專(zhuān)利名稱(chēng)：一種兔出血癥病毒“自殺性”dna疫苗及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物病毒學(xué)與動(dòng)物傳染病學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種兔出血癥病毒“自殺性” DNA疫苗及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease, RHD)俗稱(chēng)“兔痕”,是由兔出血癥病毒(RHDV)引起的一種急性高致死性兔傳染病。本病具有病死率高、死亡快，而且傳播迅速等特點(diǎn)，對(duì)養(yǎng)兔業(yè)的健康發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅，因而被國(guó)際獸疫局正式列為“國(guó)際動(dòng)物保健編目” B類(lèi)傳染病，我國(guó)農(nóng)業(yè)部也將之列為二類(lèi)動(dòng)物疫病。1984年初，劉勝江等在我國(guó)江蘇無(wú)錫首次發(fā)現(xiàn)兔瘟以后，本病迅即蔓延到我國(guó)25省市、自治區(qū)，其后，世界各地如墨西哥及
歐洲的許多國(guó)家也有類(lèi)似兔瘟流行，給養(yǎng)兔業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。RHDV的衣殼蛋白為病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，稱(chēng)VP60。該蛋白是RHDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，VP60構(gòu)成的立體結(jié)構(gòu)衣殼由180個(gè)完全相同的亞基組成，亞基之間相互作用然后形成具有三維構(gòu)象的衣殼。該組裝過(guò)程與各個(gè)亞基的N端序列有關(guān)，因?yàn)閷⒃搮^(qū)段缺失后，VP60就再不能裝配成空衣殼。RHDV在宿主細(xì)胞中完成一個(gè)復(fù)制周期后，由VP60組裝的空衣殼將子代RNA包裹形成成熟的病毒粒，然后隨著細(xì)胞的裂解釋放出來(lái)，侵染其它的敏感細(xì)胞。大量研究結(jié)果證明RHDV的衣殼蛋白與病毒的致病性和免疫原性密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)外的學(xué)者使用不同的表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了 VP60，用表達(dá)產(chǎn)物接種兔子可以誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，并能對(duì)抗RHDV的攻擊。兔出血癥病毒尚未建立體外組織細(xì)胞的培養(yǎng)方法，目前使用的疫苗主要為組織滅活苗。但隨著家兔飼養(yǎng)成本的提高以及非免疫兔的減少，可用于制苗的肝組織日趨減少，使組織滅活苗的成本偏高，加之組織滅活苗可能導(dǎo)致散毒的缺點(diǎn)，近年來(lái)人們著眼于兔瘟新型疫苗的研究。Berglund 等(Berglund P, Smerdou C, Fleeton MN, et al. Enhancing immuneresponses usingsuicidal DNAvaccines. Nat Biotech, 1998 ;16 :562-565)于 1998 年率先提出了以甲病毒復(fù)制子為基礎(chǔ)的“自殺性”DNA疫苗(suicidal DNAvaccine)的設(shè)想，即利用“自殺性’T)NA疫苗的甲病毒進(jìn)入細(xì)胞后能表達(dá)出甲病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(nSPs)，在nSPs的作用下甲病毒基因組RNA進(jìn)行高效復(fù)制，在此過(guò)程中產(chǎn)生大量的雙鏈RNA(dsRNA)中間體，最終可使轉(zhuǎn)染的細(xì)胞凋亡，基于甲病毒復(fù)制子的DNA疫苗可引起轉(zhuǎn)染的細(xì)胞凋亡，也稱(chēng)“自殺性"DNA疫苗，它比傳統(tǒng)DNA疫苗更安全，無(wú)整合到宿主染色體的潛在危險(xiǎn)性。自殺性DNA疫苗可引起高水平的體液免疫和細(xì)胞免疫，且可打破免疫耐受。在甲病毒基因組高效復(fù)制同時(shí)，目的抗原在亞基因組啟動(dòng)子的調(diào)控下獲得高效表達(dá)，從而可以較低的免疫劑量引起較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。自殺性DNA疫苗的載體是以甲病毒復(fù)制子為基礎(chǔ)的復(fù)制型DNA載體。病毒復(fù)制時(shí)結(jié)構(gòu)基因拷貝數(shù)高達(dá)IO5之多，因此可以利用亞基因組的啟動(dòng)子使外源基因獲得高效表達(dá)。自殺性DNA疫苗由于其具有RNA復(fù)制子，大量復(fù)制可導(dǎo)致感染細(xì)胞的凋亡。該凋亡可能是復(fù)制型載體在表達(dá)外源基因的過(guò)程中產(chǎn)生雙鏈RNA (dsRNA)復(fù)制中間體介入的結(jié)果。dsRNA能在細(xì)胞和體液免疫中起強(qiáng)大的輔助作用。后來(lái)，研究者將RNA復(fù)制子載體系統(tǒng)改造成以DNA為基礎(chǔ)的、RNA聚合酶依賴的系統(tǒng)。這種載體攜帶了甲病毒復(fù)制酶基因和外源基因的重組質(zhì)粒DNA，缺失了病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因。它通過(guò)將人巨細(xì)胞病毒(CMV)早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子序列插入到SP6啟動(dòng)子的上游或替換SP6啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。同時(shí),在多克隆位點(diǎn)下游插入強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)SV40晚期聚A信號(hào)序列，正常終止轉(zhuǎn)錄。該質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，利用宿主RNA聚合酶η在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄，合成甲病毒復(fù)制酶，再合成亞基因組RNA及大量外源蛋白，從而大大提高表達(dá)效率。因此，從自殺性DNA疫苗的構(gòu)建上我們可以看出其具有RNA疫苗和DNA疫苗的優(yōu)點(diǎn)，能自主復(fù)制、大量表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的在于提供一種兔出血癥病毒“自殺性” DNA疫苗，以解決現(xiàn)有技術(shù)中現(xiàn)有的RHDV疫苗一般為弱毒苗或滅活苗，弱毒苗存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)，而滅活苗往往需要多次免疫接種，而且效果不穩(wěn)定，還經(jīng)常導(dǎo)致免疫失敗的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明的第二目的在于提供一種兔出血癥病毒“自殺性” DNA疫苗的構(gòu)建方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗，該疫苗由RHDV-VP60基因和甲病毒復(fù)制子載體pSCA組成，其中，所述RHDV-VP60基因去掉了氨基端的31個(gè)氨基酸，其序列如SEQIDNO 1 所示。一種兔出血癥病毒“自殺性” DNA疫苗的構(gòu)建方法，包括如下步驟I)以發(fā)病兔內(nèi)臟組織為原料進(jìn)行RHDV病毒總RNA的提取；同時(shí)設(shè)計(jì)如下兩個(gè)特異性引物PSCA-VP60F :5，ATTGGATCCfe^ dGCCACCATGGGCGTGGTGGCCGC-3，，PSCA-VP60R :5，AGACCCGGGmTCAGACATAAGAAAAGCC-3，；2)以病毒總RNA為模板，使用反轉(zhuǎn)錄方法，以PSCA-VP60R為反轉(zhuǎn)錄引物合成PSCA-VP60的cDNA第一鏈，用特異性引物PSCA-VP60F和PSCA-VP60R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到缺失氨基端31個(gè)氨基酸的VP60基因，并用試劑盒純化回收；3)將擴(kuò)增的RHDV-VP60基因片段重組到甲病毒復(fù)制子載體pSCA真核表達(dá)質(zhì)粒中，即得到兔出血癥病毒“自殺性” DNA疫苗。優(yōu)選地，所述步驟I)中，RHDV病毒總RNA的提取方法為將RHDV病毒肌肉注射兩月齡的新西蘭大白兔，待新西蘭大白兔死亡后，取其肝臟制備研磨液，按常規(guī)方法提取RHDV病毒總RNA。優(yōu)選地，所述的反轉(zhuǎn)錄方法為用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄體系為=IOXBuffer 2 μ L、RNA/引物變性溶液
6μ L>2. 5mM dNTP Mixture 2 μ L、RNase Inhibitor 0. 25 μ L> RTaseM-MLV 0·5μ ,加滅菌蒸餾水9. 25 μ L，使反轉(zhuǎn)錄體系體積為20 μ L，其中所述的RNA/引物變性溶液制備方法為RNA模版5 μ L和特異性引物PSCA-VP60R I μ L在70°C水浴lOmin，冰上冷卻2min ;反轉(zhuǎn)錄過(guò)程為將提取的RHDV-VP6042°C溫浴Ih后，70°C水浴15min，最后置冰上2min，得到的樣品_20°C保存?zhèn)溆茫?br> PCR擴(kuò)增方法為反應(yīng)體系為2XPfuPCR MasterMix 12. 5 μ L、特異性引物 PSCA-VP60F O. 5 μ L、特異性引物PSCA-VP60R O. 5 μ L、模版cDNA 2 μ L，加滅菌蒸餾水9. 5 μ L，使反應(yīng)體系體積為25 μ L ;將上述反轉(zhuǎn)錄方法得到的樣品瞬間離心混合，采用熱蓋進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，過(guò)程為94°C預(yù)變性3min，然后94°C變性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸2min,30個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin后，10°C終止反應(yīng)，并用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒純化回收VP60cDNA片段。優(yōu)選地，PCR擴(kuò)增后獲得的RHDV-VP60基因片段大小為1647bp。優(yōu)選地，所述的步驟3)中，將擴(kuò)增VP60cDNA片段重組到甲病毒復(fù)制子載體pSCA真核表達(dá)質(zhì)粒中的過(guò)程具體如下A、將擴(kuò)增RHDV-VP60基因片段和pSCA空載體用BamHI和SmaI進(jìn)行雙酶切，并用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒純化回收； B、將純化回收的RHDV-VP60和pSCA空載體片段用T4DNA Ligase進(jìn)行連接，連接體系為10 XBuffer I μ L、T4DNALigase I μ L、RHDV-VP606 μ L、pSCA I μ L，加滅菌蒸餾水I μ L，使連接體系總體積為10 μ L，16°C水浴連接4h，之后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，混勻，冰浴放置30min，42°C水浴中熱激90S后迅速置冰上2min，然后涂布于氨芐抗性平板中，12h后挑取菌落并搖菌；C、將得到的菌液利用AxyPrep DNA質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定和經(jīng)Invitrogen公司測(cè)序顯示，結(jié)果完全正確，從而成功構(gòu)建成兔出血癥“自殺性” DNA疫苗。一種兔出血癥病毒“自殺性’DNA疫苗用于制備預(yù)防兔病毒性出血癥的藥物中的用途。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下I、提純質(zhì)粒DNA的工藝簡(jiǎn)便，因而生產(chǎn)成本較低，且適于大批量生產(chǎn)；2、DNA分子很穩(wěn)定，可制成DNA疫苗凍干苗，使用時(shí)在鹽溶液中可恢復(fù)原有活性，因而便于運(yùn)輸和保存；3、雖然DNA疫苗具有與弱毒疫苗相當(dāng)?shù)拿庖咴?，能激活?xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞而誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，但由于DNA序列編碼的僅是單一的一段病毒基因，基本沒(méi)有毒性逆轉(zhuǎn)的可能，因此不存在減毒疫苗毒力回升的危險(xiǎn)，而且由于機(jī)體免疫系統(tǒng)中DNA疫苗的抗原相關(guān)表位比較穩(wěn)定，因此DNA疫苗也不象弱毒疫苗或亞單位疫苗那樣，會(huì)出現(xiàn)表位丟失，因此，本發(fā)明的“自殺性” DNA疫苗比傳統(tǒng)疫苗更加安全、高效；4、本發(fā)明的“自殺性”DNA疫苗在動(dòng)物體內(nèi)一過(guò)性表達(dá)外源基因后，隨細(xì)胞凋亡而被機(jī)體清除，從而可避免DNA質(zhì)?？赡苷系剿拗骷?xì)胞染色體或可能造成免疫耐受等隱
串
■/Qi、O當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有優(yōu)點(diǎn)。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例用RT-PCR方法擴(kuò)增VP60基因的電泳檢測(cè)圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例pSCA-VP60重組質(zhì)粒酶切鑒定的電泳檢測(cè)圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例VP60基因在細(xì)胞中表達(dá)RT-PCR的電泳檢測(cè)圖；圖4為本發(fā)明實(shí)施例VP60基因在細(xì)胞中表達(dá)Westernblot圖5為本發(fā)明實(shí)施例VP60基因在細(xì)胞中表達(dá)后在熒光顯微鏡下的結(jié)構(gòu)圖，其中，a為重組質(zhì)粒pSCA-VP60轉(zhuǎn)染400 X ；b為陰性對(duì)照；圖6為構(gòu)建本發(fā)明的“自殺性” DNA疫苗PSCA/VP60的策略示意圖；圖7為本發(fā)明實(shí)施例的兔出血癥病毒“自殺性"DNA疫苗刺激兔子產(chǎn)生特異性抗體后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組于λ 450nm處測(cè)定每孔的OD值的對(duì)比圖；圖8為本發(fā)明實(shí)施例的兔出血癥病毒“自殺性"DNA疫苗刺激白兔T淋巴細(xì)胞增殖后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組于λ 570ηπι處測(cè)定OD值的對(duì)比圖；圖9為本發(fā)明實(shí)施例的兔出血癥病毒“自殺性” DNA疫苗刺激兔子IFN- Y，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組于λ 450ηπι處測(cè)定每孔的OD值的對(duì)比圖；圖10為本發(fā)明實(shí)施例的兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗刺激兔子IL_4，實(shí)驗(yàn)組 與對(duì)照組于λ 450nm處測(cè)定每孔的OD值的對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。本發(fā)明提供一種兔出血癥病毒“自殺性” DNA疫苗，該疫苗由RHDV-VP60基因和甲病毒復(fù)制子載體PSCA組成，如圖6，其中，所述RHDV-VP60基因是RHDV病毒的主要衣殼蛋白，并且去掉了氨基端的31個(gè)氨基酸，其序列如SEQ ID NO :I所示。實(shí)施例本實(shí)施例的兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗的構(gòu)建方法，參見(jiàn)圖6，具體包括如下步驟I)設(shè)計(jì)特異性引物和RHDV病毒總RNA的提取及純化設(shè)計(jì)特異性引物根據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的RHDV JX97株(序列登錄號(hào)為DQ205345)病毒VP60基因序列，利用Primer5. O軟件自行設(shè)計(jì)，由上海杰李生物技術(shù)有限公司合成以下引物PSCA-VP60F 5，ATTGGATCCfe^ I}GCCACCATGGGCGTGGTGGCCGC-3，， PSCA-VP60R 5，AGACCCGGGm TCAGACATAAGAAAAGCC-3，。RHDV病毒總RNA的提取及純化將RHDV病毒(國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號(hào)CVCCAV272)肌肉注射兩月齡的新西蘭大白兔，待新西蘭大白兔死亡后，取其肝臟制備研磨液，按常規(guī)方法提取RHDV病毒總RNA，具體為，將死亡后白兔解剖取其肝臟，用剪刀將肝臟剪碎研磨，并加入I %的雙抗，將研磨液反復(fù)凍融3次后，用Trizol法提取RNA。2)擴(kuò)增RHDV-VP60基因，去掉RHDV-VP60氨基端31個(gè)氨基酸將步驟I)提取的RNA，去掉RHDV-VP60氨基端31個(gè)氨基酸，具體步驟為以病毒總RNA為模板，使用PSCA-VP60R為反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA第一鏈，用上述特異性引物PSCA-VP60F和PSCA-VP60R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即得到缺失氨基端31個(gè)氨基酸的VP60基因。所述的RT-PCR擴(kuò)增，以及克隆得到RHDV-VP60的cDNA基因序列的步驟如下用Takara M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄體系為10XBuffer 2 μ L> RNA/引物變性溶液 6 μ L、dNTP Mixture (2. 5mM) 2 μ L、RNase Inhibitor 0. 25 μ L、RTaseM-MLVO.5 μ L，加滅菌蒸餾水9. 25 μ L，使反轉(zhuǎn)錄體系體積為20 μ L，其中RNA/引物變性溶液的制備如下將5 μ L提取的RNA和I μ L PSCA-VP60R引物均勻混合，70°C水浴IOmin后，冰上極冷2min，最后離心數(shù)秒。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程為將提取的RNA在42°C溫浴Ih后，70°C水浴15min，最后在冰上2min，_20°C保存?zhèn)溆?；PCR 反應(yīng)體系為2XPfu PCR MasterMix 12. 5 μ L、PSCA-VP60F O. 5 μ L、PSCA-VP60R0. 5 μ L、模版cDNA 2 μ L，加滅菌蒸餾水9. 5 μ L，使PCR反應(yīng)體系體積為25 μ L，將反轉(zhuǎn)錄得到的樣品瞬間離心混合，采用熱蓋進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)94°C預(yù)變性3min，然后94°C變性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸2min，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin后，10°C終止反應(yīng)，并用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒純化回收VP60cDNA片段。圖I為VP60基因擴(kuò)增后的電泳檢測(cè)圖，該檢測(cè)圖證明獲得RHDV-VP60基因擴(kuò)增片段大小為1647bp，其序列參見(jiàn)序列表。3)將步驟2)擴(kuò)增的VP60片段利用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒純化回收VP60cDNA 片段； 4)將步驟3)回收的VP60cDNA片段和pSCA空載體用BamHI和SmaI進(jìn)行雙酶切，并利用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒純化回收VP60cDNA和pSCA空載體片段；5)將回收的VP60cDNA和pSCA空載體片段用Takara公司的T4DNALigase進(jìn)行連
接，連接體系如下
f T4 DNA Ligase.1 uuL
10 X BufferI .OiiL
IOuL I \rp<50 基H6JiiL
pSCA空載體IOwL
ιI ^uL連接體系為10uL，16°C水浴連接30min，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109，混勻，冰浴放置30min，42°C水浴中熱激90S后迅速置冰上2min，然后涂布于氨芐抗性平板中，12h后挑取菌落并搖菌；6)將步驟5)得到的菌液利用AxyPrep DNA質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒；7)重組質(zhì)粒酶切鑒定根據(jù)引物中所帶酶切位點(diǎn)，將步驟6)中抽提得到的質(zhì)粒用BamHI.Sma I進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切反應(yīng)體系如下
r 重組,猶粒 5uL
10.TO. M
IOwL JBSAO.—HiL
IBaniHI5 IiL
Silli I0,5 L
、.IdH-. O3i L酶切反應(yīng)體系為10uL，37°C水浴2h，然后用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切鑒定結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果如圖2，載體條帶大小為11489bp，目的基因的條帶大小為1647bp，與預(yù)期一致，初步判定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。8)重組質(zhì)粒pSCA_VP60經(jīng)Invitrogen公司測(cè)序,顯示結(jié)果完全正確。至此，成功將VP60基因重組到甲病毒復(fù)制子載體pSCA真核表達(dá)載體中，構(gòu)建了一種兔出血癥病毒“自殺性” DNA疫苗-抗RHDV的pSCA-VP60RHDV疫苗。對(duì)上述制備的pSCA-VP60RHDV疫苗外源VP60基因體外瞬時(shí)表達(dá)進(jìn)行鑒定，包括如下幾個(gè)方面I) VP60基因的體外mRNA表達(dá)鑒定RT_PCR法檢測(cè)將BHK-21細(xì)胞在六孔板中生長(zhǎng)，當(dāng)BHK-21細(xì)胞在六孔板中長(zhǎng)到80%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過(guò)程如下:⑴將5μ g pSCA-VP60質(zhì)粒和10 μ g脂質(zhì)體分別加入到兩組250ulOpti-MEM培養(yǎng)液中，輕輕混勻，靜置5min ； (2)將含pSCA_VP60質(zhì)粒的Opti-MEM培養(yǎng)液加 入到含脂質(zhì)體的Opti-MEM培養(yǎng)液中，輕輕混勻，靜置20min ； (3)將六孔板中的培養(yǎng)液吸出并棄掉，用PBS (磷酸鹽緩沖液)洗BHK-21細(xì)胞3次，然后加入含pSCA_VP60質(zhì)粒和脂質(zhì)體的Opti-MEM混合液500ul，再加500ul Opti-MEM于六孔板中，輕輕搖勻；(4)放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中，5h后換含F(xiàn)BS(胎牛血清)的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，48h后取出BHK-21細(xì)胞，PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌3次后胰酶消化，然后離心棄上清，得到的細(xì)胞沉淀用于提取RNA，RNA用特異性引物PSCA-VP60R進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板，用引物PSCA-VP60F和PSCA-VP60R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min，94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸2min,30個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin，得到的PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖3，條帶大小為1647bp，與目的基因大小一樣，成功檢測(cè)到mRNA，說(shuō)明目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到BHK-21細(xì)胞內(nèi)。2)VP60基因體外表達(dá)鑒定Western blot法檢測(cè)將BHK-21細(xì)胞在六孔板中生長(zhǎng)，當(dāng)BHK-21細(xì)胞在六孔板中長(zhǎng)到80%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過(guò)程如下:⑴將5μ g pSCA-VP60質(zhì)粒和10 μ g脂質(zhì)體分別加入到兩組250ulOpti-MEM培養(yǎng)液中，輕輕混勻，靜置5min ； (2)將含質(zhì)粒的Opti-MEM培養(yǎng)液加入到含脂質(zhì)體的Opti-MEM培養(yǎng)液中，輕輕混勻，靜置20min ;(3)將六孔板中的培養(yǎng)液吸出并棄掉，用PBS洗BHK-21細(xì)胞3次，然后加入含pSCA_VP60質(zhì)粒和脂質(zhì)體的Opti-MEM混合液500ul，再加500ul Opti-MEM于六孔板中，輕輕搖勻；(4)放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中，5h后換含F(xiàn)BS (胎牛血清)的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，48h后取出BHK-21細(xì)胞，反復(fù)凍融裂解，跑10%SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠)電泳，最后將電泳分離的細(xì)胞總蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF(聚偏氟乙烯)膜，用封閉液(5%脫脂乳配制)37°C封閉30min。加入I : 200稀釋的VP60多抗血清，37°C下孵育lh。用PBST (磷酸鹽吐溫緩沖液)清洗3次，5min/次。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)作為二抗與之反應(yīng)，37°C下孵育50min，用PBST清洗3次最后用DAB顯色試劑盒(購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司)顯色，如圖4，條帶大小與VP60蛋白大小一致，說(shuō)明VP60蛋白成功獲得表達(dá)。3) VP60基因體外表達(dá)鑒定IFA法檢測(cè)將BHK-21細(xì)胞在六孔板中生長(zhǎng)，當(dāng)BHK-21細(xì)胞在六孔板中長(zhǎng)到80%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過(guò)程如下(1)將5μ g PSCA-VP60質(zhì)粒和IOyg脂質(zhì)體分別加入到兩組250ulOpti-MEM培養(yǎng)液中，輕輕混勻，靜置5min ； (2)將含pSCA_VP60質(zhì)粒的Opti-MEM培養(yǎng)液加入到含脂質(zhì)體的Opti-MEM培養(yǎng)液中，輕輕混勻，靜置20min ； (3)將六孔板中的培養(yǎng)液吸出并棄掉，用PBS洗BHK-21細(xì)胞3次，然后加入含pSCA_VP60質(zhì)粒和脂質(zhì)體的Opti-MEM混合液500ul，再加500ul Opti-MEM于六孔板中，輕輕搖勻；(4)放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中，5h后換含F(xiàn)BS (胎牛血清)的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，48h后取出BHK-21細(xì)胞，用PBS液洗3次，5min/次。將培養(yǎng)的細(xì)胞用丙酮甲醇=I I固定液4°C固定15min。用PBST清洗3次，5min/次。用封閉液(5%脫脂乳配制)37°C封閉30min。加入I : 200稀釋的VP60多抗血清，37°C下孵育lh。用PBST清洗3次，5min/次。加入I : 1000稀釋的FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗(購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，37°C下孵育40min。PBST清洗3次，IOmin/次。最后置于倒置熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果，如圖5，pSCA-VP60轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞具有很強(qiáng)的特異性熒光，而未轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞無(wú)特異性熒光，說(shuō)明VP60蛋白獲得表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物存在于BHK-21細(xì)胞內(nèi)。對(duì)上述得到的pSCA-VP60RHDV疫苗的免疫效果進(jìn)行檢驗(yàn)，包括如下幾個(gè)方面l)pSCA-VP60RHDV疫苗在兔子內(nèi)免疫反應(yīng)的特異性抗體檢測(cè)將8只兩月齡兔子隨機(jī)分為2組，每組4只，分別免疫pSCA-VP60和PBS，肌肉注射免疫兩次，每次間隔兩周，在第一次免疫后第2周、第二次免疫后第2周，對(duì)免疫組PSCA-VP60和對(duì)照組PBS的兔子進(jìn)行耳靜脈采血，血液于37°C靜置lh，再于4°C冰箱中靜置過(guò)夜。最后，用5000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速，離心15分鐘，得到血清。用間接ELISA法測(cè)定該血清抗體的0D450值，以RHDV-VP60原核表達(dá)蛋白為包被抗原(5 μ g/孔)于96孔酶標(biāo)板上，被檢兔子血清為一抗，過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)為二抗，同時(shí)設(shè)立不加被檢血清的空白對(duì)照，顯色終止后，用酶標(biāo)儀測(cè)定上述各樣品在450nm處的吸光值，并用SAS統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果如表I和圖7，該結(jié)果顯示免疫組與對(duì)照組比較差異顯著，免疫組可以獲得好的免疫效果。表I特異性抗體檢測(cè)結(jié)果
IQP450—
I第一·次免g丨+第二 欠兔ISρΒ€ΑΛΨ6(}H34
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I 空白對(duì)麗CUij I 046 —2) pSCA-VP60RHDV疫苗在兔子體內(nèi)T淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)將8只兩月齡兔子隨機(jī)分為2組，每組4只，分別免疫PSCA-VP60和PBS，肌肉注射免疫兩次，每次間隔兩周，在第一次免疫后第2周、第二次免疫后第2周，對(duì)免疫組PSCA-VP60和對(duì)照組PBS的兔子進(jìn)行耳靜脈采血分離淋巴細(xì)胞，以含10% FBS (胎牛血清)的DMEM(極限必需培養(yǎng)基)稀釋成I X 10/mL的細(xì)胞懸液。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔加入100 μ L細(xì)胞懸液，同時(shí)設(shè)DMEM(極限必需培養(yǎng)基)自身對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)8個(gè)重復(fù)孔。培養(yǎng)板置37°C、5% CO飽和濕度條件下培養(yǎng)68h后，每孔加10 μ LMTT (4，5-二甲基噻唑-2) (5mg/mL)，孵育4h，加入50ul 二甲基亞砜DMSO溶液終止反應(yīng)，待藍(lán)色沉淀溶解后于λ 570nm處測(cè)定OD值，對(duì)測(cè)得數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如表2和圖8，該結(jié)果顯示免疫組與對(duì)照組比較差異顯著，免疫組可以獲得好的免疫效果。表2T淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗，其特征在于，該疫苗由RHDV-VP60基因和甲病毒復(fù)制子載體PSCA組成，其中，所述RHDV-VP60基因去掉了氨基端的31個(gè)氨基酸，其序列如SEQ ID NO 1所示。
2.一種兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟 1)以發(fā)病兔內(nèi)臟組織為原料進(jìn)行RHDV病毒總RNA的提取；同時(shí)設(shè)計(jì)如下兩個(gè)特異性引物PSCA-VP60F :5，ATTGGATCCteanffl DGCCACCATGGGCGTGGTGGCCGC-3，，PSCA-VP60R :5’ AGACCCGGGuTCAGACATAAGAAAAGCC-3，； 2)以病毒總RNA為模板，使用反轉(zhuǎn)錄方法，以PSCA-VP60R為反轉(zhuǎn)錄引物合成PSCA-VP60的cDNA第一鏈，之后用特異性引物PSCA-VP60F和PSCA-VP60R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到缺失氨基端31個(gè)氨基酸的VP60基因，并用試劑盒純化回收； 3)將擴(kuò)增的RHDV-VP60基因片段重組到甲病毒復(fù)制子載體pSCA真核表達(dá)質(zhì)粒中，即得到兔出血癥病毒“自殺性” DNA疫苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟I)中，RHDV病毒總RNA的提取方法為將RHDV病毒肌肉注射兩月齡的新西蘭大白兔，待新西蘭大白兔死亡后，取其肝臟制備研磨液，按常規(guī)方法提取RHDV病毒總RNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的反轉(zhuǎn)錄方法為 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系為=IOXBuffer 2 μ L、RNA/引物變性溶液6 μ L>2. 5mM dNTP Mixture 2 μ L、RNase Inhibitor 0. 25 μ L> RTaseM-MLV 0·5μ ,加滅菌蒸餾水9. 25 μ L，使反轉(zhuǎn)錄體系體積為20 μ L，其中所述的RNA/引物變性溶液制備方法為RNA模版5 μ L和特異性引物PSCA-VP60R I μ L在70°C水浴lOmin，冰上冷卻2min ;反轉(zhuǎn)錄過(guò)程為將提取的RHDV-VP6042°C溫浴Ih后，70°C水浴15min，最后置冰上2min，得到的樣品_20°C保存?zhèn)溆茫? PCR擴(kuò)增方法為 反應(yīng)體系為2XPfu PCR MasterMix 12. 5 μ L、特異性引物 PSCA-VP60F 0.5yL、特異性引物PSCA-VP60R O. 5 μ L、模版cDNA 2 μ L，加滅菌蒸餾水9. 5 μ L，使反應(yīng)體系體積為25 μ L ;將上述反轉(zhuǎn)錄方法得到的樣品瞬間離心混合，采用熱蓋進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，過(guò)程為94°C預(yù)變性3min，然后94°C變性Imin，56°C退火Imin，72°C延伸2min，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin后，10°C終止反應(yīng)，并用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒純化回收VP60cDNA片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增后獲得的RHDV-VP60基因片段大小為1647bp。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于， 述的步驟3)中，將擴(kuò)增的VP60cDNA片段重組到甲病毒復(fù)制子載體pSCA真核表達(dá)質(zhì)粒中的過(guò)程具體如下 A、將擴(kuò)增的RHDV-VP60基因片段和pSCA空載體用BamHI和SmaI進(jìn)行雙酶切，并用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒純化回收； B、將純化回收的RHDV-VP60和pSCA空載體片段用T4DNALigase進(jìn)行連接，連接體系為10XBuffer I μ L、T4DNALigase I μ L、RHDV-VP606 μ L、pSCA I μ L，加滅菌蒸餾水I μ L，使連接體系總體積為10 μ L，16°C水浴連接4h，之后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，混勻，冰浴放置30min，42°C水浴中熱激90S后迅速置冰上2min，然后涂布于氨芐抗性平板中，12h后挑取菌落并搖菌； C、將得到的菌液利用AxyPrep DNA質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定和經(jīng)invitrogen公司測(cè)序顯示，結(jié)果完全正確，從而成功構(gòu)建成兔出血癥“自殺性” DNA疫苗。
7.一種兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗用于制備預(yù)防兔病毒性出血癥的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗及其構(gòu)建方法。本發(fā)明的兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗，由RHDV-VP60基因和甲病毒復(fù)制子載體pSCA組成。該DNA疫苗的構(gòu)建方法包括RHDV病毒總RNA的提取及純化，設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，克隆得到RHDV-VP60的cDNA基因序列，去掉RHDV-VP60氨基端31個(gè)氨基酸，最后將純化后的VP60cDNA片段重組到甲病毒復(fù)制子載體pSCA真核表達(dá)質(zhì)粒中。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的疫苗安全高效，并可隨細(xì)胞凋亡而被機(jī)體清除，從而避免DNA質(zhì)?？赡苷系剿拗骷?xì)胞染色體或可能造成免疫耐受等隱患，且更長(zhǎng)效穩(wěn)定，操作便捷。
文檔編號(hào)C12N15/66GK102935240SQ20121048936
公開(kāi)日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2012年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月26日
發(fā)明者劉光清, 程英杰, 孟春春, 陳宗艷, 李傳峰 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所