本發(fā)明屬于生物飼料領(lǐng)域，具體涉及一種利用產(chǎn)油酵母同時(shí)生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂的方法。

背景技術(shù)：

單細(xì)胞蛋白(亦稱微生物蛋白)，是指細(xì)菌、酵母、霉菌和微藻等在適宜條件下利用各種基質(zhì)培養(yǎng)單細(xì)胞或絲狀微生物的個(gè)體而獲得的菌體蛋白。單細(xì)胞蛋白所含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)極為豐富，并且氨基酸組分齊全，賴氨酸等必需氨基酸含量較高，還富含維生素，已成為飼料蛋白補(bǔ)充途徑之一。

飼料油，也即動(dòng)物飼料中所添加的油脂(以豬油為主)，主要通過(guò)混入飼料供牲畜使用。飼料油可提高牲畜日糧的能量水平，并有助于牲畜對(duì)飼料中其它脂溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和利用，進(jìn)而提高牲畜生產(chǎn)性能以及飼料的利用效率。我國(guó)的動(dòng)物飼料油原料來(lái)源比較復(fù)雜，它更多的來(lái)源于生產(chǎn)動(dòng)植物油的副產(chǎn)品，如油脂廠下腳料、城市餐飲排放的地溝油、酸化油、腸油等，因而在農(nóng)藥殘留、重金屬、霉菌毒素等標(biāo)準(zhǔn)上較難達(dá)標(biāo)。微生物油脂，又稱單細(xì)胞油脂，是指由油脂微生物在一定條件下合成并儲(chǔ)存在菌體內(nèi)的甘油脂，其脂肪酸組成與一般的植物油相似，主要為棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸等，此外也含有微量γ-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸等功能性油脂。因此，微生物油脂可作為飼料油的替代品。

產(chǎn)油酵母，是指能夠利用碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭鳛樘荚捶e累大量油脂的酵母。通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基組成，如培養(yǎng)基碳氮比，可以控制產(chǎn)油酵母細(xì)胞中的油脂含量。因此，利用產(chǎn)油酵母同時(shí)產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂在為牲畜提供蛋白質(zhì)的同時(shí)也可以提供油脂，節(jié)省了飼料油的添加。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種利用產(chǎn)油酵母同時(shí)生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂的方法。本發(fā)明解決了為飼料中提供所需蛋白質(zhì)和解決飼料油原料來(lái)源的問(wèn)題。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種利用產(chǎn)油酵母同時(shí)生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂的方法，包括如下步驟：

(1)酵母種子液的制備：取產(chǎn)油酵母接種于YEPD液體培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)，得到產(chǎn)油酵母種子液；

(2)產(chǎn)油酵母同時(shí)發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂：取步驟(1)中得到的產(chǎn)油酵母種子液按8％～12％(v/v)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)，得到發(fā)酵液；

(3)取步驟(2)中得到的發(fā)酵液，離心，棄去上清，得到的酵母菌體在104～106℃條件下烘干至恒重即得到含微生物油脂的單細(xì)胞蛋白產(chǎn)品；

(4)酵母細(xì)胞中蛋白含量的測(cè)定：取步驟(3)中得到的單細(xì)胞蛋白產(chǎn)品100～200mg于180～200℃下消化，用凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白含量；

(5)酵母細(xì)胞中油脂含量的測(cè)定：按每克干菌體加入10mL濃度為3.5～4.5mol/L HCl，于80～100℃處理30～60min；冷卻后按體積比2:1加入氯仿和甲醇的混合溶劑進(jìn)行萃取，收集氯仿層，減壓蒸餾去除氯仿，得到微生物油脂；微生物油脂在50～60℃的真空干燥箱中干燥2～4h，稱重；得到的油脂重量占干酵母重量的比值即為酵母的油脂含量(％)。

步驟(1)中所述的產(chǎn)油酵母為發(fā)酵性絲孢酵母(Trichosporon fermentans)、斯達(dá)氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)或皮狀絲孢酵母(Trichosporon cutaneum)等油脂酵母；優(yōu)選為發(fā)酵性絲孢酵母；

發(fā)酵性絲孢酵母(CICC1368)購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，斯達(dá)氏油脂酵母(AS 2.1560)和皮狀絲孢酵母(AS 2.0571)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。

步驟(1)中所述的YEPD液體培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸膏10g/L，pH 6.0；115℃滅菌20min；

步驟(1)中所述的恒溫培養(yǎng)的條件為27～29℃，150～170rpm恒溫培養(yǎng)23～25h；優(yōu)選為28℃，160rpm恒溫培養(yǎng)24h；

步驟(2)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源50～100g/L，蛋白胨1.3～41.0g/L，酵母膏0.5～14.7g/L，MgSO₄·7H₂O為0.3～0.5g/L，KH₂PO₄為1.8～2.2g/L，MnSO₄·H₂O為0.002～0.004g/L，Cu₂SO₄·5H₂O為0.0001～0.0002g/L，pH 6.0～7.0；115℃滅菌20min；

優(yōu)選的，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源50～60g/L，蛋白胨1.3～41.0g/L，酵母膏0.5～14.7g/L，MgSO₄·7H₂O為0.3～0.5g/L，KH₂PO₄為1.8～2.2g/L，MnSO₄·H₂O為0.002～0.004g/L，Cu₂SO₄·5H₂O為0.0001～0.0002g/L，pH 6.0～7.0；115℃滅菌20min；

更優(yōu)選的，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源50～60g/L，蛋白胨1.3～41.0g/L，酵母膏0.5～14.7g/L，MgSO₄·7H₂O為0.4g/L，KH₂PO₄為2.0g/L，MnSO₄·H₂O為0.003g/L，Cu₂SO₄·5H₂O為0.0001g/L，pH 6.0～7.0；115℃滅菌20min；

所述的碳源為葡萄糖、木糖、粗甘油或木質(zhì)纖維素水解液等；優(yōu)選為葡萄糖或粗甘油；

步驟(2)中所述的接種量?jī)?yōu)選為10％(v/v)；

步驟(2)中所述的恒溫培養(yǎng)的條件為27～29℃，150～170rpm恒溫培養(yǎng)5～7d；優(yōu)選為28℃，160rpm恒溫培養(yǎng)5d；

步驟(3)中所述的離心的條件為3000～6000rpm下離心5～10min；優(yōu)選為4000rpm下離心5min。

步驟(3)中所述的烘干優(yōu)選是在105℃條件下烘干；

一種含微生物油脂的單細(xì)胞蛋白產(chǎn)品，通過(guò)上述制備方法制備得到。

所述的單細(xì)胞蛋白產(chǎn)品中，蛋白含量為8.2％～52.1％，微生物油脂含量為9.7％～56.3％。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

本發(fā)明提供利用產(chǎn)油酵母生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂的方法和工藝：菌種選取-培養(yǎng)基的制備-菌種種子液的制備-菌種同時(shí)發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂。產(chǎn)油酵母同時(shí)生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂的工藝條件：碳源濃度50～100g/L，培養(yǎng)時(shí)間5天，初始pH 6.0，蛋白胨1.3～41.0g/L，酵母膏0.5～14.7g/L，發(fā)酵后的蛋白含量為8.2％～52.1％，微生物油脂含量為9.7％～56.3％。本發(fā)明通過(guò)利用產(chǎn)油酵母同時(shí)生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂，提高了粗甘油的附加值，同時(shí)也開(kāi)辟了新的飼料蛋白和飼料油源。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

本實(shí)施例是一種利用產(chǎn)油酵母同時(shí)生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂的方法，具體步驟如下：

(1)稱取14.51g麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，溶于100mL蒸餾水中，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝試管，115℃高壓滅菌20min。

(2)將購(gòu)買于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心的發(fā)酵性絲孢酵母菌種(保藏號(hào)：CICC 1368)接種于麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)2～3天，然后放于4℃條件下保存。

(3)YEPD液體培養(yǎng)基：稱取葡萄糖2g，蛋白胨1g，酵母浸膏1g，溶于100mL蒸餾水中，用5M NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0。115℃滅菌20min。

(4)發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取葡萄糖60g，蛋白胨41.0g，酵母膏14.7g，MgSO₄·7H₂O為0.4g，KH₂PO₄為2.0g，MnSO₄·H₂O為0.003g，Cu₂SO₄·5H₂O為0.0001g，溶于1000mL蒸餾水中，用5M NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0。115℃滅菌20min。

(5)取一環(huán)4℃保存的斜面種子于含50mL步驟(3)所得的YEPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃，160rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24h，得到種子液。

(6)取5mL步驟(5)中所得種子液接種于含45mL步驟(4)所述發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃，160rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)120h，得到發(fā)酵液。

(7)取步驟(6)中得到的發(fā)酵液，4000rpm下離心5min，棄去上清，得到的酵母菌體在105℃條件下烘干至恒重即得到含一定微生物油脂的單細(xì)胞蛋白產(chǎn)品。單細(xì)胞蛋白產(chǎn)品的產(chǎn)量為19g/L；得到的單細(xì)胞蛋白產(chǎn)品的蛋白含量為50.0％，微生物油脂含量為9.7％；蛋白產(chǎn)量為9.5g/L；油脂產(chǎn)量為1.8g/L。見(jiàn)表1。

單細(xì)胞蛋白產(chǎn)品的產(chǎn)量是指每L發(fā)酵液中獲得的單細(xì)胞蛋白產(chǎn)品的質(zhì)量；

蛋白產(chǎn)量是指每L發(fā)酵液中含有的蛋白的質(zhì)量；

油脂產(chǎn)量是指每L發(fā)酵液中含有的油脂的質(zhì)量。

實(shí)施例2

本實(shí)施例是一種利用產(chǎn)油酵母同時(shí)生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂的方法，具體步驟如下：

(1)稱取14.51g麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，溶于100mL蒸餾水中，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝試管，115℃高壓滅菌20min。

(2)將購(gòu)買于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心的發(fā)酵性絲孢酵母菌種(保藏號(hào)：CICC 1368)接種于麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)2～3天，然后放于4℃條件下保存。

(3)YEPD液體培養(yǎng)基：稱取葡萄糖2g，蛋白胨1g，酵母浸膏1g，溶于100mL蒸餾水中，用5M NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0。115℃滅菌20min。

(4)發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取葡萄糖60g，蛋白胨8.9g，酵母膏3.2g，MgSO₄·7H₂O為0.4g，KH₂PO₄為2.0g，MnSO₄·H₂O為0.003g，Cu₂SO₄·5H₂O為0.0001g，溶于1000mL蒸餾水中，用5M NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0。115℃滅菌20min。

(5)取一環(huán)4℃保存的斜面種子于含50mL步驟(3)所得的YEPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃，160rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24h，得到種子液。

(6)取5mL步驟(5)中所得種子液接種于含45mL步驟(4)所述發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃，160rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)120h，得到發(fā)酵液。

(7)取步驟(6)中得到的發(fā)酵液，4000rpm下離心5min，棄去上清，得到的酵母菌體在105℃條件下烘干至恒重即得到含一定微生物油脂的單細(xì)胞蛋白產(chǎn)品。單細(xì)胞蛋白產(chǎn)品的產(chǎn)量為19.1g/L；得到的單細(xì)胞蛋白產(chǎn)品的蛋白含量為29.1％，微生物油脂含量為25.9％；蛋白產(chǎn)量為5.5g/L；油脂產(chǎn)量為4.9g/L。見(jiàn)表1。

實(shí)施例3

本實(shí)施例是一種利用產(chǎn)油酵母同時(shí)生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂的方法，具體步驟如下：

(1)稱取14.51g麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，溶于100mL蒸餾水中，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝試管，115℃高壓滅菌20min。

(2)將購(gòu)買于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心的發(fā)酵性絲孢酵母菌種(保藏號(hào)：CICC 1368)接種于麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)2～3天，然后放于4℃條件下保存。

(3)YEPD液體培養(yǎng)基：稱取葡萄糖2g，蛋白胨1g，酵母浸膏1g，溶于100mL蒸餾水中，用5M NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0。115℃滅菌20min。

(4)發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取粗甘油50g，蛋白胨33.5g，酵母膏11.9g，MgSO₄·7H₂O為0.4g，KH₂PO₄為2.0g，MnSO₄·H₂O為0.003g，Cu₂SO₄·5H₂O為0.0001g，溶于1000mL蒸餾水中，用5M NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0。115℃滅菌20min。

(5)取一環(huán)4℃保存的斜面種子于含50mL步驟(3)所得的YEPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃，160rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24h，得到種子液。

(6)取5mL步驟(5)中所得種子液接種于含45mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃，160rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)120h，得到發(fā)酵液。

(7)取步驟(6)中得到的發(fā)酵液，4000rpm下離心5min，棄去上清，得到的酵母菌體在105℃條件下烘干至恒重即得到含微生物油脂的單細(xì)胞蛋白產(chǎn)品。單細(xì)胞蛋白產(chǎn)品的產(chǎn)量為9.4g/L；所得單細(xì)胞蛋白產(chǎn)品的的蛋白含量為52.1％，油脂含量為10.6％；蛋白產(chǎn)量為4.9g/L；油脂產(chǎn)量為1.0g/L。見(jiàn)表2。

實(shí)施例4

本實(shí)施例是一種利用產(chǎn)油酵母同時(shí)生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂的方法，具體步驟如下：

(1)稱取14.51g麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，溶于100mL蒸餾水中，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝試管，115℃高壓滅菌20min。

(2)將購(gòu)買于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心的發(fā)酵性絲孢酵母菌種(保藏號(hào)：CICC 1368)接種于麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)2～3天，然后放于4℃條件下保存。

(3)YEPD液體培養(yǎng)基：稱取葡萄糖2g，蛋白胨1g，酵母浸膏1g，溶于100mL蒸餾水中，用5M NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0。115℃滅菌20min。

(4)發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取粗甘油50g，蛋白胨2.8g，酵母膏1g，MgSO₄·7H₂O為0.4g，KH₂PO₄為2.0g，MnSO₄·H₂O為0.003g，Cu₂SO₄·5H₂O為0.0001g，溶于1000mL蒸餾水中，用5M NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0。115℃滅菌20min。

(5)取一環(huán)4℃保存的斜面種子于含50mL步驟(3)所得的YEPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃，160rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24h，得到種子液。

(6)取5mL步驟(5)中所得種子液接種于含45mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃，160rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)120h，得到發(fā)酵液。

(7)取步驟(6)中得到的發(fā)酵液，4000rpm下離心5min，棄去上清，得到的酵母菌體在105℃條件下烘干至恒重即得到含微生物油脂的單細(xì)胞蛋白產(chǎn)品。單細(xì)胞蛋白產(chǎn)品的產(chǎn)量為8.3g/L；所得單細(xì)胞蛋白產(chǎn)品的的蛋白含量為27.8％，油脂含量為14.4％。蛋白產(chǎn)量為2.3g/L；油脂產(chǎn)量為1.2g/L。見(jiàn)表2。

不同發(fā)酵條件下發(fā)酵性絲孢酵母利用葡萄糖同時(shí)生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂，具體步驟參照實(shí)施例1，結(jié)果如表1所示。

不同發(fā)酵條件下發(fā)酵性絲孢酵母利用粗甘油同時(shí)生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂，具體步驟參照實(shí)施例3，結(jié)果如表2所示。

表1不同發(fā)酵條件下發(fā)酵性絲孢酵母利用葡萄糖同時(shí)生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂

注：條件1：葡萄糖60g/L，蛋白胨41.0g/L，酵母膏14.7g/L，MgSO₄·7H₂O為0.4g/L，KH₂PO₄為2.0g/L，MnSO₄·H₂O為0.003g/L，Cu₂SO₄·5H₂O為0.0001g/L，pH 6.5。除蛋白胨和酵母膏濃度不同外，條件2-5與條件1的培養(yǎng)基組成相同；條件2中蛋白胨和酵母膏濃度分別為8.9和3.2g/L；條件3中蛋白胨和酵母膏濃度分別為3.4和1.2g/L；條件4中蛋白胨和酵母膏濃度分別為2.1和0.8g/L；條件5中蛋白胨和酵母膏濃度分別為1.6和0.6g/L。

表2不同發(fā)酵條件下發(fā)酵性絲孢酵母利用粗甘油同時(shí)生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂

注：條件1：粗甘油50g/L，蛋白胨33.5g/L，酵母膏11.9g/L，MgSO₄·7H₂O為0.4g/L，KH₂PO₄為2.0g/L，MnSO₄·H₂O為0.003g/L，Cu₂SO₄·5H₂O為0.0001g/L，pH 6.5。除蛋白胨和酵母膏濃度不同外，條件2～5與條件1的培養(yǎng)基組成相同。條件2中蛋白胨和酵母膏濃度分別為7.2和2.6g/L；條件3中蛋白胨和酵母膏濃度分別為2.8和1.0g/L；條件4中蛋白胨和酵母膏濃度分別為1.7和0.6g/L；條件5中蛋白胨和酵母膏濃度分別為1.3和0.5g/L。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。