本發(fā)明涉及飼料添加劑，特別涉及一種高總脂肪酸含量、高EPA含量的高山被孢霉菌體，其生產(chǎn)方法及作為飼料添加劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多不飽和脂肪酸可分為ω-3，ω-6和ω-9等系列，ω-3系列PUFAs主要有α-亞麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)以及二十二碳六烯酸(DHA)。EPA具有抗凝血、抗癌、抗炎、防心血管病、降血脂等特殊生理功能，在醫(yī)藥保健品、食品和飼料行業(yè)均有較多的應(yīng)用。EPA的生物來源主要包括海洋魚類和微生物發(fā)酵生產(chǎn)，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)EPA原料豐富、周期短、價(jià)格便宜、占地面積小、不受氣候影響等，越來越受關(guān)注。目前通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)EPA的商業(yè)化產(chǎn)品是杜邦公司報(bào)道的New Harvest^TM EPA oil和salmon，所用菌株是解脂耶氏酵母基因工程菌。高山被孢霉油脂含量豐富，野生型高山被孢霉需在低溫下能合成EPA，高山被孢霉MA-oPpFADS17是通過在野生型高山被孢酶中過表達(dá)來源于寄生疫霉的ω-3脂肪酸脫飽和酶，最終得到成功表達(dá)候選ω-3脂肪酸脫飽和酶的高山被孢霉重組菌株。將其發(fā)酵條件優(yōu)化后，使得該菌株在廉價(jià)碳氮源的培養(yǎng)基中可以合成大量的EPA，將其制得的菌粉作蛋雞飼料的添加劑，可以大幅提高蛋黃DHA含量，改善飲食中ω-3和ω-6比例。

高山被孢霉應(yīng)用于飼料添加劑屬于現(xiàn)有技術(shù)，例如中國發(fā)明專利申請(qǐng)CN104630077A公開的高山被孢霉CCFM442及其在生產(chǎn)菌體飼料添加劑中的應(yīng)用。其中，根據(jù)其說明書的記載，干燥菌體中PUFAs含量占總脂肪酸含量的45.76％，其中AA含量占總脂肪酸含量24.43％，EPA含量占總脂肪酸含量的6.09％。將該菌體飼料添加劑(即干燥菌體)以基礎(chǔ)飼料總重量計(jì)5％與基礎(chǔ)飼料混合造粒飼喂蛋雞，所產(chǎn)雞蛋蛋黃中的DHA占總脂肪酸為1.06％，AA占總脂肪酸比例為3.26％，即，AA含量占全蛋0.32％，DHA含量占全蛋0.11％，均高于普通雞蛋。

然而，仍然期望通過對(duì)飼料的改進(jìn)而進(jìn)一步提高DNA在雞蛋中的含量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種能夠提高雞蛋中DNA含量的飼料添加劑。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的原理是通過優(yōu)化高山被孢霉的菌株選擇和發(fā)酵工藝，實(shí)現(xiàn)在常溫條件下大量積累EPA的高山被孢霉，以應(yīng)用于飼料添加劑。

為此，本發(fā)明提供高山被孢霉在飼料添加劑中應(yīng)用，所述高山被孢霉是重組高山被孢霉(Mortierella alpina)MA-oPpFADS17-4(它同樣被命名為CCFM698)。

高山被孢霉CCFM698是通過過表達(dá)來源于寄生疫霉的ω-3脫飽和酶oPpFADS17基因的重組高山被孢霉，根據(jù)中國發(fā)明專利申請(qǐng)CN 201610184669X(一株過表達(dá)來源于寄生疫霉的ω-3脫飽和酶的重組高山被孢霉、其構(gòu)建方法及應(yīng)用)的記載，該菌株于2016年1月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC No.11820。

中國發(fā)明專利申請(qǐng)CN 201610184669X所述的高山被孢霉MA-oPpFADS17-4也被命名為高山被孢霉CCFM698。

在本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述高山被孢霉是干燥菌體。

在本發(fā)明中，所述干燥菌體的總脂肪酸含量為以干燥菌體重量計(jì)30％-40％，其中EPA含量為以總脂肪酸重量計(jì)24％或以上。

所述干燥菌體在飼料中的用量是基礎(chǔ)飼料總重量的0.5-1.5％。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還通過改進(jìn)高山被孢霉(Mortierella alpina)CCFM698的發(fā)酵工藝，以實(shí)現(xiàn)在常溫條件下大量積累EPA。

為此，本發(fā)明提供高山被孢霉菌體的生產(chǎn)方法，所述方法包括以下步驟：

(1)將活化兩代的高山被孢霉CCFM698菌株按1％重量的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后在溫度28℃的條件下，以200rpm的轉(zhuǎn)速發(fā)酵7天；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下：

余量為水；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為6.0-8.0；

所述磷酸鹽選自磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉中的一種；

(2)將步驟(1)中發(fā)酵完成的菌體用200目的標(biāo)準(zhǔn)樣篩過濾后，清水洗滌，獲得濕菌體；

(3)將步驟(2)得到的濕菌體烘干后得到所述干燥菌體。

在本發(fā)明中，所述豆粕提取物的制備方法是：以重量計(jì)，取豆粕1份，加入5份水，煮沸并保持沸騰10-30min；所得產(chǎn)物用雙層紗布過濾，棄去濾渣，所得濾液冷卻至室溫，即為所述豆粕提取物。

在本發(fā)明中，豆粕應(yīng)當(dāng)理解為大豆提取豆油后得到的副產(chǎn)品，其呈不規(guī)則碎片狀，顏色為淺黃色至淺褐色，味道具有烤大豆香味。豆粕是市場上能夠購買獲得的產(chǎn)品，例如中儲(chǔ)糧鎮(zhèn)江糧油有限公司銷售的豆粕產(chǎn)品。

在本發(fā)明中，步驟(3)的烘干可以是在將濕菌體置于50-60℃下5-10小時(shí)實(shí)現(xiàn)的。

可選地，步驟(3)中，可以以冷凍干燥替代烘干步驟從而得到所述高山被孢霉的凍干菌體；所述的冷凍干燥是用冷凍干燥機(jī)實(shí)現(xiàn)的，其程序?yàn)椋簩窬w至于-40℃下4h；然后在-30℃下冷凍15h；然后在-10℃下冷凍15h；然后在10℃下放置4h；最后在20℃下放置4h，得到所述凍干菌體。

本發(fā)明的高山被孢霉(Mortierella alpina)CCFM698菌體飼料添加劑的脂肪酸組成合理，EPA含量很高，能用于生產(chǎn)有利于食用者身體健康的高DHA雞蛋。該添加劑具有使用安全性高、PUFAs含量高、脂肪酸組成合理等優(yōu)點(diǎn)，在不降低產(chǎn)蛋性能參數(shù)的情況下，使ω-3和ω-6比例維持在合理范圍內(nèi)，對(duì)人體健康產(chǎn)生有益作用。

此外，本發(fā)明的菌體飼料添加劑安全性高，該菌種的野生型菌株已通過正式安全性評(píng)估，其生產(chǎn)安全性得到保證。所得飼料添加劑的EPA含量在常溫下可達(dá)占總脂24％，總脂肪酸含量達(dá)菌體總重40％，是目前文獻(xiàn)報(bào)道的在常溫下EPA產(chǎn)量最高的高山被孢霉菌株。

另一方面，本發(fā)明對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行了改進(jìn)，該菌體飼料添加劑生產(chǎn)所用培養(yǎng)基為廉價(jià)葡萄糖和豆粕，二者市場價(jià)格較低且容易獲得，因此生產(chǎn)成本低，且該菌體飼料添加劑的發(fā)酵是在常溫而非低溫下進(jìn)行的，發(fā)酵成本大大降低。

【附圖說明】

圖1為實(shí)施例7中0.5％高山被孢霉菌體補(bǔ)充喂養(yǎng)期各主要脂肪酸的變化；

圖2為實(shí)施例7中1％高山被孢霉菌體補(bǔ)充喂養(yǎng)期各主要脂肪酸的變化；

圖3為實(shí)施例7中1.5％高山被孢霉菌體補(bǔ)充喂養(yǎng)期各主要脂肪酸的變化。

【具體實(shí)施方式】

通過下述實(shí)施例將能夠更好地理解本發(fā)明。

在本發(fā)明中，如無特殊說明，用于表示濃度的“％”均為重量百分比，或“份”均為重量份。

本發(fā)明使用的培養(yǎng)設(shè)備是上海知楚儀器有限公司銷售的振蕩培養(yǎng)箱(型號(hào):ZQZY-70B)。

在本發(fā)明中，冷凍干燥步驟是使用LABCONCO公司的凍干機(jī)(型號(hào)：FreeZone 6)實(shí)現(xiàn)的。

實(shí)施例1：發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的確定

將高山被孢霉CCFM698以1％接種量接種到活化培養(yǎng)基中，在28℃200rpm轉(zhuǎn)速條件下活化36h，活化兩代；

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖、5g/L酵母提取物(Yeast extract)、10g/L硝酸鉀、1g/L磷酸二氫鉀、0.25g/L七水合硫酸鎂，采用1M HCl和1M NaOH水溶液將pH調(diào)節(jié)至6.0，再在溫度115℃下滅菌20min，得到所述的活化培養(yǎng)基。

將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖設(shè)置為40g/L、50g/L、60g/L，以野生型高山被孢霉(MA)作為對(duì)照，其他條件不變，將實(shí)驗(yàn)菌株高山被孢霉CCFM698(即高山被孢霉CCFM698)在28℃條件下常溫發(fā)酵7天，測定發(fā)酵培養(yǎng)基的不同葡萄糖濃度對(duì)菌體中脂肪酸含量。

所述的脂肪酸測定方法參考文獻(xiàn)：

Wang L,Chen W,Feng Y,et al.Genome characterization of the oleaginous fungus Mortierella alpina.Plos One,2011,6(12):e28319.

在總脂肪酸測定之后，對(duì)相應(yīng)脂肪酸含量進(jìn)行加和后可得所述的多不飽和脂肪酸含量。

表1不同初始葡萄糖濃度對(duì)高山被孢霉CCFM698發(fā)酵產(chǎn)EPA的影響

注：表中數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS中的Tukey HSD方法進(jìn)行著性分析。

可見，該菌株在常溫即可積累大量的EPA，和野生型菌株相比具有很大優(yōu)勢。此外，通過對(duì)比可見，50g/L的葡萄糖濃度最適宜該菌株產(chǎn)EPA。

實(shí)施例2：培養(yǎng)基中碳源種類的確定

將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的50g/L葡萄糖分別用玉米淀粉、可溶性淀粉、馬鈴薯淀粉及重量比為1:1的葡萄糖與可溶性淀粉的混合物替代，培養(yǎng)基中的其他組成和培養(yǎng)條件不變，將高山被孢霉CCFM698在28℃條件下常溫發(fā)酵7天，測定樣品中脂肪酸含量。

表2不同碳源種類對(duì)高山被孢霉CCFM698發(fā)酵產(chǎn)EPA的影響

從表格中可以看出，高山被孢霉CCFM698可以不同程度利用多種淀粉作底物進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)脂，其中玉米淀粉和葡萄糖的效果最佳，EPA產(chǎn)量最高達(dá)到1g/L以上，均顯著高于其他碳源。

盡管玉米淀粉、可溶性淀粉和馬鈴薯淀粉都是淀粉，但馬鈴薯淀粉和可溶性淀粉相較于葡萄糖則表現(xiàn)出顯著降低了總脂肪酸(TFA)和EPA產(chǎn)量的結(jié)果，而玉米淀粉和葡萄糖能夠一定程度地提高總脂肪酸和EPA產(chǎn)量。

實(shí)施例3：有機(jī)氮源的確定

在培養(yǎng)基中碳源為50g/L的葡萄糖的前提下，對(duì)比酵母萃取物(有機(jī)氮源Yeast extract，價(jià)格昂貴)與豆粕提取物(廉價(jià))對(duì)高山被孢霉產(chǎn)脂的影響，其中酵母萃取物濃度為5g/L，豆粕提取物濃度為50g/L，其他條件不變，將實(shí)驗(yàn)菌株高山被孢霉CCFM698在28℃條件下常溫發(fā)酵7天，測定樣品中脂肪酸含量。

表3不同有機(jī)氮源對(duì)高山被孢霉CCFM698發(fā)酵產(chǎn)EPA的影響

結(jié)果表明，相比昂貴的酵母萃取物，豆粕提取物作為有機(jī)氮源使用時(shí)，不僅價(jià)格低廉，對(duì)菌體生長有較大促進(jìn)作用，使得EPA的產(chǎn)量進(jìn)一步得到大幅提高，達(dá)到1545 mg/L。

然后，進(jìn)一步設(shè)定豆粕汁的不同添加濃度，分別為10g/L、30g/L、50g/L、70g/L，其他條件不變，將實(shí)驗(yàn)菌株高山被孢霉CCFM698在28℃條件下常溫發(fā)酵7天，測定樣品中脂肪酸含量。

表4不同豆粕汁濃度對(duì)高山被孢霉CCFM698發(fā)酵產(chǎn)EPA的影響

可以看出，10-70g/L的豆粕提取物對(duì)高山被孢霉菌株發(fā)酵產(chǎn)EPA均能表現(xiàn)出顯著的有利影響，其中以30-50g/L更為突出。50g/L的豆粕提取物濃度適宜該菌株發(fā)酵產(chǎn)脂，EPA產(chǎn)量最高，達(dá)到1.9g/L。

實(shí)施例4：生產(chǎn)本發(fā)明的菌體飼料添加劑

(1)發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)

為獲得足夠量的菌飼料添加劑，進(jìn)一步使用發(fā)酵罐培養(yǎng)，培養(yǎng)設(shè)備是瑞士比歐生物工程公司的65L氣升發(fā)酵罐(型號(hào)：SSTC-2005-11)。與搖瓶培養(yǎng)不同的是，在發(fā)酵罐培養(yǎng)中，為了適應(yīng)發(fā)酵罐工藝而提高了接種量，將活化兩代的高山被孢霉MA-oPpFADS17菌株按10％的接種量(種子原液)接種到高密度發(fā)酵培養(yǎng)基中，維持pH6.0，通氣量0.75vvm，在溫度28℃的室溫條件下發(fā)酵7天。

所用的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基為：50g/L葡萄糖、15g/L豆粕、5g/L硝酸鉀、2g/L磷酸二氫鉀、0.25g/L七水合硫酸鎂。

其中，為了適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的需求、降低原料成本和菌體制備成本，在本實(shí)施例中，有機(jī)氮源選用豆粕而非豆粕提取物，而對(duì)濕菌體的后續(xù)干燥操作采用常規(guī)的菌體烘干法。

(2)菌體收集和飼料添加劑制備

將步驟(1)中發(fā)酵完成的菌體，用200目的標(biāo)準(zhǔn)樣篩過濾后，清水洗滌直到濾液澄清透明，獲得濕菌體，在60℃進(jìn)行烘干，同時(shí)用凍干法制備小樣以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件，分別測定烘干品和凍干品的效果。

測定所得凍干菌體(試樣)與烘干菌體(即飼料添加劑)的指標(biāo)一致，含水量小于1％(幾乎為絕干物料)，測得總脂肪酸的絕對(duì)含量達(dá)6.17g/L，EPA絕對(duì)含量達(dá)1.4g/L。

測定菌體飼料添加劑的脂肪酸組成與含量如下：

表7菌體飼料添加劑的脂肪酸組成與含量

可見，本發(fā)明得到的飼料添加劑中的脂肪酸種類較為豐富，PUFAs(包括C18:2/C18:3/C20:2/C20:3/C22:3/C20:4/C20:5)含量占總脂肪酸含量51.64％，其中具有重要生理功能的EPA含量占總脂肪酸含量達(dá)24％左右，顯著高于CN104630077A中的6.09％，ω-3和ω-6比例提高到約1:1，也顯著優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)。

實(shí)施例5：蛋雞飼喂試驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)記載，普通雞蛋中的ω-3PUFAs主要為DHA，約占全蛋總重量的0.04％，這與DHA的日推薦攝入量(140-160mg)相比，相差較多。

因此，期望通過改善蛋雞飼料以提高雞蛋中DHA含量。

為了更有效地說明該菌體飼料添加劑的實(shí)用性，先將菌體飼料添加劑分別以基礎(chǔ)飼料總重量計(jì)0.5％或1％或1.5％與基礎(chǔ)飼料混合，然后采取了一系列動(dòng)物試驗(yàn)加以驗(yàn)證。以下為動(dòng)物試驗(yàn)的具體實(shí)施方式和結(jié)果分析：

(1)菌體飼料的制備

基礎(chǔ)飼料由安徽榮達(dá)禽業(yè)股份有限公司提供(基礎(chǔ)飼料的脂肪酸組成見下表)，分別按基礎(chǔ)飼料總重計(jì)0.5％或1％或1.5％的比例添加實(shí)施例6的菌體飼料添加劑，制備得到EPA菌體飼料。

表8基礎(chǔ)飼料的脂肪酸組成表

(2)試驗(yàn)分組與設(shè)計(jì)

選取25周雞齡蛋雞，共60只，隨機(jī)分為4組，每組15只蛋雞，組別分別記為A、B、C、D組。其中A組為對(duì)照組，B、C、D組為實(shí)驗(yàn)組，并另外購買兩組不同來源的市售雞蛋作為對(duì)照。

將實(shí)驗(yàn)期分為適應(yīng)期、試驗(yàn)期、洗脫期。在適應(yīng)期7d各個(gè)組都用基礎(chǔ)飼料飼喂。在試驗(yàn)期，A組以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，B、C、D三組分別為低劑量(以基礎(chǔ)飼料重量計(jì)0.5％)、中劑量(以基礎(chǔ)飼料重量計(jì)1％)、高劑量(以基礎(chǔ)飼料重量計(jì)1.5％)菌體飼料添加劑飼料飼喂，飼喂周期為兩個(gè)星期。洗脫期10d喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料。

(3)飼養(yǎng)管理方法

飼喂試驗(yàn)在安徽榮達(dá)禽業(yè)股份有限公司進(jìn)行，對(duì)蛋雞采取圈養(yǎng)方式，光照14h/天(可補(bǔ)充光照)，飼料120g/只/天、水足量。每日在8:00、16:00兩次喂料，每日16:00撿蛋并標(biāo)號(hào)。

(4)雞蛋脂肪酸測定

雞蛋脂肪酸分析方法參考文獻(xiàn)：

Wang L,Chen W,Feng Y,et al.Genome characterization of the oleaginous fungus Mortierella alpina.Plos One,2011,6(12):e28319.

(5)結(jié)果及分析

補(bǔ)充期末期各個(gè)組別的蛋黃脂肪酸組成如下表所示。

表9蛋黃中脂肪酸含量測定結(jié)果

從表中數(shù)據(jù)可以看出，以基礎(chǔ)飼料重量計(jì)，1.5％添加量的菌體飼料添加劑得到的雞蛋中蛋黃DHA積累量最大，且與對(duì)照相比，含量約為A組的兩倍。菌體飼料中EPA大量轉(zhuǎn)化為了蛋黃的DHA，說明蛋黃具有富集DHA的作用。

根據(jù)表9記載的雞蛋中各個(gè)脂肪酸指標(biāo)的絕對(duì)含量(單位mg/g)，換算成一個(gè)雞蛋DHA含量約為120mg，遠(yuǎn)高于CN104630077A中記載的的含量(70mg)。考慮到本發(fā)明所采用的A組飼喂的基礎(chǔ)飼料中的ALA含量較高(見表8)，因此A組雞蛋的DHA含量很高，因此另外從市場上隨機(jī)買了兩種雞蛋作為對(duì)照。與市售雞蛋相比，采用含有本發(fā)明的菌體飼料添加劑的基礎(chǔ)飼料的蛋雞的雞蛋，其DHA含量提高約四倍，效果顯著。

此外，如圖1-3所示，隨著補(bǔ)充喂養(yǎng)的時(shí)間增加，不同補(bǔ)充量的組別達(dá)到峰值的時(shí)間不同。從圖1可以看出，0.5％補(bǔ)充喂養(yǎng)組的蛋黃DHA含量在兩周的補(bǔ)充期內(nèi)呈現(xiàn)緩慢的上升趨勢，DHA含量增加較少；而在圖2中，1％補(bǔ)充喂養(yǎng)組的蛋黃在第十天左右達(dá)到峰值，之后有緩慢下降的趨勢，DHA含量高于0.5％的補(bǔ)充喂養(yǎng)組；從圖3中可以得到1.5％補(bǔ)充喂養(yǎng)組的蛋黃DHA含量的變化情況為，前五天積累較少，第5到9天DHA含量呈現(xiàn)快速上升的趨勢，第9到14天上升趨于緩慢，經(jīng)過兩周的補(bǔ)充，蛋黃中DHA含量達(dá)到了7.31mg/g，約120mg/個(gè)雞蛋，比市售雞蛋的DHA含量超出了四倍左右(市售雞蛋的DHA含量約為30mg)。

其中，每個(gè)雞蛋中DHA含量的計(jì)算方法為：DHA(mg/egg)＝蛋黃總脂肪酸含量占重量百分比×蛋黃中DHA占總脂百分比×1000×蛋黃重量

綜上所述，本發(fā)明的菌體飼料添加劑能用于生產(chǎn)高DHA雞蛋，且安全性高。所得飼料添加劑的EPA含量在常溫下可達(dá)占總脂24％，總脂肪酸含量達(dá)菌體總重40％。

飼喂含有本發(fā)明的飼料添加劑的飼料的蛋雞，所產(chǎn)雞蛋DHA含量達(dá)到了約120mg/個(gè)雞蛋，顯著高于現(xiàn)有技術(shù)。