本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種香椿內(nèi)生真菌56-50及其次級代謝產(chǎn)物、制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

銅綠假單胞菌是一種條件致病菌，是醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌之一?；即x性疾病、血液病和惡性腫瘤的患者，以及術(shù)后或某些治療后的患者易感染本菌。本菌引起的感染病灶可導(dǎo)致血行散播，而發(fā)生菌血癥和敗血癥。燒傷后感染了銅綠假單胞菌可造成死亡。

變形桿菌也是一種條件致病菌，廣泛分布在自然界中，如土壤、水、垃圾、腐敗有機物及人或動物的腸道內(nèi)，能引起多種感染。常見感染有呼吸道感染、腹瀉、尿路感染、腹膜炎、中耳炎、乳突炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎入敗血癥，還可引起食物中毒。

銅綠假單胞菌和變形桿菌等細菌感染者常用抗生素治療，如慶大霉素、阿莫西林等。但隨著這些抗真菌藥物的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致了大量耐藥菌株的出現(xiàn)，這就給臨床治療帶來很大的困難和挑戰(zhàn)，急需研制新型的抗真菌藥物。

由于植物體內(nèi)天然活性物質(zhì)含量較低，提取工藝復(fù)雜，以及植物資源往往受地理環(huán)境和生態(tài)條件等因素的影響，亟需新的研發(fā)策略發(fā)現(xiàn)新型天然藥物。

植物內(nèi)生真菌則彌補了傳統(tǒng)植物提取天然活性物質(zhì)的局限。根據(jù)共生理論，植物內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的生物活性物質(zhì)，同時植物內(nèi)生真菌作為微生物，具有生長速度快、發(fā)酵生產(chǎn)周期短、易于工業(yè)化發(fā)酵等特點，從而使植物內(nèi)生真菌成為尋找和發(fā)現(xiàn)各種天然生物活性物質(zhì)的新資源。許多源于植物內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物被鑒定出具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、殺蟲以及酶抑制劑等多種生物學(xué)活性。植物內(nèi)生真菌所產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)新穎、活性多樣的化合物為新型抗真菌藥物的發(fā)現(xiàn)提供了重要的先導(dǎo)化合物和新的藥物作用靶點，成為天然活性產(chǎn)物和新藥開發(fā)的重要來源。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有銅綠假單胞菌和/或變形桿菌感染治療難題，本發(fā)明的目的旨在提供一種香椿內(nèi)生真菌56-50及其次級代謝產(chǎn)物、制備方法和應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：

一種香椿內(nèi)生真菌56-50，該真菌為半知菌類、絲孢菌綱、絲孢菌目、暗色絲孢菌、鏈格孢屬、蘋果鏈格孢Alternaria mali；保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期：2016年9月30日，保藏號：CGMCC No.12980，分類命名：蘋果鏈格孢Alternaria mali。

本發(fā)明提供了兩種制備香椿內(nèi)生真菌56-50的次級代謝產(chǎn)物的方法，具體如下：

方法一，步驟如下：

（1）菌株發(fā)酵：

將保藏號為CGMCC No.12980的香椿內(nèi)生真菌56-50接種到PDA平板培養(yǎng)基上，25-28℃活化培養(yǎng)3-5d，然后接種到盛有PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形三角瓶中，25-28℃、150-180rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)6-8d；

（2）菌株次級代謝產(chǎn)物的制備：

將步驟（1）所得菌株56-50的發(fā)酵培養(yǎng)液先攪碎，再過濾，得到發(fā)酵液和菌絲體；然后采用乙酸乙酯分別對發(fā)酵液和菌絲體進行萃取，重復(fù)萃取數(shù)次，合并萃取液，濃縮制備得到香椿內(nèi)生真菌56-50的次級代謝產(chǎn)物；其中，對發(fā)酵液進行萃取時，乙酸乙酯的用量與發(fā)酵液等體積；對菌絲體進行萃取時，乙酸乙酯的用量以浸泡住菌絲體為準。

方法二，步驟如下：

（1）菌株發(fā)酵：

將保藏號為CGMCC No.12980的香椿內(nèi)生真菌56-50接種到PDA平板培養(yǎng)基上，25-28℃活化培養(yǎng)3-5d，然后接種到盛有PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形三角瓶中，室溫靜置發(fā)酵培養(yǎng)25-30d；

（2）菌株次級代謝產(chǎn)物的制備：

將步驟（1）所得菌株56-50的發(fā)酵培養(yǎng)液先攪碎，再過濾，得到發(fā)酵液和菌絲體；發(fā)酵液用等體積乙酸乙酯萃取，重復(fù)萃取數(shù)次，合并萃取液，真空濃縮至干，得到發(fā)酵液的乙酸乙酯層萃取物；菌絲體用80v%的丙酮水溶液浸泡提取，反復(fù)提取數(shù)次，合并提取液，真空濃縮至不含丙酮后，再用等體積的乙酸乙酯萃取，重復(fù)萃取數(shù)次，然后合并萃取液并且真空濃縮至干，得到菌絲體的乙酸乙酯層萃取物；最后合并發(fā)酵液與菌絲體的乙酸乙酯層萃取物，即得香椿內(nèi)生真菌TS8的次級代謝產(chǎn)物。

利用上述兩種制備方法制備的香椿內(nèi)生真菌56-50的次級代謝產(chǎn)物。

所述香椿內(nèi)生真菌56-50的次級代謝產(chǎn)物在降解銅綠假單胞菌和/或變形桿菌中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

（1）本發(fā)明首次從香椿植物莖中分離得到一株內(nèi)生真菌56-50 (Alternaria mali)，該菌的次級代謝產(chǎn)物具有抑制細菌活性作用，對銅綠假單胞菌和變形桿菌具有較好的抑制作用；

（2）所述的制備香椿內(nèi)生真菌56-50 (Alternaria mali) 次級代謝產(chǎn)物的方法簡單易行，成本低。

附圖說明

圖1為實施例1香椿內(nèi)生真菌56-50的菌株形態(tài)特征，其中a為菌落形態(tài)，b為孢子形態(tài)。

圖2為實施例1香椿內(nèi)生真菌56-50的18S rDNA基因片段擴增圖譜，其中1為18S rDNA基因片段擴增產(chǎn)物，2為DNA Ladder Mix Marker。

圖3為實施例1香椿內(nèi)生真菌56-50的ITS rDNA基因片段擴增圖譜，其中1為DNA Ladder Mix Marker，2為ITS rDNA基因片段擴增產(chǎn)物。

圖4為實施例1香椿內(nèi)生真菌56-50菌株基于18S基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹。

圖5為實施例1香椿內(nèi)生真菌56-50菌株基于ITS基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹。

圖6為實施例1香椿內(nèi)生真菌56-50次級代謝產(chǎn)物的抑菌圈。

圖7為實施例2香椿內(nèi)生真菌56-50次級代謝產(chǎn)物的抑菌圈。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例進行詳細描述，但應(yīng)當理解本發(fā)明的保護范圍并不受具體實施例的限制。下述實施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

以下實施例中：

供試香椿材料：采自河南省鄭州市中牟縣田莊村河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院香椿示范基地。

供試菌株：購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) ACCC10500和豪氏變形桿菌(Proteus hauseri) ACCC10497。

PDA平板培養(yǎng)基和/或PDA斜面培養(yǎng)基的重量百分比組成為：土豆20%、葡萄糖2%、瓊脂2%，余量為水，pH 6.0；PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量百分比組成為：土豆20%、葡萄糖1%、麥芽糖2%、甘露醇2%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.3%、味精0.5%，余量為水，pH 6.0。

營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基的重量百分比組成為：蛋白胨1%，牛肉提取物0.3%，NaCl 0.5%，余量為水，pH 7.0。

營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基的重量百分比組成為：蛋白胨1%，牛肉提取物0.3%，NaCl 0.5%，瓊脂2%，余量為水，pH 7.0。

胰化酪蛋白大豆肉汁培養(yǎng)基的重量百分比組成為：TSB 3%，余量為水，pH自然。

胰化酪蛋白大豆肉汁瓊脂培養(yǎng)基的重量百分比組成為：TSB 3%，瓊脂2%，余量為水，pH自然。

實施例1

1. 香椿內(nèi)生真菌的分離與篩選

在無菌操作條件下，將香椿莖依次經(jīng)過75v%乙醇、有效氯1wt%次氯酸鈉、75v%乙醇各浸泡1min，然后用無菌水漂洗3次，無菌吸水紙干燥；用滅菌后的剪刀將其剪成8mm小段，放在PDA平板培養(yǎng)基上，每板4根，于28℃恒溫培養(yǎng)至莖末端長出菌絲，將菌絲轉(zhuǎn)移到新的PDA平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，5d 后分離純化得到單個菌落，然后轉(zhuǎn)移到PDA斜面培養(yǎng)基試管中，28℃恒溫培養(yǎng)5d 后，即獲得香椿內(nèi)生真菌56-50，4℃冰箱保存，備用，并于2016年9月30日，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號：CGMCC No.12980。

2. 香椿內(nèi)生真菌的鑒定

2.1 菌株形態(tài)特征觀察

將4℃冰箱保存的香椿內(nèi)生真菌56-50接種在PDA平板培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)，分別在1、4及8天觀察其培養(yǎng)特征和顏色變化。挑取菌落邊緣菌絲，制作水浸片，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲體、孢子、孢子梗等。

2.2 菌株18S、ITS rDNA序列及其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

2.2.1 基因組DNA的提取

將4℃冰箱保存的香椿內(nèi)生真菌56-50轉(zhuǎn)接到PDA平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5天?；蚪MDNA的提取采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(SK8259)，嚴格按照說明書操作。提取的基因組DNA在1％瓊脂糖凝膠中電泳檢測(150 V，100mA 20 min)，4℃保存?zhèn)溆?，或?20℃中長期保存。

2.2.2 18S rDNA和ITS基因片段的PCR擴增

18S區(qū)域的擴增選擇真核生物18S rDNA的通用擴增引物NS1(5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’)和NS6(5’-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3’)，PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 4min，變性94℃ 45s，退火55℃ 45s，延伸72℃ 1min，共30個循環(huán)，最后修復(fù)延伸72℃ 10min。

ITS區(qū)域的擴增選擇真核生物ITS rDNA的通用擴增引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATG C-3’)，PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 4min，變性94℃ 45s，退火55℃ 45s，延伸72℃ 1min，共30個循環(huán)，最后修復(fù)延伸72℃ 10min。

PCR擴增反應(yīng)所用試劑購自上海生工有限公司，采用25μL的反應(yīng)體系，包括ddH₂O 19.8μl，PCR Buffer(10×, Mg⁺ plus) 2.5μl，dNTP(各2.5mM) 1μl，Primer-F(10μM) 0.5μl，Primer-R(10μM) 0.5μl，DNA 0.5μl，Taq polymerase 0.2μl。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 目的DNA序列測序和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

將18S rDNA和ITS rDNA的PCR產(chǎn)物交由上海生工有限公司進行測序。獲得序列后，在NCBI中進行Blast比對，下載與供試菌株序列同源性相近的菌株序列利用ClustalX軟件進行序列的多重比對，利用MEGA7.0軟件N-J方法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展數(shù)為1000。

3. 菌株小量發(fā)酵

將4℃冰箱保存的香椿內(nèi)生真菌56-50接種到PDA平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)箱活化培養(yǎng)4d，然后接種到盛有200mL PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形三角瓶中，28℃、150rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)7d。

4. 菌株次級代謝產(chǎn)物的制備

菌株發(fā)酵完成后，香椿內(nèi)生真菌56-50的發(fā)酵培養(yǎng)液先用勻漿攪拌機攪碎，再用布氏漏斗抽濾，得到發(fā)酵液和菌絲體；然后采用乙酸乙酯分別對發(fā)酵液和菌絲體進行萃取，重復(fù)萃取3次，合并萃取液，濃縮，制備得到香椿內(nèi)生真菌56-50的次級代謝產(chǎn)物；其中，對發(fā)酵液進行萃取時，乙酸乙酯的用量與發(fā)酵液等體積；對菌絲體進行萃取時，乙酸乙酯的用量以浸泡住菌絲體為準。

5. 離體抑菌活性測定

采用瓊脂擴散法中的管碟法。

5.1 香椿內(nèi)生真菌56-50的次級代謝產(chǎn)物用無水乙醇溶解配成20mg/mL質(zhì)量濃度的溶液，作為供試樣液。

5.2 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)接種于營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12h，獲得菌懸液。

5.3 將營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基在121℃下高壓滅菌30min，冷卻至約40-50℃后，在凈化工作臺上將無菌培養(yǎng)基倒入90mm無菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基凝固后，吸取200μL菌懸液置于培養(yǎng)皿中央，用涂布棒涂布均勻，然后用滅菌鑷子在培養(yǎng)皿中放入無菌牛津杯，在其中加入200μL供試樣液（平行3次），于30℃培養(yǎng)12h后觀察并測定抑菌圈的直徑。同時作溶劑和陽性對照實驗，其中，陽性對照為1mg/mL鏈霉素。

6. 結(jié)果

6.1 菌株形態(tài)特征

菌落形態(tài)特征：菌株56-50在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)1d，可產(chǎn)生零星的放射狀白色菌絲，4d后菌落直徑為6.0cm，絨毛狀或棉絮狀，具明顯的同心輪紋，中央為墨綠色，外部淡黃色至灰綠色，菌落平坦，表面具少量稀疏的白色氣生菌絲（圖 1a），8d后菌落布滿培養(yǎng)皿。

孢子形態(tài)特征：分生孢子頂生，暗褐色，近卵形；分生孢子梗單生，深褐色，具明顯的隔膜（圖 1b）。

6.2 菌株的18S、ITS序列及其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

18S和ITS rDNA基因片段的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，如圖2、3所示，擴增產(chǎn)物分別為1300bp和500bp左右的特異性擴增條帶，大小與期望值相符。18S和ITS rDNA基因片段的PCR擴增產(chǎn)物由上海生工有限公司進行測序，測序結(jié)果，分別如序列表SEQ ID No.1和序列表SEQ ID No.2所示，表明：該菌株的18S和ITS rDNA基因序列長度分別為1322bp和541bp。

將PCR擴增獲得的18S rDNA序列（SEQ ID No.1）在NCBI中進行BLAST分析，結(jié)果表明，菌株56-50的18S rDNA序列與鏈格孢屬Alternaria sp.的18S序列同源性最高，相似性達100%。利用ClastalX與Mega5.0軟件，基于18S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖4，從系統(tǒng)進化樹上可以看出，每一個屬分別形成一個獨立的分枝，菌株56-50與Alternaria sp.(KT192438.1)和Alternaria sp.(GQ253348.1)處于同一分枝，親緣關(guān)系最近，判斷該菌株為鏈格孢屬。

將PCR擴增獲得的ITS rDNA序列（SEQ ID No.2）在NCBI中進行BLAST比對，結(jié)果表明，該序列與Alternaria mali的ITS序列同源性很高，相似性達100%。基于ITS rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖5，從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出每一個種分別形成一個獨立的分枝，菌株56-50與Alternaria mali(EU732731.1)聚為一枝，表現(xiàn)出非常近的親緣關(guān)系。

綜合菌落形態(tài)、顯微形態(tài)特征以及18S和ITS rDNA基因序列分析結(jié)果，將香椿內(nèi)生真菌56-50鑒定為半知菌類、絲孢菌綱、絲孢菌目、暗色絲孢菌、鏈格孢屬、蘋果鏈格孢Alternaria mali。

6.3 抑菌活性

如圖6所示，香椿內(nèi)生真菌菌株56-50的次級代謝產(chǎn)物對銅綠假單胞菌的抑菌圈為23.25±1.60 mm，大于1mg/mL陽性對照鏈霉素的抑菌圈(17.52±0.99 mm)。所以該菌株次級代謝產(chǎn)物對銅綠假單胞菌具有較好的抑制作用。

實施例2

與實施例1基本相同，區(qū)別在于：本實施例按照以下主要步驟完成菌株次級代謝產(chǎn)物的發(fā)酵、制備及抑菌活性測定。

1-2步驟同實施例1。

3.菌株小量發(fā)酵：

將4℃冰箱保存的香椿內(nèi)生真菌56-50接種到PDA平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)箱活化培養(yǎng)4d，然后接種到盛有200mL PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形三角瓶中，室溫靜置發(fā)酵培養(yǎng)7d。

4.菌株次級代謝產(chǎn)物的制備：

菌株發(fā)酵完成后，菌株56-50的發(fā)酵培養(yǎng)液先用勻漿攪拌機攪碎，然后布氏漏斗抽濾，得到發(fā)酵液和菌絲體；發(fā)酵液用等量乙酸乙酯萃取，重復(fù)萃取3次，合并發(fā)酵液的乙酸乙酯層萃取物，真空濃縮至干，即得到發(fā)酵液的乙酸乙酯層萃取物；菌絲體用80v%的丙酮水溶液（即丙酮在水溶液中占的體積分數(shù)為80%）浸泡提取，反復(fù)3次，合并提取液，真空濃縮至不含丙酮后，再用等體積的乙酸乙酯萃取，重復(fù)3次，然后合并乙酸乙酯萃取液并且真空濃縮至干，即得到菌絲體的乙酸乙酯層萃取物，最后合并得到發(fā)酵液與菌絲體的乙酸乙酯層萃取物，即為香椿內(nèi)生真菌56-50的次級代謝產(chǎn)物。

5.活性測定

采用瓊脂擴散法中的管碟法。

5.1香椿內(nèi)生真菌56-50的次級代謝產(chǎn)物用無水乙醇溶解配成20mg/mL質(zhì)量濃度的溶液，作為供試樣液。

5.2豪氏變形桿菌(Proteus hauseri)接種于胰化酪蛋白大豆肉汁培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12h，獲得菌懸液。

5.3 將胰化酪蛋白大豆肉汁瓊脂培養(yǎng)基在121℃下高壓滅菌30min，冷卻至約45℃后，在凈化工作臺上將無菌培養(yǎng)基倒入90mm無菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基凝固后，吸取200μL菌懸液置于培養(yǎng)皿中央，用涂布棒涂布均勻，然后用滅菌鑷子在培養(yǎng)皿中放入無菌牛津杯，在其中加入200μL供試樣液（平行3次），于30℃培養(yǎng)12h后觀察并測定抑菌圈的直徑。同時作溶劑和陽性對照實驗，其中，陽性對照為1mg/mL鏈霉素。

6.結(jié)果

如圖7所示，香椿內(nèi)生真菌菌株56-50的次級代謝產(chǎn)物對豪氏變形桿菌的抑菌圈為25.14±3.18 mm，而1mg/mL陽性對照鏈霉素的抑菌圈僅為19.03±1.66 mm。所以該菌株次級代謝產(chǎn)物對豪氏變形桿菌具有比較顯著的抑制作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120> 一種香椿內(nèi)生真菌56-50及其次級代謝產(chǎn)物、制備方法和應(yīng)用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 1322

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tgtcgcatta taccgtgaaa ctgcgaatgg ctcattaaat cagttatcgt ttatttgata 60

ataccttact acttggataa ccgtggtaat tctagagcta atacatgctg aaaatcccga 120

cttcggaagg gatgtgttta ttagataaaa aaccaatgcc cttcggggct ttttggtgat 180

tcatgataac tttacggatc gcatagcctt gcgctggcga cggttcattc aaatttctgc 240

cctatcaact ttcgatggta aggtattggc ttaccatggt ttcaacgggt aacggggaat 300

tagggttcga ttccggagag ggagcctgag aaacggctac cacatccaag gaaggcagca 360

ggcgcgcaaa ttacccaatc ccgacacggg gaggtagtga caataaatac tgatacaggg 420

ctcttttggg tcttgtaatt ggaatgagta caatttaaac ctcttaacga ggaacaattg 480

gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt aattccagct ccaatagcgt atattaaagt 540

tgttgcagtt aaaaagctcg tagttgaaac ttgggcctgg ctggcgggtc cgcctcaccg 600

cgtgcactcg tccggccggg ccttccttct gaagaacctc atgcccttca ctgggcgtgc 660

tggggaatca ggacttttac tttgaaaaaa ttagagtgtt caaagcaggc ctttgctcga 720

atacgttagc atggaataat aaaatagggc gtgcgtttct attttgttgg tttctagaga 780

cgccgcaatg attaacagga acagtcgggg gcatcagtat tcagttgtca gaggtgaaat 840

tcttggattt actgaagact aactactgcg aaagcatttg ccaaggatgt tttcattaat 900

cagtgaacga aagttagggg atcgaagacg atcagatacc gtcgtagtct taaccgtaaa 960

ctatgccgac tagggatcgg gcgatgttct ttttctgact cgctcggcac cttacgagaa 1020

atcaaagttt ttgggttctg gggggattat ggtcgcaagg ctgaaactta aagaaattga 1080

cggaaggtca ccaccaggcg tggagcctgc ggcttaattt gactcaacac ggggaaactc 1140

accaggtcca gatgaaataa ggattgacag attgagagct ctttcttgat ttttcaggtg 1200

gtggtgcatg gccgttctta gttcgtgggg tgacttgtct gcttaattgc gataacgagc 1260

gagaccttac tctgctaaat agccaggcta actttggttg gtcgccggct tcttagagag 1320

tg 1322

<210> 2

<211> 541

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tatgcttaag ttcagcgggt atccctacct gatccgaggt caaaagttga aaaaaaggct 60

taatggatgc tagacctttg ctgatagaga gtgcgacttg tgctgcgctc cgaaaccagt 120

aggccggctg ccaattactt taaggcgagt ctccagcaaa gctagagaca agacgcccaa 180

caccaagcaa agcttgaggg tacaaatgac gctcgaacag gcatgccctt tggaatacca 240

aagggcgcaa tgtgcgttca aagattcgat gattcactga attctgcaat tcacactact 300

tatcgcattt cgctgcgttc ttcatcgatg ccagaaccaa gagatccgtt gttgaaagtt 360

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