本發(fā)明涉及一種病原微生物的離體快速大量擴(kuò)繁培養(yǎng)的方法，具體涉及一種離體快速大量擴(kuò)繁葡萄霜霉病原菌的方法。
背景技術(shù)：
：葡萄霜霉病(Downymildew)是由葡萄霜霉菌[Plasmoparaviticola(Berk.dtCurtis)Berl.EtdeToni]引起，生物隸屬卵菌門(mén)，卵菌綱，霜霉目，霜霉科，單軸霉屬。該病原菌為二倍體活體營(yíng)養(yǎng)型的專性寄生真菌(Wongetal.,2001)，是危害最為嚴(yán)重且影響最為廣泛的病害之一(宋潤(rùn)剛等，1998)，是一種古老的世界性真菌病害，分布于世界上所有種植葡萄的國(guó)家和地區(qū)(Wong，F(xiàn).P.,Burr，H.N,andWilcox，W.F.2001.HeterothallisminPlasmoparaviticola.PlantPathol.50:427-432)，嚴(yán)重影響著葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴(yán)重的年份可減產(chǎn)70％-80％。萄霜霉菌為專性寄生菌，無(wú)法在合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只能從活體的寄主組織中獲取養(yǎng)分進(jìn)行生長(zhǎng)，該病害潛育一般為4-12d(王忠躍，2009)，主要受寄主抗性及環(huán)境條件的影響，且在室內(nèi)培養(yǎng)條件下不易對(duì)菌原菌進(jìn)行大量繁殖，培養(yǎng)難度大，這一度成為制約該病菌研究的障礙。因此篩選確定一套較優(yōu)的培養(yǎng)條件對(duì)該病害的室內(nèi)快速純化與擴(kuò)繁意義重大。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)單易行、大量且快速擴(kuò)繁葡萄霜霉病菌的方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取葡萄霜霉病菌離體葉碟法培養(yǎng)方案，本發(fā)明離體擴(kuò)繁葡萄霜霉病菌的方法，包括下述步驟：1)在培養(yǎng)皿中加入滅菌的質(zhì)量百分濃度為1％的水瓊脂，得到葉片保濕培養(yǎng)裝置；2)選取對(duì)霜霉病菌敏感的葡萄品種，采集葡萄一年生新梢自上而下的第3-5片葉片，首先對(duì)采集的葉片進(jìn)行鏡檢，確保葉面無(wú)霜霉菌落或菌絲后，清洗干凈葉表面的灰塵，然后進(jìn)行消毒處理；3)將步驟2)消毒處理后的葡萄葉片用直徑2-2.5cm的打孔器從葉片中部打取葉圓片(繞開(kāi)主脈和較大側(cè)脈)，將葉圓片背面向上平擺在按照步驟1)所制備的保濕培養(yǎng)裝置中，每個(gè)圓葉碟上滴10-20μl滅菌的蒸餾水；4)將葡萄霜霉病菌孢子囊制備成葡萄霜霉病菌孢子囊懸浮液，將懸浮液均勻涂布在水瓊脂平板上，將涂孢子囊的平板切成2mm×2mm的瓊脂塊，在顯微鏡下將含單孢子囊的瓊脂塊倒扣到葉盤(pán)上來(lái)促使侵染，按照溫度為16℃-25℃，濕度：70％-95％，光照時(shí)間：8h-16h/天，光照強(qiáng)度20-60μmolm-2s-1的條件培養(yǎng)4-7天，在葉圓片部位形成的菌落即為葡萄霜霉病菌單個(gè)孢子囊的純培養(yǎng)物。所述方法中，步驟2)中，消毒處理的方法選用質(zhì)量百分濃度為1％的次氯酸鈉溶液處理30s-1min，再滅菌的去離子水清洗3-5遍，然后用滅菌的濾紙吸干葉片表面的水分。所述方法中，所述步驟4)中，所述質(zhì)量百分濃度為3％的水瓊脂平板的水瓊脂厚度為2～3mm。所述方法中，所述步驟4)中，葡萄霜霉病菌孢子囊懸浮液的濃度為1x105-1x108個(gè)/ml。具體的操作方法可以為挑取新長(zhǎng)的新鮮霜霉病菌轉(zhuǎn)放入2ml滅菌的離心管中制成孢子囊懸浮液，采用水瓊酯膠平板稀釋法挑取單孢子囊。用滅菌的玻璃棒蘸取一滴制備好的孢子懸浮液于載玻片，并在顯微鏡下鏡檢計(jì)數(shù)，將孢子囊濃度調(diào)節(jié)到4×10倍下每視野1個(gè)孢子囊左右，以備平板涂布用。所述方法中，所述步驟1)中，所述培養(yǎng)皿是直徑為90mm的玻璃培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿由皿底和皿蓋組成；在培養(yǎng)皿底加入滅菌的質(zhì)量百分濃度為1％的水瓊脂15ml，蓋上皿蓋，得到葉片保濕培養(yǎng)裝置。所述方法中，所述步驟4)中葡萄霜霉病菌孢子囊按照下述方法獲得：在田間采集新鮮單個(gè)霜霉病病斑的葡萄病葉，用無(wú)菌水將病葉背面和表面沖洗3遍，然后把葉片放置在按照步驟1)所形成的保濕培養(yǎng)裝置中，保持背面朝上，在葉背面的表面和培養(yǎng)皿蓋上均噴一層霧滴，然后蓋上皿蓋，以保持濕度；放入葉片的培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天，培養(yǎng)條件按照溫度為16℃-25℃，濕度：70％-95％，光照時(shí)間：8h-16h/天，光照強(qiáng)度20-60μmolm-2s-1的條件；獲得新長(zhǎng)出的葡萄霜霉病菌孢子囊。所述培養(yǎng)條件優(yōu)選為：溫度21℃，光照周期16h白天/8h黑夜，光照強(qiáng)度40。優(yōu)選的，所述對(duì)霜霉病菌敏感的葡萄品種為歐亞種里扎瑪特。所述方法中，所述步驟4)中，以載玻片作為平板，制備水瓊脂平板。這樣方便在顯微鏡下操作。本發(fā)明的方法，首先誘導(dǎo)采集的葡萄霜霉病樣在原寄生葉片上重新產(chǎn)生游動(dòng)孢子，利用水瓊酯膠平板稀釋法分離獲得純的單個(gè)孢子囊培養(yǎng)物，然后用生物專用直頭鑷子(規(guī)格Ф0.05×0.01mm)直接大量挑取游動(dòng)孢子囊轉(zhuǎn)移到1％次氯酸鈉處理過(guò)的葡萄葉圓片上，在溫度21℃，光照周期16h白天/8h黑夜，光照強(qiáng)度40的條件下進(jìn)行擴(kuò)繁，其中，使用1％的水瓊脂進(jìn)行覆蓋和分離。該方法簡(jiǎn)便易行，并且能夠快速大量獲得葡萄霜霉病菌純培養(yǎng)物。本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)上述方法分離的葡萄霜霉病菌按照同樣的方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的方法至少傳代60代。本發(fā)明可應(yīng)用于在離體情況下大量快速擴(kuò)繁葡萄霜霉病菌的單孢培養(yǎng)物的條件，為葡萄霜霉病菌遺傳分化和群體遺傳特征的研究提供了技術(shù)支持。具體實(shí)施方式為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1：離體擴(kuò)繁葡萄霜霉病原菌的方法的設(shè)計(jì)優(yōu)化及其效果葡萄霜霉病菌是專性寄生菌，無(wú)法在合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)，因此，本發(fā)明的發(fā)明人為了使其便于離體大量培養(yǎng)，滿足研究所需的數(shù)量，設(shè)計(jì)并篩選優(yōu)化了培養(yǎng)條件。本發(fā)明設(shè)計(jì)使用適于離體培養(yǎng)的葡萄品種，制作葉碟，在具有適宜濕度的保濕裝置下進(jìn)行離體培養(yǎng)。具體步驟如下：1)采集葡萄霜霉單斑病葉10個(gè)，分別放在編號(hào)為1-10的塑料自封袋中；2)在培養(yǎng)皿(由皿底和皿蓋組成)加入滅菌的水瓊脂，蓋上皿蓋，得到葉片保濕培養(yǎng)裝置；3)采集單個(gè)霜霉病病斑的葡萄病葉，用無(wú)菌水將病葉表面沖洗干凈，把葉片放置在步驟2)的保濕培養(yǎng)裝置，使葉片背面朝上，同時(shí)在葉背面和皿蓋上噴霧滴(無(wú)菌水)，蓋上皿蓋，以保持濕度；4)把步驟3)中放入葉片的保濕培養(yǎng)裝置置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d。5)選取對(duì)霜霉病菌敏感的歐亞種里扎馬特葡萄品種、紅地球葡萄品種，并選取了奧迪亞無(wú)核葡萄品種為對(duì)照。采集一年生新梢上自上而下第3-4片幼嫩葉片，將采集的葉片首先進(jìn)行鏡檢，確保葉面無(wú)霜霉菌落或菌絲后，用1％(質(zhì)量百分濃度)次氯酸鈉溶液消毒30s，用滅菌的蒸餾水沖洗3次，然后用滅菌的濾紙吸干葉片表面的水分；6)將消毒處理后的葡萄葉片用直徑2cm打孔器在葉片上打取圓葉碟(繞開(kāi)主脈和較大側(cè)脈)。最后將圓葉碟背面向上平擺在步驟2)所示的保濕培養(yǎng)裝置內(nèi)的水瓊脂上，每皿10個(gè)葉碟；7)用移液器在每個(gè)圓葉片滴20μl滅菌的蒸餾水，在用生物專用直頭鑷子(規(guī)格Ф0.05×0.01mm)，將經(jīng)步驟3)培養(yǎng)過(guò)的霜霉病葉上新產(chǎn)生的單個(gè)游動(dòng)孢子囊或單根游動(dòng)孢子孢囊梗轉(zhuǎn)放入2ml滅菌的離心管中制成孢子囊懸浮液，采用水瓊酯膠平板稀釋法挑取單孢子囊。用滅菌的玻璃棒蘸取一滴制備好的孢子懸浮液于載玻片，并在顯微鏡下鏡檢計(jì)數(shù)，將孢子囊濃度調(diào)節(jié)到4×10倍下每視野1個(gè)孢子囊左右，以備平板涂布用。轉(zhuǎn)移到步驟6)的葡萄圓葉碟上，在皿蓋(內(nèi)部)和圓葉碟上噴細(xì)水霧滴(無(wú)菌水)，然后蓋上皿蓋，用封口膜封口，以便保持培養(yǎng)皿內(nèi)部的濕度；8)將步驟7)的葡萄葉圓片按照步驟4)所述培養(yǎng)方法黑暗處理8h后用滅菌濾紙條吸走圓葉碟上部分水滴，繼續(xù)在培養(yǎng)皿蓋內(nèi)部和葡萄圓葉碟上噴細(xì)水霧滴(無(wú)菌水)，繼續(xù)按照步驟4培養(yǎng)7-10天，在葉圓碟部位形成的菌落即為葡萄霜霉病菌分離單孢的純培養(yǎng)；9)將步驟8)培養(yǎng)出的霜霉病菌，直接大量挑取游動(dòng)孢子囊到帶有無(wú)菌水滴無(wú)菌葡萄葉上，按照步驟8)進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)。對(duì)上述方法的各種條件進(jìn)行優(yōu)化，具體如下所示：a.適于離體培養(yǎng)的葡萄品種的優(yōu)化選取每個(gè)品種(紅地球，金手指、里扎馬特、奧迪亞無(wú)核、巨峰)的一年生枝條，去掉梢冠選取第3-5片葉齡一致的嫩葉作為接種材料，將新鮮的霜霉菌用無(wú)菌水稀釋成濃度為1×106個(gè)/ml的孢子囊懸浮液，按照上述的方法接種培養(yǎng)，接種后3-13d調(diào)查葉盤(pán)的發(fā)病情況，每天調(diào)查一次，記錄葉盤(pán)初始發(fā)病時(shí)間，每天產(chǎn)生的病葉數(shù)及發(fā)病級(jí)數(shù)并計(jì)算病情指數(shù)(見(jiàn)表1)。根據(jù)農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則(二)制定的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，2004)，葡萄霜霉病病害嚴(yán)重度可分為6個(gè)級(jí)別：0級(jí)：未發(fā)?。?級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉盤(pán)面積的比例小于5％；3級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉盤(pán)面積的比例為6％ˉ25％；5級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉盤(pán)面積的比例為26％ˉ50％；7級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉盤(pán)面積的比例為51％ˉ75％；9級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉盤(pán)面積的比例大于76％。根據(jù)統(tǒng)計(jì)的發(fā)病葉盤(pán)數(shù)及發(fā)病級(jí)數(shù)計(jì)算病情指數(shù)。病情指數(shù)＝100×∑(各級(jí)發(fā)病葉盤(pán)數(shù)×各級(jí)代表值)/(調(diào)查總?cè)~盤(pán)數(shù)×最高級(jí)代表值)表1不同品種對(duì)葡萄霜霉病菌結(jié)果表明，里扎馬特最適于葡萄霜霉病菌的生長(zhǎng)。b.保濕裝置的優(yōu)化本發(fā)明發(fā)明人設(shè)計(jì)了利于大量培養(yǎng)的保濕裝置(步驟2)種所述的保濕裝置)，將水瓊脂倒入培養(yǎng)皿中，并對(duì)水瓊脂的濃度和量的影響進(jìn)行了優(yōu)化。培養(yǎng)基濃度的優(yōu)化：以表1中優(yōu)選出品種為里扎馬特葡萄葉片作為接種材料，將采集的健康‘里扎馬特’嫩葉先用質(zhì)量百分濃度1％的次氯酸鈉溶液消毒30s，后用無(wú)菌水沖洗2-3次，避免次氯酸鈉殘留影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用打孔器(直徑15mm)將采集的葉片打成圓葉盤(pán)(盡量繞開(kāi)主脈和較大的側(cè)脈)，葉面向下貼放于不同濃度(0.5％、1％、1.5％及2％)的水瓊脂培養(yǎng)基上(15ml)，在葉盤(pán)中心位置滴15μl葡萄霜霉病菌孢子囊懸浮液。接種后，將其放于培養(yǎng)箱內(nèi)(21℃，24h黑暗)培養(yǎng)，24h后取出，用滅菌濾紙條吸去多余菌液后用封口膜封口，繼續(xù)培養(yǎng)(21℃，16h光照/8h黑暗)5d，然后分別刮取每個(gè)葉碟新鮮菌絲于2ml離心管中，然后滴加1ml無(wú)菌水制成孢子囊懸浮液，最后取10ul制成臨時(shí)玻片，在顯微鏡20倍物鏡下觀察每個(gè)葉碟上產(chǎn)生的孢子囊的數(shù)量和畸形孢子囊數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。表2不同培養(yǎng)基濃度對(duì)葡萄霜霉病菌孢子囊的影響培養(yǎng)基濃度(％)釋放孢子囊數(shù)(個(gè)/mL)X105畸形孢子囊數(shù)(個(gè)/mL)0.50.00830811.0351011.51.00114520.995189不同培養(yǎng)基量的優(yōu)化：根據(jù)表1和表2的結(jié)果，采用上述接種和培養(yǎng)方法，將葡萄霜霉病菌接種到不同量的含有葡萄葉片的水瓊脂培養(yǎng)皿中，調(diào)查方法同上，結(jié)果見(jiàn)表3.表3不同培養(yǎng)基量對(duì)葡萄霜霉病菌孢子囊的影響培養(yǎng)基量(mL)釋放孢子囊數(shù)(個(gè)/mL)X105畸形孢子囊數(shù)(個(gè)/mL)100.009125151.02567200.989147c.培養(yǎng)條件的優(yōu)化在河北廊坊中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊葡萄霜霉病菌病葉，對(duì)此病樣病原菌進(jìn)行單孢純化及擴(kuò)繁培養(yǎng)條件的優(yōu)化，首先，優(yōu)化了步驟7)，在培養(yǎng)的時(shí)候，將帶有單孢的水瓊脂塊覆蓋在培養(yǎng)裝置中的圓葉片上，這樣既方便了純化，也具有保濕作用，促進(jìn)了擴(kuò)繁，具體步驟如下所述：1、采集葡萄霜霉單斑病葉10個(gè)，分別放在編號(hào)為1-10的塑料自封袋中；2、在培養(yǎng)皿(由皿底和皿蓋組成)加入滅菌的質(zhì)量百分濃度為1％的水瓊脂15ml，蓋上皿蓋，得到葉片保濕培養(yǎng)裝置；3、采集單個(gè)霜霉病病斑的葡萄病葉，用無(wú)菌水將病葉表面沖洗干凈，把葉片放置在步驟2的保濕培養(yǎng)裝置，使葉片背面朝上，同時(shí)在葉背面和皿蓋上噴霧滴(無(wú)菌水)，蓋上皿蓋，以保持濕度；4、把步驟3中放入葉片的保濕培養(yǎng)裝置置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)條件設(shè)定為：溫度分別為16℃、21℃、25℃，濕度：70％、80％、95％以上，光照時(shí)間：8h，12h，16h，光照強(qiáng)度：60、40、20；5、選取對(duì)霜霉病菌敏感的歐亞種里扎馬特葡萄品種。采集一年生新梢上自上而下第3-4片幼嫩葉片，將采集的葉片首先進(jìn)行鏡檢，確保葉面無(wú)霜霉菌落或菌絲后，用1％(質(zhì)量百分濃度)次氯酸鈉溶液消毒30s，用滅菌的蒸餾水沖洗3次，然后用滅菌的濾紙吸干葉片表面的水分；6、將消毒處理后的葡萄葉片用直徑2cm打孔器在葉片上打取圓葉碟(繞開(kāi)主脈和較大側(cè)脈)。最后將圓葉碟背面向上平擺在步驟2所示的保濕培養(yǎng)裝置內(nèi)的質(zhì)量百分濃度為1％的水瓊脂上，每皿10個(gè)葉碟；7、用移液器在每個(gè)圓葉片滴20μl滅菌的蒸餾水，在用生物專用直頭鑷子(規(guī)格Ф0.05×0.01mm)，將經(jīng)步驟3培養(yǎng)過(guò)的霜霉病葉上新產(chǎn)生的單個(gè)游動(dòng)孢子囊或單根游動(dòng)孢子孢囊梗放入2ml滅菌的離心管中制成孢子囊懸浮液，采用水瓊酯膠平板稀釋法挑取單孢子囊。用滅菌的玻璃棒蘸取一滴制備好的孢子懸浮液于載玻片，并在顯微鏡下鏡檢計(jì)數(shù)，將孢子囊濃度調(diào)節(jié)到4×10倍下每視野1個(gè)孢子囊左右，以備平板涂布用。以載玻片作為平板，將融化的3％的水瓊脂培養(yǎng)基均勻的倒在載玻片上(注意，在制作平板時(shí)，培養(yǎng)基厚度應(yīng)在2～3mm，過(guò)厚影響其透光性，過(guò)薄培養(yǎng)基很快變干又難以從載玻片上轉(zhuǎn)移至葡萄葉盤(pán)上)；待平板上的培養(yǎng)基凝固后，用移液器取上述制備好的孢子囊懸浮液10μl滴在平板左側(cè)，用無(wú)菌玻璃棒自左向右將懸浮液均勻涂布在3％的水瓊脂平板上，用滅菌的接種刀將涂孢子囊的平板切成2mm×2mm的小瓊脂塊，在顯微鏡下將含單孢子囊的瓊脂塊倒扣到葉盤(pán)上來(lái)促使侵染，按照步驟4的條件進(jìn)行培養(yǎng)4-7d，在葉圓片部位形成的菌落即為葡萄霜霉病菌單個(gè)孢子囊的純培養(yǎng)物；8、將步驟7的葡萄葉圓片按照步驟4所述培養(yǎng)方法黑暗處理8h后用滅菌濾紙條吸走圓葉碟上部分水滴，繼續(xù)在培養(yǎng)皿蓋內(nèi)部和葡萄圓葉碟上噴細(xì)水霧滴(無(wú)菌水)，繼續(xù)按照步驟4培養(yǎng)4-10天，在葉圓碟部位形成的菌落即為葡萄霜霉病菌分離單孢的純培養(yǎng)；9、將步驟8培養(yǎng)出的霜霉病菌，直接大量挑取游動(dòng)孢子囊到帶有無(wú)菌水滴無(wú)菌葡萄葉上，置于步驟4的培養(yǎng)條件，按照步驟8進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)；10、顯微鏡下鏡檢步驟9形成的菌落；11、利用OMEGA公司的真菌基因組DNA提取試劑盒(D3390-02)進(jìn)行提取步驟10培養(yǎng)好的菌落DNA，以GeneBank中已報(bào)到的P.viticola的ITS序列(DQ665668.1)為模版設(shè)計(jì)引物(序列1)PvITS-F：CCACACCTAAAAACTTTCCACG，(序列2)PvITS-R：TTGCCTGATATCAGGTCCAACTG，以所提取的菌落基因組DNA為模板，用引物PvITS-F/PvITS-R進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置水為模板的陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存。擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物由上海生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，將所得的序列與NCBI登記的葡萄霜霉病菌序列(序列號(hào)：DQ665668.1)進(jìn)行比對(duì)，同源性均為98％，因此證明新形成的菌落為葡萄霜霉病菌落，該菌落分離自田間采集的病樣，從而說(shuō)明田間采集的病樣確為霜霉病樣。12、結(jié)果發(fā)現(xiàn)，光照培養(yǎng)箱溫度達(dá)到16℃時(shí)，培養(yǎng)6～7天才會(huì)產(chǎn)生新菌絲，生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)；培養(yǎng)箱溫度為21℃時(shí)，培養(yǎng)約4天可產(chǎn)生出新菌絲；培養(yǎng)箱溫度達(dá)到25℃時(shí)，培養(yǎng)4～5天可以長(zhǎng)出新菌絲，但由于溫度較高，培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度難以達(dá)到理想狀態(tài)，接種葉盤(pán)上的水膜也容易揮發(fā)。因此溫度選定為21℃恒溫培養(yǎng)。病原菌侵染嫩葉的相對(duì)濕度要求在70％～80％以上，且卵孢子在有水膜或水滴覆蓋的情況下易萌發(fā)產(chǎn)生孢子囊，實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)培養(yǎng)箱內(nèi)相對(duì)濕度達(dá)到95％～100％時(shí)葉盤(pán)表面水膜保存時(shí)間較長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)情況較好。光照因素對(duì)病原菌的生長(zhǎng)也有一定的影響，光照梯度設(shè)置8h，12h，16h，在溫度、濕度一致的情況下，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)箱內(nèi)光照時(shí)間8h和12h時(shí)，培養(yǎng)約6天可產(chǎn)生新菌絲，且菌絲較為稀疏；培養(yǎng)箱內(nèi)光照達(dá)到16h時(shí)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)約4天即可產(chǎn)生新菌絲，且菌絲生長(zhǎng)狀況較好。孢囊梗、孢子囊的形成至少需要4h黑暗條件，因此選出光照培養(yǎng)最適條件為16h光照/8h黑暗，光照強(qiáng)度40。培養(yǎng)條件的優(yōu)化不同光照時(shí)間的篩選根據(jù)上述的處理方法，將接種好霜霉病菌分別置于光照梯度為8h，12h，16h，在溫度、光照強(qiáng)度、濕度一致的情況下(21℃、40Lux，95％以上)，培養(yǎng)4-13d，接種后3-13d，在3d后開(kāi)始調(diào)查葉盤(pán)的發(fā)病情況，每天調(diào)查一次，記錄葉盤(pán)初始發(fā)病時(shí)間，每天產(chǎn)生的病盤(pán)數(shù)及發(fā)病級(jí)數(shù)并計(jì)算病情指數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表4.表4不同光照時(shí)間對(duì)葡萄霜霉病侵染及產(chǎn)孢能力的影響光照時(shí)間(h)潛育期(d)產(chǎn)孢數(shù)量(個(gè)/mL)x105(10d)病情指數(shù)(10d)860.08955.84±1.26c1271.2357.48±8.45b1641.6488.34±5.09a不同光照強(qiáng)度的篩選根據(jù)上述的處理方法，將接種好霜霉病菌分別置于光照梯度為20Lux、40Lux、60Lux，在光照時(shí)間、溫度、濕度一致的情況下(16h、21℃、95％以上)，培養(yǎng)4-13d，接種后3-13d，在3d后開(kāi)始調(diào)查葉盤(pán)的發(fā)病情況，每天調(diào)查一次，記錄葉盤(pán)初始發(fā)病時(shí)間，每天產(chǎn)生的病盤(pán)數(shù)及發(fā)病級(jí)數(shù)并計(jì)算病情指數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表5。表5不同光照度對(duì)葡萄霜霉病侵染及產(chǎn)孢能力的影響光照度(Lux)潛育期(d)產(chǎn)孢數(shù)量(個(gè)/mL)x105(10d)病情指數(shù)(10d)2060.89835.64±7.34b4071.6782.48±2.49a60100.0091.35±0.05c不同濕度的篩選根據(jù)上述的處理方法，將接種好霜霉病菌分別置于濕度為70％、80％、95％以上，在光照時(shí)間、溫度、光照強(qiáng)度一致的情況下(16h、21℃、40Lux、)，培養(yǎng)4-13d，接種后3-13d，在3d后開(kāi)始調(diào)查葉盤(pán)的發(fā)病情況，每天調(diào)查一次，記錄葉盤(pán)初始發(fā)病時(shí)間，每天產(chǎn)生的病盤(pán)數(shù)及發(fā)病級(jí)數(shù)并計(jì)算病情指數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表6。表6.不同濕度對(duì)葡萄霜霉病菌侵染及產(chǎn)孢能力的影響濕度(％)潛育期(d)產(chǎn)孢數(shù)量(個(gè)/mL)x105病情指數(shù)(10d)7061.10545.54±6.34c8061.34278.68±6.89b95以上41.65288.34±7.51a根據(jù)上述的處理方法，將接種好霜霉病菌分別置于濕度16℃、21℃、25℃培養(yǎng)箱中，在光照時(shí)間、濕度、光照強(qiáng)度一致的情況下(16h、95％以上、40Lux、)，培養(yǎng)4-13d，在3d后開(kāi)始調(diào)查葉盤(pán)的發(fā)病情況，每天調(diào)查一次，記錄葉盤(pán)初始發(fā)病時(shí)間，每天產(chǎn)生的病盤(pán)數(shù)及發(fā)病級(jí)數(shù)并計(jì)算病情指數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表7。表7.不同溫度對(duì)葡萄霜霉病菌侵染及產(chǎn)孢能力的影響溫度(℃)潛育期(d)產(chǎn)孢數(shù)量(個(gè)/mL)x105病情指數(shù)(10d)1680.00319.35±1.05c2141.67385.48±5.49a2570.78674.14±1.09b本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)上述方法分離的葡萄霜霉病菌按照同樣的方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的方法至少傳代60代。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3