專利名稱：蟲生真菌萊氏野村菌及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物防治領(lǐng)域，具體涉及一種殺蟲真菌一萊氏野村菌及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
與其它殺蟲微生物相比，真菌具有其特殊優(yōu)勢:觸殺性、流行性、對(duì)環(huán)境安全和不易產(chǎn)生抗藥性；培養(yǎng)生產(chǎn)簡單，產(chǎn)業(yè)化容易；對(duì)Bt類殺蟲劑目前無法防治的地下害蟲、蛀干害蟲、刺吸式口器害蟲的防治有特效等等，因此，真菌殺蟲劑的研究開發(fā)已引起了研究人員廣泛的關(guān)注和重視。萊氏野村菌\_Nomuraea rileyi (Farlow) Samson]是一種分布廣泛的昆蟲病原真菌，能寄生40多種昆蟲，特別是對(duì)鱗翅目夜蛾科害蟲幼蟲的致病力較強(qiáng)，在田間可引發(fā)棉鈴蟲、斜紋夜蛾、甜菜夜蛾、黎豆夜蛾、大豆夜蛾等多種害蟲的疾病流行，對(duì)害蟲種群有一定的控制作用，自該菌被分離鑒定以后，逐漸被各國科學(xué)家所重視，具有較高的開發(fā)利用價(jià)值。但來源不同的萊氏野村菌菌株不但在菌落生長量、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)率等方面存在明顯的差異，而且其殺蟲效果也大不相同，然而產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率、殺蟲效果等是影響萊氏野村菌菌株在農(nóng)業(yè)生防中應(yīng)用的重要因素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種殺蟲效果良好的蟲生真菌萊氏野村菌，并提供了一種產(chǎn)孢量大且孢子萌發(fā)率高的萊氏野村菌培養(yǎng)方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
一種萊氏野村菌(/Vbffitfraea ri7eja.) NrlOOl,其保藏編號(hào)為 CGMCC N0.6387。利用上述蟲生真菌萊氏野村菌生產(chǎn)孢子的方法，包括以下步驟:
(1)試管菌種制備:將NrlOOl菌株接種到試管SMAY斜面培養(yǎng)基上，26 28°C下培養(yǎng)144小時(shí)獲得試管菌種；
(2)種子液制備:取斜面菌種，每支用滅菌的0.05% (v/v) Tween-80沖洗制得孢子液，接種到裝有50mL SMY的250mL三角瓶至終濃度為I X IO6孢子/mL，于26°C、180 r/min搖床培養(yǎng)144小時(shí),作為液體種子液備用；
(3)培養(yǎng)基質(zhì)制備:稱取一定量基質(zhì)料，并按2g:1ml的固液比向基質(zhì)料中入蒸餾水，經(jīng)高壓滅菌后冷卻，并按基質(zhì)料重量的4 8%加入麥芽糖和I 3%的酵母粉，即成培養(yǎng)基質(zhì)，所述基質(zhì)料為小麥、大豆、大米、麥麩中的至少一種，且所述大豆和小麥加蒸餾水浸泡至少12小時(shí)后再進(jìn)行高壓 滅菌處理；
(4)將上步所得基質(zhì)打碎凝結(jié)塊，并按lml:12g的接種量向其中接入步驟(2)所得種子液，充分搖勻，于如下的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)14d后分離出孢子:培養(yǎng)溫度25 30°C，95%的空氣濕度，pH6 8、8L光照。
在所述步驟(3)中，最佳的基質(zhì)料為大豆基質(zhì)，經(jīng)浸泡、高壓滅菌后，按大豆基質(zhì)重量的6%加入麥芽糖。將種子液接種到大豆基質(zhì)上可進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)，大豆基質(zhì)制備如下:60g大豆加30ml水浸泡過夜，打碎后滅菌，加入6%的麥芽糖和2%酵母粉，接入5ml上述種子液，充分搖勻，置于25°C下培養(yǎng)14天，發(fā)酵產(chǎn)品常溫晾干，粉碎后即制得孢子粉。上述生物制劑可以通過噴霧的方法施用，可單獨(dú)使用，也可與白僵菌、綠僵菌、蘇云金桿菌等生物殺蟲劑、植物調(diào)節(jié)劑混合使用。一般在幼蟲孵化至3齡前噴霧。本發(fā)明具有積極有益的效果:
所篩選出的況rileyi 1001菌株殺蟲效果好，室內(nèi)NrlOOl菌株對(duì)棉鈴蟲三齡幼蟲的殺蟲效果達(dá)70%以上；田間防治棉鈴蟲、甜菜夜·蛾等害蟲的效果達(dá)90%以上，與之前所報(bào)道的其他萊氏野村菌菌株相比，無論在產(chǎn)孢量還是殺蟲效果上，都有一定的優(yōu)勢；而且，該菌株的殺蟲譜廣，對(duì)鱗翅目夜蛾科幼蟲如棉鈴蟲、甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、黎豆夜蛾、大豆夜蛾等均有較強(qiáng)的感染作用，可造成·田間害蟲大面積流行。由此可見，NrlOOl菌株具有較好的殺蟲效果，具有較好的工業(yè)化生產(chǎn)前景。本發(fā)明的生物制劑的制備方法簡單，篩選出了成本低廉的工業(yè)大規(guī)模培養(yǎng)用培養(yǎng)基，大大降低了生產(chǎn)成本，有利于該生物制劑的應(yīng)用普及。本發(fā)明所述萊氏野村菌(AbffitfraeaNrlOOl,已于2012年7月31日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡稱為CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所,該萊氏野村菌GVoffitfraea riIeyD^rlQQl的保藏編號(hào)為CGMCC N0.6387。


圖1不同濕度對(duì)NrlOOl菌落生長的影響趨勢 圖2不同濕度對(duì)NrlOOl孢子萌發(fā)的影響趨勢圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例1菌種分離
菌株的采集:2009年-2010年，于溫縣灘區(qū)王軍霞實(shí)驗(yàn)地、溫縣農(nóng)科所試驗(yàn)地、河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技試驗(yàn)示范基地(簡稱:河南農(nóng)科院基地)的地黃、花生、大豆田采集罹病僵蟲。菌株的分離:采用常規(guī)的蟲生真菌組織分離方法。用清水沖洗蟲體表面，75%酒精浸泡2s，無菌水沖洗2遍，然后用滅菌的解剖刀和鑷子將蟲體切成小塊，將其放在75%酒精中浸泡1.5min,無菌水浸泡2次，每次10s，再用無菌的小鑷子將蟲體塊接到PDA平板表面，28°C保濕培養(yǎng)，待蟲塊表面的菌絲長的比較明顯時(shí)，用牙簽挑起蟲體表面的菌絲轉(zhuǎn)接到加有100 μ L的青霉素G (50 yg/mL)和鏈霉素(50 μ g/mL)的PDA平板上，20 d后轉(zhuǎn)接在PDA斜面上，置4°C冰箱保存?zhèn)溆?。?分離得到的菌株
權(quán)利要求
1.一種蟲生真菌萊氏野村菌GVo皿raea ri7e_Fi) NrlOOl菌株，其保藏編號(hào)為CGMCCN0.6387。
2.權(quán)利用權(quán)利要求1所述蟲生真菌萊氏野村菌制得的孢子粉。
3.權(quán)利要求1所述蟲生真菌萊氏野村菌或權(quán)利要求2所述孢子粉在鱗翅目夜蛾科害蟲防治中的應(yīng)用。
4.權(quán)利用權(quán)利要求1所述蟲生真菌萊氏野村菌生產(chǎn)孢子的方法，包括以下步驟: (1)試管菌種制備:將NrlOOl菌株接種到試管SMAY斜面培養(yǎng)基上，26 28°C下培養(yǎng)144小時(shí)獲得試管菌種； (2)種子液制備:取斜面菌種，每支用滅菌的體積百分比為0.05%的Tween-80沖洗制得孢子液，接種到裝有50mL SMY的250mL三角瓶至終濃度為I X IO6孢子/mL，于26°C、180r/min搖床培養(yǎng)144小時(shí),作為液體種子液備用； (3)培養(yǎng)基質(zhì)制備:稱取一定量基質(zhì)料，并按2g:lml的固液比向基質(zhì)料中加入蒸餾水，經(jīng)高壓滅菌后冷卻，并按基質(zhì)料重量的4 8%加入麥芽糖和I 3%的酵母粉，即成培養(yǎng)基質(zhì)，所述基質(zhì)料為小麥、大豆、大米、麥麩中的至少一種，且所述大豆和小麥加蒸餾水浸泡至少12小時(shí)后再進(jìn)行高壓滅菌處理； (4)將上步所得基質(zhì)打碎凝結(jié)塊，并按lml:12g的接種量向其中接入步驟(2)所得種子液，充分搖勻，在如下的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)14d后分離出孢子:培養(yǎng)溫度25 30°C，95%的空氣濕度，PH6 8、8L光照。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述蟲生真菌萊氏野村菌生產(chǎn)孢子的方法，其特征在于，在所述步驟(3 )中，所述基質(zhì)料為大豆基質(zhì)，經(jīng)浸泡、高壓滅菌后，按大豆基質(zhì)重量的6%加入麥芽糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蟲生真菌萊氏野村菌及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用。該萊氏野村菌(Nomuraearileyi)Nr1001保藏編號(hào)為CGMCCNO.6387。所述微生物制劑由萊氏野村菌Nr1001發(fā)酵液、表面活性劑及防腐劑混配而成。所篩選出的Nr1001菌株殺蟲譜廣、殺蟲效果好，其對(duì)鱗翅目夜蛾科昆蟲如棉鈴蟲、甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、銀紋夜蛾、大豆夜蛾、煙夜蛾等幼蟲具有較強(qiáng)的侵染作用并使田間害蟲病害流行，有效降低害蟲的蟲口密度，起到較好的控害效果。
文檔編號(hào)C12N3/00GK103087924SQ20121048955
公開日2013年5月8日 申請日期2012年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月27日
發(fā)明者任應(yīng)黨, 崔筱, 張書杰, 劉新濤, 王剛, 劉玉霞, 趙輝, 劉紅彥 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院