC GCGATTGCTG ATCCCCATGT GTATCACTGG

481 CAAACTGTGA TGGACGACAC CGTCAGTGCG TCCGTCGCGC AGGCTCTCGA TGAGCTGATG

541 CTTTGGGCCG AGGACTGCCC CGAAGTCCGG CACCTCGTGC ACGCGGATTT CGGCTCCAAC

601 AATGTCCTGA CGGACAATGG CCGCATAACA GCGGTCATTG ACTGGAGCGA GGCGATGTTC

661 GGGGATTCCC AATACGAGGT CGCCAACATC TTCTTCTGGA GGCCGTGGTT GGCTTGTATG

721 GAGCAGCAGA CGCGCTACTT CGAGCGGAGG CATCCGGAGC TTGCAGGATC GCCGCGGCTC

781 CGGGCGTATA TGCTCCGCAT TGGTCTTGAC CAACTCTATC AGAGCTTGGT TGACGGCAAT

841 TTCGATGATG CAGCTTGGGC GCAGGGTCGA TGCGACGCAA TCGTCCGATC CGGAGCCGGG

901 ACTGTCGGGC GTACACAAAT CGCCCGCAGA AGCGCGGCCG TCTGGACCGA TGGCTGTGTA

961 GAAGTACTCG CCGATAGTGG AAACCGACGC CCCAGCACTC GTCCGAGGGC AAAGGAATAG

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物trp-F

<400> 6

1 ctgcaggatc cacttaaacg ttactgaaat c

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物trp-R

<400> 7

1 AAGCTTCTCG AGTGGAGATG TGGAGTGG

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物Pgpd-F

<400> 8

1 GAATTCGCGG CCGCCAATTC CCTTGTATCT CTACACACAG

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物Pgpd-R

<400> 9

1 GGTACCGGTG ATGTCTGCTC AAGCGG

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 引物HGT1-F

<400> 10

1 CTTGAGCAGA CATCACCGGT ACCATGTTGA TTGGCAACAT CTACG

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> 引物HGT1-R

<400> 11

1 TAACGTTTAA GTGGATCGGA TCCTTATGCT GTGGCCTCCT GGGA

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物gpd-F

<400> 12

1 CAATTCCCTT GTATCTCTAC ACACAG

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物Ttrp-R-2

<400> 13

1 CTCGAGTGGA GATGTGGAGT GG