本發(fā)明涉及一種具有解磷和生防雙功能黑曲霉及微生物制劑及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

磷是生物重要的營養(yǎng)元素之一，植物的光合作用和體內(nèi)的生化過程都必須有磷參加。增施磷肥是一種“高投入，低產(chǎn)出”的途徑，不僅造成了磷素資源的大量浪費，嚴(yán)重影響了磷肥工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，而且經(jīng)濟(jì)效益下降，環(huán)境污染加重。世界上絕大部分農(nóng)業(yè)土壤缺磷(總磷不缺，有效磷缺)，我國約有三分之二的農(nóng)田嚴(yán)重缺磷。土壤中的磷素通常是以磷酸鹽的形式存在，可分為難溶性和易溶性兩種，其中難溶性磷酸鹽不能被植物所直接利用，約占土壤磷酸鹽總量的95％-99％。農(nóng)業(yè)中雖然長期施用磷肥，但磷在土壤中極易形成作物難以利用的固定態(tài)磷，導(dǎo)致磷的當(dāng)季利用率很低，即使加上磷肥的后效，其利用率一般也不超過25％。

大量研究表明，土壤中許多微生物具有溶磷的作用，能將植物難以吸收利用的磷素物質(zhì)轉(zhuǎn)化為植物可以吸收利用形態(tài)，提高作物產(chǎn)量，具有這種能力的微生物被稱為解磷微生物。有報道指出，某些解磷菌不但能促進(jìn)植物吸收磷元素還具有防治土傳病害的能力。這類解磷菌接種后在植物根際大量生長繁殖，在一段時間內(nèi)成為植物根際的優(yōu)勢菌。由于它們的繁殖，抑制或減少了病原微生物的繁殖機(jī)會，有的具有拮抗病原微生物的作用。同時，有的解磷微生物能分泌抗菌素，抑制或殺死致病真菌和細(xì)菌，起到了減輕作物病害的功效。

由此可以看出有些菌種不僅有高效的解磷作用，也同樣具備對植物病原菌的抑制作用。解磷菌的篩選主要來源于植物根際土壤，但就目前應(yīng)用來看尚不普遍。從土壤的形成來看，土壤是由巖石經(jīng)過長期風(fēng)化作用形成的。巖石風(fēng)化形成的礦物質(zhì)顆粒是形成土壤的基礎(chǔ)，即成土母質(zhì)，在成土母質(zhì)中含有原來巖石成分的一些營養(yǎng)元素，如磷、鉀及中、微量元素等。成土母質(zhì)在重力、水、風(fēng)等搬運下改變位置，又在生物、氣候、地形、時間等綜合因素下形成土壤。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提出了一種具有解磷和生防雙功能黑曲霉及微生物制劑及應(yīng)用，篩選具備抗病能力的高效解磷微生物，為生產(chǎn)相應(yīng)的微生物肥料和微生物農(nóng)藥提供優(yōu)良菌種。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：

一種具有解磷和生防雙功能黑曲霉菌株，2016年8月25日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO：M 2016427，分類命名：黑曲霉(Aspergillus niger)HY30。

一種包含上述菌株的微生物制劑。

上述微生物制劑中黑曲霉的活菌量至少為10⁸CFU/g。

上述微生物制劑的應(yīng)用，具有解磷功能，也具有防治土傳病害的作用。

本發(fā)明產(chǎn)生的有益效果為：本發(fā)明的微生物制劑不僅具備很強(qiáng)的解磷能力，而且對一些常見的植物病原菌也有明顯的抑制作用，可以廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)起到肥藥雙效的作用。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為HY30在PDA平板上的形態(tài)圖。

圖2為HY30在顯微鏡下的形態(tài)圖。

圖3為HY30抑制小麥赤霉病原菌效果圖。

圖4為HY30抑制黃瓜枯萎病原菌效果圖。

圖5為HY30抑制西瓜枯萎病原菌效果圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明所涉及的培養(yǎng)基如下：

解磷菌初篩培養(yǎng)基：葡萄糖10g，NaCl 0.4g，KCl 0.4g，MgSO₄·7H₂O 0.4g，NH₄Cl 1.5g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，Ca₃(PO₄)₂5g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH 7.0～7.2，121℃滅菌30min。

解磷菌復(fù)篩培養(yǎng)基：葡萄糖2g，蔗糖2g，NaCl 0.4g，KCl 0.4g，MgSO₄·7H₂O 0.4g，NH₄Cl 1.5g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，Ca₃(PO₄)₂ 5g，蒸餾水1000mL，pH 7.0，121℃滅菌30min。

黑曲霉液體培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖10g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，蒸餾水1000mL，pH 7.0，121℃滅菌30min。

黑曲霉固體發(fā)酵培養(yǎng)基：麥麩60g，米糠40g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，K₂HPO₄ 0.2g，蒸餾水100mL，pH自然，121℃滅菌30min。

實施例1：解磷微生物的初步篩選

采集小麥赤霉病發(fā)病較輕的土壤，稱取10g，置于盛有100mL無菌水的三角瓶中，28℃、180rpm震蕩20min，靜置10min，得到土壤懸浮液。將此懸浮液稀釋至合適濃度涂布于解磷菌初篩培養(yǎng)基平板上，28℃倒置培養(yǎng)，每隔2d觀察，將有溶磷圈的菌落挑出，用劃線法重新接種于解磷菌初篩培養(yǎng)基平板上進(jìn)行純化，重復(fù)2～3次，純化至唯一菌落。將純化后有溶磷效果的菌株接種于解磷菌初篩培養(yǎng)基平板上，28℃倒置培養(yǎng)7d，每隔2d測定溶磷圈與菌落的直徑。測量得到的溶磷圈直徑d、菌落直徑D及其d/D值作為表征溶磷菌的相對溶磷能力的初步指標(biāo)。共得到了5株解磷菌，具體結(jié)果見表1。

表1各菌株溶磷圈直徑與菌落直徑比值

由表1可看出，通過平板涂布法篩選，以及劃線法純化得到的有解磷效果的菌株，溶磷圈都很明顯，溶磷圈直徑與菌落直徑比值均大于1.5。其中HY27、HY29和HY30溶磷圈比值大于2，初步判斷這三株菌溶磷效果可能更好。

實施例2：解磷微生物的搖瓶復(fù)篩

試驗菌株：初步篩選獲得的5株解磷菌。

配制解磷菌復(fù)篩培養(yǎng)基，分裝于250mL三角瓶中，每瓶50mL，滅菌后備用。將初篩得到的5株解磷菌活化后，用一支斜面制成均勻的5mL菌懸液，每個三角瓶接種1mL菌懸液，接種3個三角瓶，同時做3個不接種對照，置28℃搖床(130r/min)振蕩培養(yǎng)7d后備用。將發(fā)酵液中加入無磷活性碳脫色離心15min(8000r/min)，留上清液。吸取上清液10mL于50mL容量瓶中，用水稀釋至30mL，加2，6—二硝基酚指示劑2滴，用碳酸氫鈉或稀鹽酸調(diào)至溶液呈微黃色后加入鉬銻抗顯色劑5mL，搖勻，定容至刻度。在20℃～25℃下放置30min后在分光光度計上用波長700nm比色，以蒸餾水為參比液調(diào)零點，測量吸光度。最后根據(jù)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線求出有效磷的含量，具體結(jié)果見表2。

磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：吸取含磷5μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液0，2，4，6，8，10mL，分別加入到50mL容量瓶中，加水約至30mL，再加空白試驗定容后的溶液5.00mL，調(diào)節(jié)酸度，使溶液剛好至淡黃色，然后加鉬銻抗試劑5.00mL，用水定容，30min后，進(jìn)行比色，此時比色溶液磷的濃度分別為0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0μg/mL。以吸光度為縱坐標(biāo)，磷濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行直線回歸計算回歸方程。

表2解磷菌溶解磷酸三鈣的效果

表2與表1比較可知，有些菌株在平板上有較好的溶磷效果，如HY27，但在搖瓶培養(yǎng)時溶磷效果相對較弱。說明有些菌株在平板與溶液中溶磷能力不一致。但是，HY30在固體平板和搖瓶液體中溶解磷酸三鈣的效果都非常突出，發(fā)酵液有效磷含量高達(dá)732.353μg/mL。

培養(yǎng)液pH測定：培養(yǎng)前調(diào)節(jié)pH至7.0的無機(jī)磷培養(yǎng)液在進(jìn)行復(fù)篩搖床培養(yǎng)后pH成酸性，篩選所得的5株解磷菌均為產(chǎn)酸菌。pH變化值與解磷能力有一定關(guān)系。一般情況，產(chǎn)酸多的菌株，解磷能力也較強(qiáng)。

實施例3：解磷菌HY30的鑒定

菌落形態(tài)：在PDA培養(yǎng)基上生長快，經(jīng)24小時，即有菌落出現(xiàn)，72小時后孢子豐富；菌落黑色，呈絲絨狀，中心略凸起，菌落反面略帶黃色。顯微鏡下，菌叢呈黑褐色，菌絲發(fā)達(dá)，分生孢子頭狀如“菊花”，具有兩層孢子小梗，分生孢子為球形，呈黑、黑褐色。圖1和圖2分別是HY30在PDA平板上和顯微鏡下的形態(tài)。

HY30菌株分子生物學(xué)鑒定：采用分子生物學(xué)的方法測得HY30的18SrDNA

序列，并在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blast比對。結(jié)合菌落形態(tài)和18SrDNA比對結(jié)果，申請人確定HY30菌株是黑曲霉(Aspergillus niger)。該菌株已在2016年8月25日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO：M 2016427，分類命名：黑曲霉(Aspergillus niger)HY30。

實施例4：黑曲霉HY30菌劑制備方法

HY30液體菌劑制備：從低溫冰箱取出黑曲霉HY30保藏試管，將菌株接種至斜面培養(yǎng)基活化培養(yǎng)48h。500mL三角瓶中裝入100mL黑曲霉液體培養(yǎng)基，滅菌冷卻備用。挑取活化好的HY30接入黑曲霉液體培養(yǎng)基，放入搖床(160r/min)28℃下培養(yǎng)72h，即制成HY30液體菌劑。

HY30固體菌劑制備：用淺盤裝入黑曲霉固體發(fā)酵培養(yǎng)基，厚度2～5cm。滅菌冷卻后接入制備好的HY30液體菌劑，接種量為1％～5％。將淺盤在25℃～28℃下靜置培養(yǎng)4d～5d，即制成HY30固體菌劑。

實例5黑曲霉HY30的抑菌實驗

病原菌：針對糧食、蔬菜、水果，分別選擇了小麥赤霉病菌、黃瓜枯萎病菌和西瓜枯萎病菌作為代表病原菌進(jìn)行抑菌實驗。

將病原菌接種在PDA平板上于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h進(jìn)行活化。將活化后的植物病原菌分別接種在空白PDA培養(yǎng)基平板中央，在距中央周圍3cm等距離四點用接種針分別接上3點黑曲霉HY30和1點未知真菌，重復(fù)3皿。以在PDA培養(yǎng)基中央接種病原菌，不接拮抗菌作為對照，于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，待對照中的病原菌菌絲生長至培養(yǎng)皿壁邊緣時，觀察HY30對病原菌的作用，并用直尺測量HY30對病原菌的抑菌圈半徑大小(HY30菌落中心到病原菌菌落邊緣最小距離)。實驗結(jié)果見表3。

表3 HY30對三種病原菌抑菌效果

從圖3-5可以看出，未知真菌和小麥赤霉病原菌無抑制作用，兩個菌落長到了一起。而黑曲霉HY30對小麥赤霉病原菌、黃瓜枯萎病原菌和西瓜枯萎病原菌均有很明顯的抑制作用。本研究篩選到的黑曲霉HY30，不僅具備很強(qiáng)的解磷能力，而且對一些常見的植物病原菌也有明顯的抑制作用。因此，HY30能起到肥藥雙效的作用，可以廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。