本發(fā)明涉及微生物培養(yǎng)、發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種利用參類提取物培養(yǎng)冬蟲夏草菌方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：冬蟲夏草是我國的一種名貴、稀有中藥，用藥歷史悠久，與人參、鹿茸并列三大滋補品之一，用于補益肺腎兩虛，久咳，支氣管炎，陽痿，月經(jīng)不調(diào)，高血脂，心供血不足等癥，具有抗腫瘤，增強免疫力、抗病毒，抗真菌等藥理作用，科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草含有腺苷、蟲草素、蟲草酸，多糖等藥物化學(xué)物質(zhì)，是冬蟲夏草發(fā)揮藥效，也是制定冬蟲夏草質(zhì)量標(biāo)準的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，近幾年，國內(nèi)外科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，蟲草素能干擾基因細細RNA和DNA的合成，抑制癌細胞等不正常細胞的分裂，表現(xiàn)出很強的抗真菌、抗HlV－I型病毒和抑制梭菌活性，作為抗癌、抗病毒新藥，蟲草素在美國己通過FDA的安全評價，并進入到三期臨床價段。冬蟲夏草菌是從新鮮、經(jīng)消毒的冬蟲夏草的蟲體或子座中分離得到的一種藥用真菌，用深層液體發(fā)酵生產(chǎn)得到的蟲草菌絲，含有與野生冬蟲夏草相同的藥物成分，用冬蟲夏草菌絲體制得多種藥產(chǎn)品，如金水寶、百靈膠囊等作為國家一類新藥已收入于中國藥典，具有很好的市場前景。十多年來，國內(nèi)許多單位，盡管已經(jīng)對冬蟲夏草菌的生長特征、發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵工藝進行大量研究工作，冬蟲夏草菌絲體活性成分還較低，特別是冬蟲夏草菌絲體中蟲草素含量更低，因此有必要提高冬蟲夏草菌的蟲草素含量?，F(xiàn)有提高蟲草素的技術(shù)方案一般是對發(fā)酵培養(yǎng)基進行改良，或在發(fā)酵過程加入一些化學(xué)物質(zhì)，如油酸或其前體物類似物或植物生長調(diào)節(jié)劑等到發(fā)酵培養(yǎng)基中，由于發(fā)酵培養(yǎng)基體積大，所需原材料或添加物的重量大，成本高。很少見到通過對冬蟲夏草菌種子培養(yǎng)基的研究，來提高蟲草素含量的研究。因此，冬蟲夏草真菌的種子培養(yǎng)和發(fā)酵工藝技術(shù)研究的創(chuàng)新，對提高發(fā)酵冬蟲夏草菌發(fā)酵液和菌絲體的蟲草素含量，改善冬蟲夏草菌的產(chǎn)品質(zhì)量和藥用效果有積極意義。參類是傳統(tǒng)的中藥，包括產(chǎn)于我國東北黑龍江、吉林長白山的人參，朝鮮、韓國的高麗參和美國、加拿大的西洋參等。藥理藥化研究表明：參類含有多種皂甙和多糖成分，具有大補元氣，復(fù)脈固脫，補脾益肺，生津安神，人力衰褐，滋陰補正，扶正固本的功效，但未見參類用于真菌發(fā)酵、特別是未見用于冬蟲夏草菌發(fā)酵、提高蟲草素含量的報導(dǎo)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提出了一種利用參類提取物培養(yǎng)冬蟲夏草菌的方法，該方法是在冬蟲夏草種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)過程中，將參類提取物添加到所述培養(yǎng)基中，繼續(xù)按冬蟲夏草常規(guī)工藝進行培養(yǎng)和發(fā)酵。本發(fā)明所述冬蟲夏草菌是指從新鮮、經(jīng)消毒的冬蟲夏草的蟲體或子座中分離得到的藥用真菌；優(yōu)選為本領(lǐng)域公知的無性型中華被孢霉、有性型中華被孢霉、蟲草頭孢霉、彎頸霉、束絲霉或蝙蝠蛾擬青霉。本發(fā)明通過大量實踐發(fā)現(xiàn)，將參類提取物用于冬蟲夏草菌的培養(yǎng)過程，可以顯著提高冬蟲夏草菌的質(zhì)量，尤其可以提冬蟲夏草菌發(fā)酵液和菌絲體中蟲草素的含量，從而提高其藥用價值。具體而言，所述方法包括以下步驟：將冬蟲夏草菌接入種子培養(yǎng)基中進行種子培養(yǎng)，得種子液；將所述種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)；期間，將參類提取物添加到所述種子培養(yǎng)基或/和發(fā)酵培養(yǎng)基中。為了更好地提高蟲草素的含量，同時盡量減少參類提取物的用量，本發(fā)明將參類提取物添加到所述種子培養(yǎng)基中。具體而言，優(yōu)選在未接入種子前或接入種子生長到指數(shù)生長期內(nèi)任意時間，將參類提取物添加到種子培養(yǎng)基中。本發(fā)明還可以將參類提取物添加到所述發(fā)酵培養(yǎng)基中。具體而言，優(yōu)選在所述發(fā)酵培養(yǎng)的延滯期或所述發(fā)酵培養(yǎng)的指數(shù)生長期，將參類提取物添加到所述發(fā)酵培養(yǎng)基中。本發(fā)明還可以將參類提取物添加到所述種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中。具體而言，優(yōu)選在未接入種子前或種子生長到指數(shù)生長期內(nèi)將參提取物添加到種子培養(yǎng)基中，并在發(fā)酵培養(yǎng)的延滯期或指數(shù)生長期將參提取物添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中。本發(fā)明所述參類具體是指本領(lǐng)域公知的人參，高麗參或西洋參。所述參類提取物優(yōu)選由以下方法制備而成：將人參，高麗參或西洋參與水或含有少量低級醇水溶液(如5～35％的乙醇水溶液)混合，在溫75～95℃充分浸泡提取，過濾后濃縮濾液，即得。進一步優(yōu)選由以下方法制備而成：將人參，高麗參或西洋參以質(zhì)量體積比1:5～15與水或含有少量低級醇水溶液(如5～35％的乙醇水溶液)混合；采用超聲波提取或回流提取方法，在75～95℃提取2～3次，每次30～60min；過濾，合并提取液，減壓濃縮，即可。所述濃縮優(yōu)選為濃縮至液體體積ml相當(dāng)于參類原料質(zhì)量g的1～2倍。在實際添加過程中，本發(fā)明優(yōu)選所述參類提取物的添加體積占所述種子培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基體積的0.3～1.0％。本發(fā)明采用的種子培養(yǎng)基中包含碳源、氮源以及無機鹽。所述碳源、氮源以及無機鹽均可選用本領(lǐng)域常規(guī)的組分。具體而言，所述碳源可選用馬鈴薯或/和燕麥片以及葡萄糖或/和蔗糖，所述氮源可選用蛋白胨以及酵母膏；所述無機鹽可選用磷酸二氫鉀以及硫酸鎂。為了確保各組分之間協(xié)同作用，進一步全面提高種子品質(zhì)，本發(fā)明優(yōu)選所述種子培養(yǎng)基中包含如下重量份的成分：馬鈴薯150～250份，葡萄糖10～15份，蛋白胨1～5份，酵母膏1～5份，磷酸二氫鉀0.1～1份，硫酸鎂0.1～1份。優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，其中包含如下成分：馬鈴薯150～250g/L，葡萄糖10～15g/L，蛋白胨1～5g/L，酵母膏1～5g/L，磷酸二氫鉀0.1～1g/L，硫酸鎂0.1～1g/L，蒸餾水余量。本發(fā)明所述種子培養(yǎng)基，可按常規(guī)培養(yǎng)基的配制方法配制。如將上述質(zhì)量配比稱取原料，放入容器，加熱，溶解，混合均勻后按常規(guī)滅菌方法滅菌即可。為了確保各組分之間協(xié)同作用，進一步全面提高發(fā)酵產(chǎn)物的品質(zhì)，本發(fā)明優(yōu)選所述發(fā)酵培養(yǎng)基中包含如下重量份的成分：葡萄糖10～20份，蔗糖5～10份，小米5～15份，蛋白胨5～10份，酵母膏1～5份，豆餅粉10～20份，磷酸二氫鉀0.1～1份，硫酸鎂0.1～1份，維生素B10.01～0.05份。優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，其中包含如下成分：葡萄糖10～20g/L，蔗糖5～10g/L，小米5～15g/L，蛋白胨5～10g/L，酵母膏1～5g/L，豆餅粉10～20g/L，磷酸二氫鉀0.1～1g/L，硫酸鎂0.1～1g/L，維生素B10.01～0.05g/L，蒸餾水余量。本發(fā)明所述發(fā)酵培養(yǎng)基，可按常規(guī)培養(yǎng)基的配制方法配制。如將上述質(zhì)量配比稱取原料，放入容器，加熱，溶解，混合均勻后按常規(guī)滅菌方法滅菌即可。上述所述種子培養(yǎng)方法以及發(fā)酵方法均為本領(lǐng)域常規(guī)操作，本發(fā)明不做特殊限定。作為一種具體的實施方式，所述種子培養(yǎng)方法為：將母種接入種子培養(yǎng)基，在溫度19～23℃、旋轉(zhuǎn)速度為160～210r/min的搖瓶中培養(yǎng)36～48小時。作為一種具體的實施方式，所述發(fā)酵培養(yǎng)方法為：將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度21～25℃、旋轉(zhuǎn)速度為160～200r/min條件下，通氣培養(yǎng)48～80小時。本發(fā)明同時保護所述方法培養(yǎng)得到的冬蟲夏草菌發(fā)酵液和/或菌絲體。本發(fā)明進一步保護所述方法在制備蟲草保健品中的應(yīng)用。所述應(yīng)用具體為：以所述方法培養(yǎng)得到的冬蟲夏草菌發(fā)酵液和/或菌絲體為原料生產(chǎn)蟲草保健品。作為一種具體應(yīng)用方式，本發(fā)明優(yōu)選將所述發(fā)酵液按體積比1：0.8～1.4與純糧米酒混合，均質(zhì)，陳釀，得到蟲草原漿保健酒。為了提高所述保健酒的綜合品質(zhì)，使蟲草素在陳釀過程中充分發(fā)揮作用，本發(fā)明優(yōu)選所述純糧米酒的酒精度為52～56度。作為一種具體應(yīng)用方式，本發(fā)明優(yōu)選采用低級醇水溶液以及水溶液依次對所述菌絲體進行超聲波提取，過濾后取濾液，濃縮濾液，得到冬蟲夏草口服液。為了提高提取效果，本發(fā)明優(yōu)選將所述菌絲體以重量體積比(g/ml或kg/L)為1：8～12的比例分別先加入(30-70％)乙醇水溶液在溫度55～95℃的條件下超聲波提取2～3次，每次30-60min；再加入同樣比例的水溶液在55～95℃條件下超聲波提取2～3次，每次30～60min。本發(fā)明創(chuàng)造性地將參類提取物用于冬蟲夏草菌的培養(yǎng)中。用所述培養(yǎng)方法培養(yǎng)的菌種生長速度快、質(zhì)量佳。本發(fā)明通過在冬蟲夏草菌特定的培養(yǎng)期添加參類提取物，可顯著提高菌絲體中蟲草素含量；本發(fā)明提供的培養(yǎng)方法，操作簡便，不改變冬蟲夏草菌原有培養(yǎng)工藝條件，易于在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用。本發(fā)明添加的參類物質(zhì)是藥食兩用的中藥，來源方便，添加量少，成本低廉，安全無毒，可用于醫(yī)藥、保健品和食品的工業(yè)生產(chǎn)。用本發(fā)明提供的方法生產(chǎn)冬蟲夏草保健品，含有冬蟲夏草和參類的藥物成份，具有參類和冬蟲夏草的藥用和保健作用。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1人參提取物的制備：取市購東北吉林長白山移山參，清除塵土雜質(zhì)，烘干粉碎，過80目篩得粗粉。取300g粗粉，置于超聲波提取器，加入3000ml純水，在浸取溫度75度，功率300W，超聲浸取30分鐘，濾出浸出液，向浸提殘渣重新加入2000ml純水，在浸取溫度75度，功率300W，超聲浸取30分鐘，濾出浸出液，濾液合并，置旋轉(zhuǎn)薄膜濃縮器，在水浴溫度為75度，真空度為0.097Mpa下，濃縮至殘留浸取液450ml結(jié)束。采用西藏那曲地區(qū)天然冬蟲夏草上分離純化、并經(jīng)菌種的培養(yǎng)特征、顯微特征、rRNA基因序列等分子生物學(xué)鑒定為冬蟲夏草的菌種。按照以下步驟進行培養(yǎng)：(1)將冬蟲夏草菌種接入液體種子培養(yǎng)基，按常規(guī)方法(在溫度19～23℃、旋轉(zhuǎn)速度為180r/min的搖瓶中培養(yǎng)36-42小時)培養(yǎng)種子液；所述液體種子培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯200g/L，葡萄糖12g/L，蛋白胨2.5g/L，酵母膏2g/L，磷酸二氫鉀0.8g/L，硫酸鎂0.5g/L，蒸餾水余量；其中，在進行種子平行培養(yǎng)的情況下，在所述種子培養(yǎng)的指數(shù)生長前期加入占所述液體種子培養(yǎng)基體積0.45％的人參提取物，作為試驗組；未添加人參提取物的作為對照組；(2)將所述種子液接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，所述種子液的接入體積為所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10～12％，按常規(guī)方法(在溫度21～25℃、旋轉(zhuǎn)速度為190r/min條件下，通氣培養(yǎng)48-72小時)發(fā)酵，收集發(fā)酵液；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖15g/L，蔗糖7g/L，小米10g/L，蛋白胨6g/L，豆餅粉15g/L，酵母浸膏2.5g/L，磷酸二氫鉀0.8g/L，硫酸鎂0.5g/L，維生素B10.03g/L，蒸餾水余量。發(fā)酵結(jié)束后，分別收集試驗組和對照組的冬蟲夏草菌絲體，干燥。用高效液相色譜法測定試驗組和對照組中蟲草素的含量。其中，所述干燥菌絲體的獲取方法為：將發(fā)酵液在相對離心力12000g條件下離心15分鐘，重復(fù)離心操作洗滌菌絲體二次，在65℃下干燥至恒重。在進行高效液相色譜檢測前，對所述干燥菌絲體進行如下前處理：精密稱取菌絲體重量，加入流動相(甲醇：水＝60:40)，所述流動相體積ml相當(dāng)于所述菌絲體重量g的10倍，在功率400W、頻率30KHz的條件下超聲處理30分鐘，定容。所述高效液相色譜法測定的條件為：采用C18柱(十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑)，以甲醇：水＝60:40為流動相，梯度洗脫，檢測波長為260nm，柱溫為25℃。檢測結(jié)果如表1所示。表1：每100ml發(fā)酵液中菌絲體所含的蟲草素含量蟲草素含量(mg/100ml)對照組0.040試驗組0.156實施例2與實施例1相比，區(qū)別僅在于：在進行種子平行培養(yǎng)的情況下，試驗組在所述種子培養(yǎng)基未接入種子前加入占所述液體種子培養(yǎng)基體積0.75％的人參提取物，作為試驗組；未添加人參提取物的作為對照組。發(fā)酵結(jié)束后，分別收集1000ml試驗組和對照組的冬蟲夏草菌絲體，以1：8重量體積比分別加入70％乙醇水溶液和水溶液，分別在55℃和95℃提取3次，每次30min；進行超聲提取，過濾，濃縮濾液得到385ml冬蟲夏草口服液。并用所述高效液相色譜法測定試驗組和對照組冬蟲夏草口服液中蟲草素的含量，檢測結(jié)果如表2所示表2：每100ml口服液中所含的蟲草素含量蟲草素含量(mg/100ml)對照組0.083試驗組0.405實施例3與實施例1相比，區(qū)別僅在于：在進行種子平行培養(yǎng)的情況下，試驗組在所述種子培養(yǎng)的指數(shù)生長未期加入占所述液體種子培養(yǎng)基體積0.95％的人參提取物，作為試驗組；未添加人參提取物的作為對照組。發(fā)酵結(jié)束后，分別收集試驗組和對照組的冬蟲夏草發(fā)酵液。將所述發(fā)酵液按體積比為1：1.1的比例加入的酒精度52-56度的純糧米酒，經(jīng)過均質(zhì)機處理(操作壓力為90MPa)，陳釀后得到蟲草原漿保健酒。并用所述高效液相色譜法測定試驗組和對照組蟲草原漿保健酒中蟲草素的含量，檢測結(jié)果如表3所示。表3：每100ml蟲草原漿保健酒所含的蟲草素含量蟲草素含量(mg/100ml)對照組0.020試驗組0.058實施例4與實施例1相比，區(qū)別僅在于：在進行發(fā)酵平行培養(yǎng)的情況下，在試驗組所述發(fā)酵培養(yǎng)的延滯期加入占所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積0.55％的人參提取物，作為試驗組；未添加人參提取物的作為對照組。發(fā)酵結(jié)束后，按照實施例1所述方法分別收集試驗組和對照組的冬蟲夏草菌絲體，以1：10重量體積比分別加入65％乙醇水溶液和水溶液，分別在55℃和95℃提取3次，每次30min；進行超聲提取，過濾，濃縮濾液得到冬蟲夏草口服液。并用所述高效液相色譜法測定試驗組和對照組蟲草口服液中蟲草素的含量，檢測結(jié)果如表4所示。表4：每100ml蟲草口服液所含的蟲草素含量蟲草素含量(mg/100ml)對照組0.117試驗組0.605實施例5與實施例1相比，區(qū)別僅在于：在進行發(fā)酵平行培養(yǎng)的情況下，在試驗組所述發(fā)酵培養(yǎng)指數(shù)生長前期加入占所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積0.8％的人參提取物，作為試驗組；未添加人參提取物的作為對照組。發(fā)酵結(jié)束后，分別收集2000ml試驗組和對照組的冬蟲夏草發(fā)酵液。用納濾(操作壓力為25MPa)將所述發(fā)酵液濃縮到494ml發(fā)酵液，按體積比為1：1.1的比例加入的酒精度52-56度的純糧米酒，經(jīng)過均質(zhì)機處理(操作壓力為90MPa)，陳釀后得到蟲草原漿保健酒。并測定試驗組和對照組中蟲草素的含量，檢測結(jié)果如表5所示。表5：每100ml蟲草原漿保健酒中菌絲體所含的蟲草素含量蟲草素含量(mg/100ml)對照組0.079試驗組0.273實施例6與實施例1相比，區(qū)別僅在于：在進行平行培養(yǎng)發(fā)酵的情況下，在所述的種子培養(yǎng)液未接入種子前和發(fā)酵培養(yǎng)的指數(shù)生長期分別加入占所述種子培養(yǎng)基液體和發(fā)酵培養(yǎng)基體積0.3％和0.55％的西洋參提取物，作為試驗組；未添加西洋參提取物的作為對照組。所述西洋參提取物的制備方法為：市購產(chǎn)于美國的西洋參，清除塵土雜質(zhì)，烘干粉碎，過90目篩得細粉。取200g細粉，置于超聲波提取器，加入2000ml純水，在浸取溫度70度，功率300W，超聲浸取40分鐘，濾出浸出液，向浸提殘渣重新加入2000ml純水，在浸取溫度70度，功率300W，超聲浸取30分鐘，濾出浸出液，濾液合并，置旋轉(zhuǎn)薄膜濃縮器，在水浴溫度為70度，真空度為0.097Mpa下，濃縮至殘留浸取液200ml結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后，按照實施例1所述方法分別收集試驗組和對照組的冬蟲夏草菌絲體，干燥，超微粉碎，得菌絲粉，并按所述高效液相色譜法測定試驗組和對照組菌粉中蟲草素的含量，檢測結(jié)果如表6所示。表6：每100ml發(fā)酵液中菌絲粉所含蟲草素含量蟲草素含量(mg/100ml)對照組0.041試驗組0.247實施例7與實施例1相比，區(qū)別僅在于：在進行平行培養(yǎng)和發(fā)酵的情況下，在所述種子培養(yǎng)指數(shù)生長期和發(fā)酵培養(yǎng)的延滯期分別加入占所述液體種子和發(fā)酵培養(yǎng)基體積0.35％和0.42％的高麗參提取物，作為試驗組；未添加高麗參提取物的作為對照組。所述高麗參提取物的制備方法為：市購產(chǎn)于朝鮮高麗參，清除塵土雜質(zhì)，烘干粉碎，過90目篩得細粉。取150g細粉，置于超聲波提取器，加入1500ml純水，在浸取溫度65度，功率300W，超聲浸取50分鐘，濾出浸出液，向浸提殘渣重新加入1000ml純水，在浸取溫度65度，功率300W，超聲浸取25分鐘，濾出浸出液，濾液合并，置旋轉(zhuǎn)薄膜濃縮器，在水浴溫度為75度，真空度為0.095Mpa下，濃縮至殘留浸取液250ml。發(fā)酵結(jié)束后，分別收集試驗組和對照組的冬蟲夏草菌發(fā)酵液。加入甲醇，超聲處理，按所述高效液相色譜法測定試驗組和對照組發(fā)酵液中蟲草素的含量，檢測結(jié)果如表7所示。表7：每100ml發(fā)酵液中所含的蟲草素含量蟲草素含量(mg/100ml)對照組0.040試驗組0.258雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、具體實施方式及試驗，對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3