本發(fā)明屬于微生物生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及1株液體發(fā)酵生產(chǎn)Lovastatin的枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）Cc-106菌株、用途和發(fā)酵生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

Lovastatin是各國(guó)公認(rèn)的降低膽固醇的理想藥劑，具有高效、低毒、安全的特點(diǎn)，它能選擇性抑制羥甲基戊二酸輔酶A（HMG-CoA）還原酶活性，并阻斷膽固醇生物合成，近年來(lái)在臨床治療方面應(yīng)用十分廣泛。從1979年，日本學(xué)者遠(yuǎn)滕章（Akira Endo）教授從紅色紅曲霉（Monascus ruber）的培養(yǎng)液中分離出一種能夠強(qiáng)力抑制膽固醇合成的活性物質(zhì)，命名為Monacolin K（莫納可林K）開(kāi)始，時(shí)隔1年，美國(guó)Albert等從土曲霉（Aspergillus terrers）中發(fā)現(xiàn)了相似的物質(zhì)，并命名為Mevinolin，現(xiàn)稱(chēng)Lovastatin。此后發(fā)現(xiàn)Lovastatin存在于包括側(cè)耳屬（Pleurotus）、莖點(diǎn)菌屬（Phoma）、青霉屬（Penicillium）、發(fā)光類(lèi)臍菇 （Omphalotus olearius）在內(nèi)的多種真菌中。

枝孢菌（Cladosporium）屬于半知菌，是一類(lèi)能夠產(chǎn)生分生孢子的霉菌；孢子分布廣泛，室內(nèi)和室外空氣中含量豐富；菌落褐綠色，經(jīng)常與曲霉、青霉混淆；但是枝孢菌的菌絲是有顏色的，菌落整體呈現(xiàn)深色。有文章和專(zhuān)利報(bào)道，枝孢菌可用于：① 纖維素酶、木質(zhì)素酶、超氧化物歧化酶、脂肪酶等酶制劑的生產(chǎn)，② 可產(chǎn)生紫杉醇等抗腫瘤、抗細(xì)菌真菌等活性代謝產(chǎn)物，③ 可用作微生物農(nóng)用殺蟲(chóng)劑等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)市場(chǎng)上Lovastatin需求日益增長(zhǎng)，生產(chǎn)Lovastatin優(yōu)良工業(yè)菌株的缺乏等的問(wèn)題。本發(fā)明的目的是提供1株高產(chǎn)Lovastatin枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）Cc-106菌株和發(fā)酵生產(chǎn)Lovastatin的方法。

本發(fā)明所述枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）Cc-106菌株，保藏編號(hào)為：CCTCC M 2016380，保藏地為：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏日期為：2016年7月7日。

Cc-106菌株的形態(tài)特征：在PDA 培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d形成較典型的菌落。菌落突點(diǎn)狀，褐綠色，菌絲厚絨毛狀，較致密，與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，不易挑起，菌落背面墨綠色（附圖1）。顯微鏡觀(guān)察菌絲細(xì)胞絲狀交織，有分隔，壁光滑或粗糙（附圖2）。分生孢子梗直立，在中部形成分枝（附圖3）；分生孢子簇生或單生，無(wú)隔或有隔，分生孢子橢圓形至梭形，單細(xì)胞大小差異較大，長(zhǎng)×寬平均大小為 5.5 μm×3.5 μm（附圖4）。

ITS rDNA基因序列分析結(jié)果表明，其長(zhǎng)度為525 bp（附圖5），與枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）的進(jìn)化距離最近（附圖6）。根據(jù)Cc-106菌株的形態(tài)特征，結(jié)合枝孢菌屬（Cladosporium）分種檢索表，將Cc-106菌株鑒定為枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）。

Cc-106菌株具有高產(chǎn)Lovastatin、產(chǎn)孢量多、培養(yǎng)簡(jiǎn)單等優(yōu)良特性。在發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為5.0~5.5，培養(yǎng)溫度為28 ℃條件下，Cc-106菌株通過(guò)液體發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化后，發(fā)酵80 h~136 h，Lovastatin產(chǎn)量可達(dá)184 mg/L左右（附圖7）；用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分離檢測(cè)發(fā)酵液中的Lovastatin，結(jié)果表明分離物的結(jié)構(gòu)、分子量與Lovastatin準(zhǔn)品一致（附圖8）。枝狀枝孢菌Cc-106菌株豐富了生產(chǎn)Lovastatin的菌種。

枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）Cc-106菌株可用于發(fā)酵生產(chǎn)Lovastatin。用接種針挑取少量菌絲，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基平皿中，活化培養(yǎng)3 d；取3個(gè)菌餅（直徑8 mm）接種于一級(jí)種子培養(yǎng)液中，搖床培養(yǎng)3 d，制得一級(jí)種子液；在二級(jí)種子培養(yǎng)液中，按10%加入一級(jí)種子液，200 r/min搖床培養(yǎng)2 d成二級(jí)種子液；在5 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)液中按20%接入二級(jí)種子液，發(fā)酵時(shí)間為80 h~136 h；發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，取發(fā)酵液1 mL，加甲醇4 mL（按1:4的比例），超聲處理20 min，50℃水浴2 h，3000 r/min離心3 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，HPLC法檢測(cè)Lovastatin產(chǎn)量，可達(dá)184 mg/L左右（附圖7）。

本發(fā)明利用豐富的霉菌自然資源，篩選到1株高產(chǎn)Lovastatin的枝狀枝孢菌Cc-106菌株，該菌株具有高產(chǎn)Lovastatin、產(chǎn)孢量大、培養(yǎng)簡(jiǎn)單等優(yōu)良特性。在發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為5.5，培養(yǎng)溫度為28℃條件下，Cc-106菌株5 L發(fā)酵罐液體發(fā)酵80 h~136 h，Lovastatin產(chǎn)量可達(dá)184 mg/L左右（附圖7）。產(chǎn)生Lovastatin的枝狀枝孢菌目前還未見(jiàn)有報(bào)道，本發(fā)明豐富了生產(chǎn)Lovastatin的菌種。

附圖說(shuō)明

圖1 Cc-106菌株P(guān)DA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d菌落正面和背面。

圖2 Cc-106菌株菌絲和分生孢子梗的顯微特征（200 X）。

圖3 Cc-106菌株分生孢子梗的顯微特征（200 X）。

圖4 Cc-106菌株菌株分生孢子顯微特征（400 X）。

圖5 Cc-106菌株ITS rDNA基因序列（525 bp）。

圖6 基于枝孢菌屬（Cladosporium）ITS rDNA基因序列建立的Cc-106菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

圖7 Cc-106菌株在5 L發(fā)酵罐中的生物量和Lovastatin產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間變化曲線(xiàn)。

圖8 Cc-106菌株發(fā)酵液Lovastatin 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)圖。

保藏聲明

枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）Cc-106菌株，保藏編號(hào)為：CCTCC M 2016380，保藏地為：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏日期為：2016年7月7日。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施方式做一個(gè)詳細(xì)的說(shuō)明。

培養(yǎng)基實(shí)施例1 高產(chǎn)Lovastatin枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）Cc-106菌株的分離、篩選和鑒定

① PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂粉2.0%，pH 5.5~6.0。用于霉菌菌株的分離純化和鑒定。

② PD培養(yǎng)液：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%，pH 5.5~6.0。用于高產(chǎn)Lovastatin霉菌菌株的篩選。

實(shí)驗(yàn)方法

2.1 霉菌菌株的分離純化

從不同生境收集的樣品（食品、土壤、水果、有機(jī)質(zhì)等）表面挑取少量菌絲接入PDA培養(yǎng)基平板表面，28℃培養(yǎng)24 h，待白色絨毛狀菌絲長(zhǎng)出后，取少許菌絲轉(zhuǎn)接于另一PDA培養(yǎng)基平板上繼續(xù)培養(yǎng)3 d產(chǎn)生孢子后，顯微鏡觀(guān)察具有霉菌的典型特征，挑取少許邊緣菌絲純化3次，得性狀均一的霉菌純菌株。將分離純化獲得的霉菌菌株編號(hào)保存于25%甘油中，置于4 ℃冰箱備用。

高產(chǎn)Lovastatin霉菌菌株的篩選

用高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)獲得的178株霉菌純菌株發(fā)酵液中Lovastatin產(chǎn)量進(jìn)行篩選。霉菌各保存菌株28℃ PDA平板培養(yǎng)3 d后，用打孔器取3個(gè)菌餅（直徑8 mm）轉(zhuǎn)接種于PD培養(yǎng)液中，28℃、200 r/min搖床培養(yǎng)5 d。取發(fā)酵液1 mL，加甲醇4 mL（按1: 4的比例），超聲處理20 min，50℃水浴2 h，3000 r/min 離心3 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，利用HPLC法檢測(cè)Lovastatin產(chǎn)量，篩選高產(chǎn)Lovastatin的青霉菌株。

目的菌株的鑒定

用鑷子挑取少量該菌株菌絲，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基平板中，活化培養(yǎng)3 d；取平皿中1菌餅（直徑8 mm）接種于新的PDA培養(yǎng)基平板上，28℃，培養(yǎng)7 d，顯微鏡觀(guān)察目的菌株的菌絲、分生孢子梗、分生孢子等的形態(tài)特征，并拍照。提取目的菌株的基因組DNA，擴(kuò)增rDNA ITS基因序列，送上海生物工程公司測(cè)序。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1高產(chǎn)Lovastatin菌株的篩選

通過(guò)分離純化從浙江省各地不同生境收集的樣品（食品、土壤、水果、有機(jī)質(zhì)等）中共獲178株霉菌純菌株。

利用高效液相（HPLC）法對(duì)178株霉菌純菌株發(fā)酵液進(jìn)行Lovastatin產(chǎn)量檢測(cè)，結(jié)果表明不同霉菌菌株Lovastatin產(chǎn)量存在顯著差異。經(jīng)篩選獲1株Lovastatin產(chǎn)量較高的編號(hào)為Cc-106菌株，Lovastatin產(chǎn)量為115.2 mg/L，Cc-106菌株分離自霉?fàn)€的番茄。

菌株的鑒定結(jié)果

Cc-106菌株的形態(tài)特征：在PDA 培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d形成較典型的菌落。菌落突點(diǎn)狀，褐綠色，菌絲厚絨毛狀，較致密，與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，不易挑起，菌落背面墨綠色（附圖1）。顯微鏡觀(guān)察菌絲細(xì)胞絲狀交織，有分隔，壁光滑或粗糙（附圖2）。分生孢子梗直立，在中部形成分枝（附圖3）；分生孢子簇生或單生，無(wú)隔或有隔，分生孢子橢圓形至梭形，單細(xì)胞大小差異較大，長(zhǎng)×寬平均大小為 5.5 μm×3.5 μm（附圖4）。

ITS rDNA基因序列分析結(jié)果表明，其長(zhǎng)度為525 bp（附圖5），與枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）的進(jìn)化距離最近（附圖6）。根據(jù)Cc-106菌株的形態(tài)特征，結(jié)合枝孢菌屬（Cladosporium）分種檢索表，將Cc-106菌株鑒定為枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）。

實(shí)施例2 枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）Cc-106菌株在5 L發(fā)酵罐中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)和Lovastatin產(chǎn)生規(guī)律

1 菌株：枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）Cc-106菌株。

培養(yǎng)基

① PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂粉2.0%、pH 5.0~5.5。用于Cc-106菌株的活化培養(yǎng)。

② PD培養(yǎng)液：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、pH 5.0~5.5。用于Cc-106菌株的一級(jí)種子培養(yǎng)。

③ 二級(jí)種子培養(yǎng)液：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、pH 5.0~5.5。用于Cc-106菌株的二級(jí)種子培養(yǎng)。

④ 發(fā)酵培養(yǎng)液：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、酵母膏0.5%、蛋白胨1.5%、NaCl 0. 2%、pH 5.0~5.5。用于Cc-106菌株發(fā)酵生產(chǎn)Lovastatin。

實(shí)驗(yàn)方法

3.1 Cc-106菌株的培養(yǎng)

用接種針挑少量Cc-106菌株菌絲，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基平皿中，活化培養(yǎng)3 d；取平皿中3個(gè)菌餅（直徑8 mm）接種于一級(jí)種子培養(yǎng)液中，搖床培養(yǎng)3 d，制得一級(jí)種子液；在二級(jí)種子培養(yǎng)液中，按10%接入一級(jí)種子液，200 r/min搖床培養(yǎng)2 d成二級(jí)種子液；在5 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)液中按20%接入二級(jí)種子液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

菌株菌絲干重的測(cè)定

1.5 mL空離心管放于在85℃的烘箱中烘干，稱(chēng)取空離心管質(zhì)量為m；每管吸取1 mL培養(yǎng)液，在4 ℃，10000 r/min離心10 min，棄上清；加無(wú)菌蒸餾水洗3次，10000 r/min離心10 min，棄上清，放入85℃烘箱中烘至恒重，稱(chēng)取質(zhì)量為M；菌絲干重質(zhì)量為M-m。每隔4 h取3 mL Cc-106菌株發(fā)酵液（設(shè)3次重復(fù)）測(cè)定菌絲干重。以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，Cc-106菌株菌絲干重為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

菌株發(fā)酵過(guò)程中Lovastatin產(chǎn)量分析

每隔4 h取發(fā)酵液1 mL（設(shè)3次重復(fù)），加甲醇4 mL（按1:4的比例），超聲處理20 min，50℃水浴2 h，3000 r/min 離心3 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，HPLC法檢測(cè)Lovastatin產(chǎn)量，以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，Cc-106菌株發(fā)酵液中Lovastatin產(chǎn)量為縱坐標(biāo)，繪制Cc-106菌株Lovastatin產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間變化曲線(xiàn)。

Cc-106菌株發(fā)酵液中Lovastatin的鑒定

用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分離檢測(cè)Cc-106發(fā)酵液中的Lovastatin結(jié)構(gòu)、分子量等。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 Cc-106菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

每隔4 h取樣測(cè)定菌絲干重，Cc-106菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖7。Cc-106菌株0 ~12 h生長(zhǎng)速度慢，為遲緩期；16 h~52 h快速生長(zhǎng)，菌體量大增，為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；發(fā)酵至56 h后，長(zhǎng)勢(shì)趨于平緩，菌體量達(dá)到最高，為穩(wěn)定生長(zhǎng)期，菌絲干重為35.6 g/L；96 h后出現(xiàn)泡沫，進(jìn)入衰亡期。

Cc-106菌株發(fā)酵液中Lovastatin產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間變化曲線(xiàn)

每隔4 h取樣用HPLC法測(cè)定Cc-106菌株發(fā)酵液Lovastatin產(chǎn)量，Lovastatin產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間的變化曲線(xiàn)見(jiàn)圖7，發(fā)酵至80 h后，發(fā)酵液中Lovastatin產(chǎn)量基本穩(wěn)定，最大值為184.1 mg/L。

Cc-106菌株發(fā)酵液中Lovastatin的鑒定

用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分離檢測(cè)發(fā)酵液中的Lovastatin，結(jié)果表明分離物結(jié)構(gòu)、分子量與Lovastatin準(zhǔn)品一致，分子式為C₂₄H₃₆O₅，分子量為404.45（附圖8）。