本發(fā)明屬于微生物新品種及發(fā)酵工藝領(lǐng)域，具體涉及一種菌核青霉及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

菌核青霉屬于青霉屬。為分布很廣的子囊菌綱中的一屬，其菌落在CA上25℃培養(yǎng)12天，直徑25-30mm，有的分離物可達(dá)45mm，放射狀皺紋較多或較少；質(zhì)地絨狀或帶絮狀，因菌核較多而兼顆粒狀；分生孢子結(jié)構(gòu)有限或局部較多，分生孢子面藍(lán)綠色或暗灰綠色，近于豆綠色、暗常春藤綠色或淡灰橄欖色；菌絲體往往有白色變?yōu)殚偌t或橙黃色；滲出液較多，帶紅色，也有的分離物缺乏；反面暗紅，褐紅或橘紅色；可溶性色素類似較淡的反面顏色，偶有缺乏者。

咖啡堿是一種黃嘌呤生物堿化合物，是一種中樞神經(jīng)興奮劑，能夠暫時(shí)的驅(qū)走睡意并恢復(fù)精力，臨床上用于治療神經(jīng)衰弱和昏迷復(fù)蘇。我國(guó)是咖啡堿生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó),咖啡堿及N-甲基黃嘌呤常用作食品和藥品。通過(guò)微生物/酶法生產(chǎn)或降解相關(guān)N-甲基黃嘌呤,獲得高附加值產(chǎn)物,在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前,咖啡堿可降解菌株的種類較少。篩選高效咖啡堿降解菌株并克隆其相關(guān)基因,將為開(kāi)發(fā)微生物降解咖啡堿技術(shù),解決相關(guān)領(lǐng)域因應(yīng)用咖啡堿帶來(lái)的日益嚴(yán)重的環(huán)境與健康問(wèn)題,奠定基礎(chǔ)。

綠茶中咖啡堿含量高是長(zhǎng)期以來(lái)眾所周知的問(wèn)題，用現(xiàn)有方法降低其咖啡堿會(huì)導(dǎo)致綠茶的風(fēng)味和口感發(fā)生巨大的改變，使其不再是綠茶，而且會(huì)破壞綠茶中的其他成分。

酯型兒茶素亦稱“復(fù)雜兒茶索”。一類茶兒茶素。主要有EGCG和ECG。其分子結(jié)構(gòu)中比簡(jiǎn)單兒茶索多結(jié)合1～2個(gè)沒(méi)食子?；?。含量占兒茶素總量的60％～75％，茶葉干重的12％～15％。具有較強(qiáng)的苦澀味和收斂性，是茶湯的主體呈味成分。易被氧化，在呼吸代謝中是氫的中間傳遞體。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(簡(jiǎn)稱EGCG)是從茶葉中分離得到的兒茶素類單體，是茶多酚生物活性的主要成份。

單寧酶(Tannase,EC3.1.1.20)，又叫單寧?；饷?Tannin Acyl Hydrolase)，屬于誘導(dǎo)酶，可水解沒(méi)食子酸單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒(méi)食子酸。是酶解轉(zhuǎn)溶“茶乳酪”的專一酶類，近年來(lái)伴隨著茶飲料的迅猛發(fā)展而得到深入的研究(蘇二正等，2004)。單寧酶主要由絲狀真菌產(chǎn)生，如曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillvium)、根霉屬(Rhizopus)、毛霉屬(Mucor)等均可產(chǎn)單寧酶，某些酵母和細(xì)菌也可以生產(chǎn)單寧酶(谷文等，2010)。

單寧酶在食品、啤酒、葡萄酒、飼料加工和精細(xì)化工等行業(yè)都有著廣泛的應(yīng)用。美國(guó)食品與藥物管理局已確定單寧酶為安全產(chǎn)品，在日本單寧酶已通過(guò)FAD批準(zhǔn)應(yīng)用。另外，單寧酶可將五倍子單寧降解為沒(méi)食子酸(gallic acid，GA)，而后者是一種重要的化工原料，應(yīng)用范圍很廣，用量大，現(xiàn)己成為市場(chǎng)暢銷產(chǎn)品。通過(guò)單寧酶水解單寧生產(chǎn)GA，與化學(xué)方法相比具有產(chǎn)率高、反應(yīng)條件溫和、生成的污染物少等優(yōu)點(diǎn)，符合綠色化工生產(chǎn)的要求(楊亞力等，2002)。

雖然單寧酶的用途廣泛，但是由于生產(chǎn)提純過(guò)程復(fù)雜，產(chǎn)量很小所以市場(chǎng)價(jià)格昂貴，這樣就使單寧酶的應(yīng)用受到限制。單寧酶屬于誘導(dǎo)酶，主要是利用微生物發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)，國(guó)內(nèi)外研究的焦點(diǎn)集中在對(duì)產(chǎn)單寧酶的菌株篩選和誘變改良上，從富含單寧的環(huán)境樣品中進(jìn)行產(chǎn)單寧酶菌株的分離篩選，如茶園土壤、皮革廠廢水、五倍子及其他富含單寧的植物等，目前直接從茶樹(shù)中分離可產(chǎn)單寧酶的內(nèi)生真菌鮮有報(bào)道。本發(fā)明提出了一種產(chǎn)單寧酶的茶樹(shù)內(nèi)生真菌，以豐富對(duì)產(chǎn)單寧酶微生物的認(rèn)識(shí)，為單寧酶的開(kāi)發(fā)利用提供一些新思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的提供一種菌核青霉菌株及其應(yīng)用，該菌株具有降解咖啡堿、水解表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和產(chǎn)生單寧酶的特點(diǎn)，可用于制備低咖啡堿、弱苦澀味的新型茶飲料，該菌株已于2016年10月8日保藏于在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，該菌核青霉菌株的保藏號(hào)為：CCTCC No:M2016543，拉丁名：Penicilliumsclerotiorum,地址：湖北省武漢市武漢大學(xué)，郵編：430072，電話：027-68754052。

本發(fā)明保藏的菌核青霉菌落的特征為：菌落灰綠色，表面無(wú)色菌絲呈絨毛狀，菌落背面先無(wú)色后呈黃色，菌絲有橫隔，分生孢子梗亦有橫隔，基部無(wú)足細(xì)胞，頂端不形成膨大的頂囊，其分生孢子梗形如掃帚，稱為帚狀體。在瓶梗上著生分生孢子鏈，分生孢子球形，呈綠色。

所述菌核青霉屬于真菌界Fungi，子囊菌門Ascomycota，盤菌亞門Pezizomycotina，不整囊菌綱Eurotiomycetes，曲霉目Eurotiales，發(fā)菌科Trichocomaceae，青霉屬Penicillium。

本發(fā)明還提供了所述菌核青霉菌株的幾個(gè)新用途。

首先，所述菌核青霉菌株用于降解綠茶濾液中的咖啡堿。

其中，所述降解綠茶濾液中的咖啡堿的方法為：將綠茶干燥后在沸水中浸泡30～60min；浸泡結(jié)束后，立即趁熱過(guò)濾，得到綠茶濾液；在綠茶濾液中加入蔗糖或葡萄糖，高溫滅菌，滅菌結(jié)束后，得到綠茶茶湯；活化本發(fā)明保藏的菌核青霉，配制菌核青霉菌懸液；將綠茶茶湯中接入菌核青霉菌懸液，在溫度28±5℃的條件下有氧培養(yǎng)1～10天，得到發(fā)酵后的綠茶茶湯；將發(fā)酵后的綠茶茶湯滅菌，過(guò)濾，去除沉淀物及菌體，綠茶濾液中的咖啡堿含量顯著降低。

其次，所述菌核青霉菌株用于水解綠茶濾液中的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯。

再次，所述菌核青霉菌株用于制備單寧酶。

最后，所述菌核青霉菌株用于制備低咖啡堿、所述菌核青霉菌株用于制備低咖啡堿、弱苦澀味的綠茶飲料原漿。

有益效果

其一，本發(fā)明分離出的菌核青霉與傳統(tǒng)的菌核青霉比有一些特有的特性。首先，本發(fā)明保藏的菌核青霉能夠顯著降低綠茶濾液中咖啡堿的含量，由于綠茶中含有大量的咖啡堿，不利于廣大中老年人飲用，會(huì)使其中樞神經(jīng)興奮，破壞生物鐘的平衡，而采用本發(fā)明保藏的菌核青霉發(fā)酵后的綠茶濾液的咖啡堿含量會(huì)顯著降低，根據(jù)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，綠茶濾液中的咖啡堿含量由開(kāi)始的0.205±0.001mg/mL降低到0.027±0.015mg/mL，可見(jiàn)，本發(fā)明的菌核青霉對(duì)咖啡堿(CAF)的降解能力很強(qiáng)，咖啡堿降解率達(dá)到87.94％。發(fā)明人尚未查詢到相關(guān)報(bào)道。

其二，采用本發(fā)明的菌核青霉發(fā)酵綠茶茶湯，在發(fā)酵過(guò)程中，綠茶茶湯內(nèi)苦澀味較強(qiáng)的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯等酯型兒茶素被水解為苦澀味較弱的非酯型兒茶素，其中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯含量由發(fā)酵前的0.192±0.006mg/mL降低到0.013±0.015mg/mL，顯著降低，最終可以制備出酯型兒茶素含量低、非酯型兒茶素含量高、咖啡堿含量低的綠茶飲料，同時(shí)發(fā)酵過(guò)程對(duì)綠茶茶湯中的其他物質(zhì)改變不大，保留了原有綠茶中的其他有效成分和風(fēng)味物質(zhì)。

其三，本發(fā)明的菌核青霉能夠很好的適應(yīng)各種發(fā)酵環(huán)境，發(fā)酵狀態(tài)控制性高，不產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)，能保證發(fā)酵后產(chǎn)品的安全性，同時(shí)，還能夠降低綠茶飲料中的苦澀味，為茶飲料的生產(chǎn)提供新的思路。同時(shí)，本發(fā)明菌株的發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，發(fā)酵成本低，適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明：

圖1為本發(fā)明菌核青霉在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖。

圖2為本發(fā)明菌核青霉在顯微鏡下的形態(tài)圖。

圖3為經(jīng)過(guò)本發(fā)明菌核青霉發(fā)酵前后的綠茶茶湯的HPLC檢測(cè)圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例子進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明各種等價(jià)形式的修改均落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求所規(guī)定的范圍。

實(shí)施例1

一種菌核青霉菌株，所述菌株已于2016年10月8日保藏于在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，該菌核青霉菌株的保藏號(hào)為：CCTCC No:M2016543。

其中，本發(fā)明實(shí)施例所用的其他試劑均為分析純。

以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明

本發(fā)明保藏的菌核青霉菌株是從農(nóng)抗早品種的茶樹(shù)葉片中分離得到的。具體分離步驟為：

1)將茶樹(shù)葉片先用無(wú)菌水沖洗，再用70％的乙醇浸泡1min，然后用3.5％的次氯酸鈉浸泡4min，再用70％乙醇浸泡30s，最后用無(wú)菌水洗凈葉片。

2)用無(wú)菌解剖刀將葉片按左右對(duì)稱的方向切取切成約5mm×5mm大小的組織塊，然后分別放置于PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿放入4-6個(gè)組織塊，28℃恒溫培養(yǎng)至小塊周圍長(zhǎng)出菌落。

3)挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落接種于PDA固體培養(yǎng)基，純化，保存。

其中，所述PDA培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯200g，蔗糖25g，瓊脂16g，制備方法如下：馬鈴薯去皮，切塊煮沸20min，用紗布過(guò)濾，加入蔗糖和瓊脂，補(bǔ)水至1000ml，在121℃滅菌15min，得到PDA培養(yǎng)基。

本發(fā)明保藏的菌核青霉菌落的特征為：菌落灰綠色，表面無(wú)色菌絲呈絨毛狀，菌落背面先無(wú)色后呈黃色，菌絲有橫隔，分生孢子梗亦有橫隔，基部無(wú)足細(xì)胞，頂端不形成膨大的頂囊，其分生孢子梗形如掃帚，稱為帚狀體。在瓶梗上著生分生孢子鏈，分生孢子球形，呈綠色，其在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見(jiàn)圖1，電子顯微鏡下的形態(tài)見(jiàn)圖2。

為測(cè)定本發(fā)明分離的菌核青霉能夠降解咖啡堿、水解表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯，同時(shí)該菌株能夠生產(chǎn)單寧酶，通過(guò)固體發(fā)酵培養(yǎng)能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得大量單寧酶，其具體測(cè)定方法如下：

將綠茶茶湯中接入1.0×10⁸CFU/mL本發(fā)明保藏的菌核青霉的菌懸液，接種量為1％，對(duì)照組接入同等量的滅菌水。然后在溫度28℃、轉(zhuǎn)速150r/min的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每隔24小時(shí)去一次樣，取出的樣品用0.45μm濾膜過(guò)濾后，采用HPLC的方法對(duì)其進(jìn)行茶湯主要8種成分的分析。

咖啡堿和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯采用上海伍豐科學(xué)儀器有限公司的C-100高效液相色譜儀進(jìn)行定性定量分析，分析色譜柱采用美國(guó)Phenomenex公司的C18分析色譜柱，其規(guī)格為5μm，250mm×4.6mm；咖啡堿和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯標(biāo)品來(lái)自上海源葉生物科技有限公司。

測(cè)定所用的HPLC的色譜條件為：流動(dòng)相A為0.15％乙酸，流動(dòng)相B為乙腈，流動(dòng)相流速1mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，進(jìn)樣量20μL，梯度洗脫。流動(dòng)相梯度見(jiàn)下表。

表1流動(dòng)相梯度

HPLC測(cè)定的結(jié)果如圖3所示，其中，上圖為本發(fā)明菌核青霉發(fā)酵前綠茶茶湯的HPLC檢測(cè)圖；下圖為本發(fā)明菌核青霉發(fā)酵后綠茶茶湯的HPLC檢測(cè)圖。通過(guò)HPLC的數(shù)據(jù)分析，可以得出在本發(fā)明的菌核青霉發(fā)酵過(guò)程中茶湯內(nèi)的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸的含量逐漸降低，第3天時(shí)，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸差不多完全水解。本發(fā)明保藏的菌核青霉對(duì)咖啡堿的降解能力很強(qiáng)，經(jīng)過(guò)菌核青霉發(fā)酵后，咖啡堿降解率達(dá)到86.83％。

表2本發(fā)明菌核青霉發(fā)酵茶湯成分含量對(duì)比

其中，所述的GA、EGC、CAF、C、EC、EGCG、GCG和ECG分別是沒(méi)食子酸，表沒(méi)食子兒茶素，咖啡堿，兒茶素，表兒茶素，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯，沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯，表兒茶素沒(méi)食子酸酯，由上表的數(shù)據(jù)可以看出，其咖啡堿、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯有顯著下降，而其他的非酯型兒茶素含量均有上升，這就意味著，綠茶中的主要苦澀味酯型兒茶素轉(zhuǎn)變成成弱苦味無(wú)澀味的非酯型兒茶素，在降低綠茶苦澀味的同時(shí)，不降低綠茶中兒茶素的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是不可多得的特性。本發(fā)明保藏的菌核青霉不僅沒(méi)有改變綠茶中的營(yíng)養(yǎng)成分，而且改善了綠茶的風(fēng)味，有很強(qiáng)的實(shí)用性。

申請(qǐng)人對(duì)此菌核青霉進(jìn)行了毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，設(shè)定的小鼠實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件為溫度范圍22-27℃，相對(duì)濕度范圍40-70％。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前先在動(dòng)物房環(huán)境中適應(yīng)3天，3天后，去除身體狀況不合格的實(shí)驗(yàn)小鼠，稱重編號(hào)，隨機(jī)分組，每組10只，雌雄各半，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中雌雄鼠分開(kāi)喂養(yǎng)，并保持一定的距離，防止外在的因素影響最終的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)前，隔夜禁食，不限制飲水。實(shí)驗(yàn)組按照設(shè)定的給藥劑量每只實(shí)驗(yàn)小鼠按照體重來(lái)計(jì)算，每次灌胃0.5mL/30g，對(duì)照組實(shí)驗(yàn)小鼠按照體重來(lái)按實(shí)驗(yàn)組的計(jì)算方法灌生理鹽水。實(shí)驗(yàn)小鼠在準(zhǔn)備灌胃前需要禁食12h，但是不限制其飲水，灌胃結(jié)束后可給實(shí)驗(yàn)小鼠提供適量的食物。連續(xù)灌胃7天。灌胃后隨時(shí)觀察小鼠的活動(dòng)狀況、死亡情況和中毒癥狀，每天都要對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的體重及飲食狀況進(jìn)行記錄。

菌核青霉茶湯發(fā)酵液的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未見(jiàn)明顯的中毒性病變。實(shí)驗(yàn)小鼠在給藥7天內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組小鼠外觀行為、飲食情況、糞便等方面無(wú)異常，各實(shí)驗(yàn)組小鼠無(wú)死亡現(xiàn)象。將得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)SAS軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各實(shí)驗(yàn)組小鼠的腎臟、肝臟和脾臟的實(shí)驗(yàn)數(shù)值以及血生化指標(biāo)與對(duì)照組小鼠的實(shí)驗(yàn)數(shù)值比較都沒(méi)有顯著性差異，實(shí)驗(yàn)小鼠的腎臟、肝臟和脾臟等器官的大小正常、外觀顏色也正常，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的水腫、萎縮等病理性變化。按急性毒性分級(jí)，本發(fā)明菌株發(fā)酵出的茶湯屬于實(shí)際無(wú)毒級(jí)。

實(shí)施例2

一種菌核青霉在制備茶飲料中降低咖啡堿、水解表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯的應(yīng)用，具體如下：

1)精確稱取6.000g磨碎的綠茶樣品放入500mL的錐形瓶中，加入200～400mL的沸水，在沸水浴中浸提45min。

2)浸提完成后，立即趁熱減壓過(guò)濾，得到綠茶濾液。

3)綠茶濾液冷卻后將其轉(zhuǎn)移到1L容量瓶中，并用蒸餾水定容至1L。

4)在每升茶湯中加入5g蔗糖，包扎好并于121℃下滅菌20min，滅菌結(jié)束后，得到綠茶茶湯。

5)取本發(fā)明保藏的菌核青霉菌株，所述菌株已于2016年10月8日保藏于在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，該菌核青霉菌株的保藏號(hào)為：CCTCC No:M2016543，置于PDA培養(yǎng)基中活化，得到活化的菌核青霉，并將其配制成5.0×10⁷CFU/mL的菌核青霉菌懸液。

6)將綠茶茶湯中接入5.0×10⁷CFU/mL的菌核青霉菌懸液，接種量為1％，在溫度28℃、轉(zhuǎn)速150r/min的條件下進(jìn)行培養(yǎng)1～10天，得到發(fā)酵后的綠茶茶湯。

7)將發(fā)酵后的綠茶茶湯采用UHT滅菌法滅菌，用0.45μm濾膜過(guò)濾，去除沉淀物及菌體后，得到一種全新的低咖啡堿、弱苦澀味的綠茶飲料原漿。

所述綠茶飲料原漿中，咖啡堿含量小于0.027±0.015mg/mL,表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯含量小于0.013±0.015mg/mL，較之于傳統(tǒng)綠茶飲料有顯著下降。

實(shí)施例3

一種菌核青霉在制備茶飲料中的應(yīng)用，具體如下：

1)將新鮮采摘的綠茶干燥后加入沸水，在沸水中浸提30～60min。

2)浸泡結(jié)束后，立即趁熱過(guò)濾，得到綠茶濾液。

3)在綠茶濾液中加入蔗糖或葡萄糖，高溫滅菌，滅菌結(jié)束后，得到綠茶茶湯。

4)取本發(fā)明保藏的菌核青霉菌株，所述菌株已于2016年10月8日保藏于在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，該菌核青霉菌株的保藏號(hào)為：CCTCC No:M2016543，置于PDA培養(yǎng)基中活化，得到活化的菌核青霉，并將其配制成1.0×10⁶～1.0×10⁸CFU/mL菌核青霉菌懸液。

5)將綠茶茶湯中接入菌核青霉菌懸液，接種量為1～10％，在溫度28±5℃的條件下有氧培養(yǎng)1～10天，得到發(fā)酵后的綠茶茶湯。

6)將發(fā)酵后的綠茶茶湯采用UHT滅菌法滅菌，用0.45～0.60μm濾膜過(guò)濾，去除沉淀物及菌體后，得到一種全新的低咖啡堿、弱苦澀味的綠茶飲料原漿，所述綠茶飲料原漿的咖啡堿含量為0.027±0.015mg/mL。

實(shí)施例4

本發(fā)明分離的菌核青霉還可以生產(chǎn)單寧酶，具體包括以下步驟：

1)菌株的活化及孢子懸浮液的制備：將本發(fā)明保藏的菌核青霉接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上在30℃下培養(yǎng)4d，所述菌株已于2016年10月8日保藏于在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，該菌核青霉菌株的保藏號(hào)為：CCTCC No:M2016543，制備單孢子懸浮液，制備好的孢子菌懸液在4℃同步培養(yǎng)1h備用接種。

2)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)單寧酶：將上述孢子懸浮液以0.2ml/g的比例接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基上，28℃，培養(yǎng)4d。

3)取出接種后發(fā)酵了4d的培養(yǎng)基，在盛有培養(yǎng)基的三角瓶中加入pH 5.0的檸檬酸緩沖液，在28℃條件下、180r/min震蕩30min，震蕩后的培養(yǎng)基用定性濾紙過(guò)濾，收集濾液即得粗酶液。

4)酶液的脫色、除菌：4℃下，用1％(w/v)的活性炭對(duì)粗酶液進(jìn)行脫色處理30min，過(guò)濾后再用0.22μm的濾膜除菌。

5)單寧酶粉的制備：向上述脫色、除菌后的酶液中先后加入50％、90％飽和度的硫酸銨沉淀單寧酶，溶解后透析除鹽，冷凍干燥后得到高純度的單寧酶粉。

本發(fā)明測(cè)定菌核青霉的單寧酶生產(chǎn)能力的方法：配置0.1g/ml的單寧酸溶液，在無(wú)菌條件下用移液槍吸取1ml單寧酸溶液加入馬丁氏培養(yǎng)基平板表面涂布均勻，吸出多余單寧酸溶液。挑取少量菌絲接種在培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)2～3天，觀察各個(gè)菌株生長(zhǎng)狀況。若菌落周圍出現(xiàn)透明水解圈則說(shuō)明該菌具有產(chǎn)單寧酶的能力。

測(cè)定菌核青霉生產(chǎn)單寧酶的方法：

1)發(fā)酵培養(yǎng)：用無(wú)菌水洗下PDA培養(yǎng)基上的孢子，制成孢子濃度為1.0×10⁸個(gè)/ml的單孢子懸浮液，再以0.2ml/g的比例接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基上，28℃，培養(yǎng)4d。

2)單寧酶的提?。喝〕雠囵B(yǎng)4d的錐形瓶，在錐形瓶中加入40mL pH5.0的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液，30℃條件下160r/min振蕩浸提1h，用定性濾紙過(guò)濾得粗酶液。粗酶液3500r/min轉(zhuǎn)速下離心20min去除固形物。取上清液加入(NH4)₂SO₄粉末至飽和度40％，攪拌均勻，靜置3h，3500r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，取上清加(NH4)₂SO₄粉末至飽和度90％，攪拌均勻，4℃的條件下靜置過(guò)夜，3500r/min轉(zhuǎn)速下離心20min，棄上清液，沉淀用等體積的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液溶解，放入透析袋中透析至氯化鋇檢測(cè)不到硫酸根離子，再冷凍干燥得到粗酶粉。

3)酶活性檢測(cè)：將單寧酶在pH5.0，30℃條件下每分鐘水解1μmolEGCG所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。取兩只潔凈試管，分為對(duì)照管和測(cè)試管。所有試管都加入0.25mlEGCG溶液，30℃預(yù)熱5min，測(cè)試管加入酶液0.25ml，對(duì)照管加入煮沸失活的酶液0.25ml，反應(yīng)十分鐘后煮沸十分鐘，0.45μm濾膜過(guò)濾后液相檢測(cè)EGCG的含量。

檢測(cè)結(jié)果顯示，采用本發(fā)明保藏的菌核青霉制備出來(lái)的單寧酶具有產(chǎn)量高，活性高的特點(diǎn)。