本發(fā)明涉及植物病理學技術(shù)。具體是一種稻曲病菌實驗室材料的常備形態(tài)及其制備與應用方法。
背景技術(shù)：
稻曲病是水稻的重要病害，發(fā)病嚴重時可給稻糧生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟損失。防病控害的有關(guān)研究，通常都要使用稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)材料。稻曲病菌在普通培養(yǎng)基上可緩慢生長成為菌絲體發(fā)達的菌落；在實驗室工作中，通常用試管斜面培養(yǎng)基將稻曲病菌培養(yǎng)成斜面菌落，并以菌落的菌絲體作為日常工作材料的常備形態(tài)。有關(guān)研究工作的出發(fā)點均以常備形態(tài)菌絲體材料為起始，通過移植常備形態(tài)菌絲體，進行擴大培養(yǎng)或進入具體項目的研究工作。這種以菌絲體作為日常工作材料的常備形態(tài)，通常較簡單方便，不過也存在某些不足，如下：
在與生長速率(或生長量)測定有關(guān)的研究工作(如生長發(fā)育的影響因素測定，藥物的抑制作用測定等)中，往往需要菌絲體的定量移植，而移植培養(yǎng)基中的菌絲體卻很難做到準確定量，至今的常規(guī)方法是需要先移植菌絲體到培養(yǎng)平板上擴大培養(yǎng)，然后用打孔器在擴大培養(yǎng)的平板菌落上打取等同直徑的菌絲塊，以此菌絲塊進行定量移植；這種定量方式不僅要增加一段擴大培養(yǎng)的程序環(huán)節(jié)，而且由于培養(yǎng)平板的厚薄不一致，以及菌落不同部位菌絲體的密集程度、生理狀態(tài)等也有差異，造成不同菌絲塊之間難以達到較高的一致性。
許多研究工作(如孢子萌發(fā)的影響因素，病害接種等)，使用的直接材料通常是薄壁分生孢子，同樣要將常備形態(tài)菌絲體移植到合適的培養(yǎng)基，先行孢子制備培養(yǎng)工作，獲得孢子后才能實施相關(guān)工作。這相當于相關(guān)工作進程需要延后，不能及時開展。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種稻曲病菌實驗室材料的常備形態(tài)及其制備與應用方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：
一種稻曲病菌實驗室材料的常備形態(tài)，是用稻曲病菌的薄壁分生孢子作日常工作的常備形態(tài)；薄壁分生孢子純凈無污染；薄壁分生孢子存放于無菌水中；薄壁分生孢子暫停生長發(fā)育，但轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基上能馬上恢復正常生長發(fā)育。
一種稻曲病菌實驗室材料的常備形態(tài)的制備與應用方法，制備與應用方法步驟如下：
1.分生孢子的預培養(yǎng)
以當前實驗室稻曲病菌的常備菌絲體為初始菌體，采用常規(guī)的液體振蕩培養(yǎng)方法，培養(yǎng)獲得含有薄壁分生孢子的培養(yǎng)產(chǎn)物。
2.分生孢子的培養(yǎng)制備
用三角瓶作培養(yǎng)器具，裝盛馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基作產(chǎn)孢培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的組分配比為：馬鈴薯100g、瓊脂20g、水1000mL；用移液器從步驟1獲得的含有分生孢子的培養(yǎng)產(chǎn)物中，吸取少量液體，移植入三角瓶內(nèi)的產(chǎn)孢培養(yǎng)基面上并涂布均勻，在合適的溫度下培養(yǎng)，直到培養(yǎng)基面上形成密布的微小菌落，菌落上形成大量的新一代薄壁分生孢子。
3.稻曲病菌材料常備形態(tài)的制備
取無菌水注入步驟2培養(yǎng)獲得的產(chǎn)孢菌落上，輕輕洗脫菌落上的孢子，獲得含有菌絲碎段的孢子液；用滅菌紗布過濾去除該孢子液中的菌絲碎段；將該孢子液進行離心沉淀，倒掉上清液，除去孢子液中混雜的菌體代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基組分；剩下的沉淀為純凈的薄壁分生孢子，以該純凈孢子作為稻曲病菌材料的常備形態(tài)；用無菌水將沉淀孢子懸浮，攪動使孢子充分分散，獲得稻曲病菌材料的常備孢子液。
4稻曲病菌材料常備形態(tài)的孢子含量標定
用無菌水將步驟3獲得的常備孢子液的孢子濃度，調(diào)配為106孢子/mL。
5稻曲病菌材料常備形態(tài)的日常存放
在無菌條件下，將步驟4標定的常備孢子液分裝到有蓋密閉的滅菌容器內(nèi)，并轉(zhuǎn)移到25℃的暗環(huán)境中存放備用。
6稻曲病菌材料常備形態(tài)的應用
將步驟5存放的稻曲病菌材料常備孢子液轉(zhuǎn)到超凈工作臺，振蕩裝存常備孢子液的容器，使薄壁分生孢子充分懸浮和分散；開蓋后用移液器定量吸取孢子液，移植到相關(guān)的工作環(huán)節(jié)或?qū)嶒灣绦蛑?；吸液移植操作完畢后回蓋密封，將剩余的常備孢子液轉(zhuǎn)回步驟5的存放處存放。
本發(fā)明的特色與優(yōu)點是：
1)常備形態(tài)的薄壁分生孢子在純水中暫停生長但能長期保持活力，一旦轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基，能馬上恢復正常生長。
2)可在相關(guān)工作中隨時應用，能為需要薄壁分生孢子的試驗環(huán)節(jié)直接提供菌體材料，可省去使用菌絲體作為常備材料時，需要反復制備培養(yǎng)孢子的工作程序，工作方便快捷。
3)用三角瓶作培養(yǎng)器具，容易獲得無污染的純凈孢子液，制備獲得的常備形態(tài)質(zhì)量較高。
4)能標定常備孢子液的孢子含量，應用時可以準確定量取用，利于技術(shù)方法標準化。
附圖說明
圖1是取本發(fā)明的稻曲病菌常備孢子液5μL，移植并點到培養(yǎng)平板上，培養(yǎng)5天后形成的菌落。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖與實施例對本發(fā)明作進一步描述。
在稻曲病的有關(guān)研究中，通常采用稻曲病菌的菌絲體材料作常備形態(tài)，每次需要薄壁分生孢子材料時，均要移植常備菌絲體到新的培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)和制備培養(yǎng)孢子。當前還未見有應用薄壁分生孢子作常備移植體的技術(shù)思想和技術(shù)應用。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，稻曲病菌的分生孢子在純水中能暫停生長發(fā)育，但轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基上能馬上恢復正常生長發(fā)育；利用此有利的的生物學特性，本發(fā)明設(shè)計稻曲病菌實驗室材料的另一種常備形態(tài)，就是以稻曲病菌的薄壁分生孢子材料作常備形態(tài)；以及該常備形態(tài)的制備與應用技術(shù)。
稻曲病菌薄壁分生孢子的制備培養(yǎng)方法，通常采用液體振蕩培養(yǎng)法，也就是將稻曲病菌的常備菌絲體移植到液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)直至產(chǎn)生孢子。液體培養(yǎng)的產(chǎn)物含有大量的菌絲團、培養(yǎng)基、和菌體代謝產(chǎn)物，產(chǎn)物混合液較為粘稠，要分離單純的孢子，技術(shù)較為困難。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，稻曲病菌具有可在固體培養(yǎng)基上產(chǎn)孢的特性，因而也可用固體培養(yǎng)方法培養(yǎng)制備孢子。固體培養(yǎng)方法獲得的產(chǎn)物中，菌絲團、培養(yǎng)基、和菌體代謝產(chǎn)物等一般含量較少，產(chǎn)物混合液較為稀薄，容易分離單純的孢子；但固體培養(yǎng)方法必需要用薄壁分生孢子本身作培養(yǎng)母體，培養(yǎng)形成新一代薄壁分生孢子。因此，本發(fā)明采取二次培養(yǎng)方式培養(yǎng)制備稻曲病菌的孢子，第一次培養(yǎng)是用實驗室常備菌絲體作初始菌體，采用常規(guī)液體培養(yǎng)方法先培養(yǎng)獲得含有薄壁分生孢子的產(chǎn)物，再以該產(chǎn)物作第二次培養(yǎng)的初始菌體，進行第二次培養(yǎng)，第二次培養(yǎng)采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)方法，培養(yǎng)獲得新一代薄壁分生孢子。
本發(fā)明的步驟1“稻曲病菌的初培養(yǎng)”即為上述的第一次培養(yǎng)；該步驟通常使用的培養(yǎng)基是馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液的配比為：馬鈴薯100g，蔗糖10g，水1000mL；需要培養(yǎng)時長為7～10天。
本發(fā)明的步驟2“分生孢子的制備培養(yǎng)”即為上述的第二次培養(yǎng)，該制備培養(yǎng)從步驟1產(chǎn)物中吸取混合液10～100μL作母體材料(具體吸取量多少可依步驟1培養(yǎng)產(chǎn)物中的孢子含量而定)。該步驟使用的培養(yǎng)基是馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的配比為：馬鈴薯100g，瓊脂20g，水1000mL)。
一般病原菌的孢子形成發(fā)育，往往需要良好的通氣條件，培養(yǎng)皿通氣性良好，因而固體培養(yǎng)的常規(guī)方法，是用培養(yǎng)皿作培養(yǎng)器具進行產(chǎn)孢培養(yǎng)；但正是由于培養(yǎng)皿通氣良好，造成培養(yǎng)皿內(nèi)材料容易污染。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在相對封閉的三角瓶內(nèi)，稻曲病菌也能正常產(chǎn)孢，而三角瓶阻止污染的效果非常好，因而采用三角瓶作培養(yǎng)器具進行產(chǎn)孢培養(yǎng)。稻曲病菌在三角瓶裝盛的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上，在溫度為28℃的條件下培養(yǎng)5天，可在培養(yǎng)基面上形成和密布微小菌落，微小菌落上已形成大量的薄壁分生孢子。
產(chǎn)孢菌落上的薄壁分生孢子可用無菌水洗滌收集，用玻棒或小毛刷等工具輕輕抹洗菌落就能將孢子洗滌釋放到無菌水中。
收集孢子的洗滌操作會導致培養(yǎng)基組分和菌落菌絲體的外泌代謝物溶解在孢子液中，這些物質(zhì)可能容易導致孢子的生長或失活，因而需要去除；可采用離心沉淀孢子方式去除這些物質(zhì)。
作為稻曲病菌材料常備形態(tài)的孢子液，孢子濃度可高可低，考慮到過高濃度可能會影響孢子的活性，以及與后續(xù)應用的需要匹配，將常備形態(tài)的孢子濃度調(diào)整在106孢子/mL較為適宜；孢子的數(shù)量用血球計數(shù)板測定。
裝存稻曲病菌材料常備孢子液的容器應采用可滅菌及可蓋封密閉的器具，如普通冷凍管或離心管等，用5mL冷凍管裝存較為實用方便；需要裝存量較多的，可用三角瓶或大冷凍管(或大離心管)。
存放環(huán)境以室溫為宜，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在溫度為25℃的暗環(huán)境存放效果好。
使用稻曲病菌材料常備孢子液，使用前需要將常備孢子液振蕩，使已沉淀的孢子重新懸浮和分散均勻。在無菌條件下用移液器取出常備孢子液，可直接用于相關(guān)的試驗工作環(huán)節(jié)，如稻曲病菌的平板培養(yǎng)、或稻曲病菌的液體培養(yǎng)等。常備孢子液中的孢子分散性好，菌體液的均勻一致性高，加上液體容易準確定量吸取，因而，本發(fā)明的稻曲病菌常備孢子液特別有利于需要定量移植菌體的培養(yǎng)工作，如測定稻曲病菌生長發(fā)育的影響因素，測定藥物的抑制作用等。
定量移植5μL本發(fā)明的常備孢子液于培養(yǎng)平板上培養(yǎng)，5天后稻曲病菌的菌落如圖1所示。
為降低實驗操作導致稻曲病菌常備形態(tài)孢子液污染的機率，應盡量減少從裝存材料常備孢子液的容器內(nèi)反復吸取液體的頻率，實際工作可按試驗設(shè)計的需要，一次性全部吸取夠整次試驗用的孢子液量，置于另外的滅菌容器內(nèi)，再從該容器內(nèi)逐一定量吸取孢子液，移植到各個培養(yǎng)平板、或三角瓶培養(yǎng)基、等相關(guān)的工作環(huán)節(jié)或?qū)嶒灣绦蛑小?/p>
實施例1
應用本發(fā)明一種稻曲病菌實驗室材料的常備形態(tài)及其制備與應用方法，培養(yǎng)制備獲得稻曲病菌菌株Uv-111以薄壁分生孢子為菌體的實驗室常備形態(tài)材料；制備與應用菌株Uv-111材料的常備形態(tài)按如下步驟實施操作：
1.分生孢子的預培養(yǎng)
以當前實驗室稻曲病菌的常備菌絲體為初始菌體，采用常規(guī)的液體振蕩培養(yǎng)方法，培養(yǎng)獲得菌株Uv-111的含有薄壁分生孢子的培養(yǎng)產(chǎn)物；
2.分生孢子的制備培養(yǎng)
用三角瓶作培養(yǎng)器具，裝盛馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基作產(chǎn)孢培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的組分配比為：馬鈴薯100g、瓊脂20g、水1000mL；用移液器從步驟1獲得的含有分生孢子的培養(yǎng)產(chǎn)物中，吸取10μL液體，移植入三角瓶內(nèi)的產(chǎn)孢培養(yǎng)基面上，用滅菌T形玻棒抹涂，使母體菌液在培養(yǎng)基面上散布均勻，轉(zhuǎn)到28℃的溫度下培養(yǎng)，5天后培養(yǎng)基面上密布大量的微小菌落，菌落上已形成大量的新一代薄壁分生孢子。
3.稻曲病菌材料常備形態(tài)的制備
取無菌水注入步驟2培養(yǎng)獲得的產(chǎn)孢菌落上，輕輕洗脫菌落上的孢子，獲得含有菌絲碎段的孢子液；用滅菌紗布過濾去除該孢子液中的菌絲碎段；將該孢子液進行離心沉淀，倒掉上清液，除去孢子液中混雜的菌體代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基組分；剩下的沉淀為純凈的薄壁分生孢子，以該純凈孢子作為菌株Uv-111材料的常備形態(tài)；用無菌水將沉淀孢子懸浮，攪動使孢子充分分散，獲得菌株Uv-111材料的常備孢子液；
4.稻曲病菌材料常備形態(tài)的孢子含量標定
用無菌水將步驟3獲得的常備孢子液的孢子濃度，調(diào)配為106孢子/mL；
5.稻曲病菌材料常備形態(tài)的日常存放
在無菌條件下，將步驟4標定的常備孢子液分裝到5mL冷凍管，封蓋后轉(zhuǎn)移到25℃的暗環(huán)境中存放備用。
6.稻曲病菌材料常備形態(tài)的應用
將步驟5存放的菌株Uv-111材料常備孢子液轉(zhuǎn)到超凈工作臺，振蕩裝存常備孢子液的冷凍管，使薄壁分生孢子充分懸浮和分散；開蓋后用移液器吸取孢子液使用；吸液操作完畢后回蓋密封，將剩余的常備孢子液轉(zhuǎn)回步驟5的存放處存放。
吸取5μL常備孢子液移植到馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基平板，28℃溫度下培養(yǎng)5天后，在移植點形成如圖1所示的清晰菌落。
吸取10μL常備孢子液移植于馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液中，28℃溫度下振蕩培養(yǎng)6天后，可獲得大量的新一代稻曲病菌孢子和菌絲團的混合液。
實施例2
應用本發(fā)明一種稻曲病菌實驗室材料的常備形態(tài)及其制備與應用方法，培養(yǎng)制備獲得稻曲病菌菌株Uv-105以薄壁分生孢子為菌體的實驗室常備形態(tài)材料；制備與應用菌株Uv-105材料的常備形態(tài)按實施例1的步驟1至步驟6實施操作，不同的只是步驟1所用的菌株是Uv-105，以及步驟3和步驟6所指的菌株是Uv-105。
吸取5μL常備孢子液移植到馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基平板，28℃溫度下培養(yǎng)5天后，在移植點形成如圖1所示的清晰菌落。
吸取10μL常備孢子液移植于馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液中，28℃溫度下振蕩培養(yǎng)6天后，可獲得大量的新一代稻曲病菌孢子和菌絲團的混合液。