專利名稱：棉花事件mon 88913及其組合物和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到植物分子生物學領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及草甘膦耐受的棉花事件M0N88913，以及在植物樣品及其組合物中分析檢測棉花事件M0N88913DNA存在的方法。
背景技術(shù)：
棉花是世界上很多地區(qū)的重要的纖維作物。生物技術(shù)的方法已經(jīng)應用到棉花上用于改善其農(nóng)藝性狀和產(chǎn)品的質(zhì)量。向棉花植物中引入轉(zhuǎn)基因的方法已經(jīng)在美國專利5，004，863中得到證明。棉花生產(chǎn)中一個這樣的重要的農(nóng)藝性狀是除草劑耐受性，具體地說，對草甘膦除草劑的耐受性。這個性狀引入到了棉花植物中并且是現(xiàn)在用于棉花生產(chǎn)中的成功產(chǎn)品。目前商業(yè)化的RoundupReady 棉花事件(1445)在四葉齡期間表現(xiàn)出對Roundup 的活性組分的草甘膦的極好的耐受性(Nida等，J.Agric.FoodChem.44:1960-1966，1996 ；Nida etal.，J.Agric.Food Chem.44:1967-1974，1996)。然而，由于在某些環(huán)境條件下，超過 四葉齡時進行的葉面施用必須受到限制，這歸因于在雄性生殖組織中耐受性不足。雄性生殖耐受性的缺失看來似乎是在關(guān)鍵組織中CP4 EPSPS的不充分表達的結(jié)果，這些組織對草甘膦高度敏感，并且草甘膦在這些嚴重衰敗的組織(strong sink tissues)中大量積累(Pline 等，Weed Sc1.50:438-447, 2002)。存在著對比RoundupReady 棉花1445具有更高的草甘膦耐受的棉花植物的需要。為了確定有性繁殖的后代是否含有目的轉(zhuǎn)基因，能檢測特定事件的存在是有利的。此外，檢測特定事件的方法將有利于遵守例如進入市場前許可所要求的規(guī)定、或來自重組體農(nóng)作物的食品標記的規(guī)定。通過任何已知的諸如聚合酶鏈式反應(PCR)或使用核酸探針的DNA雜交法的核酸檢測方法，可檢測轉(zhuǎn)基因的存在。這些檢測方法通常集中于常用的遺傳組件，如啟動子、3'轉(zhuǎn)錄終止子、標記基因等。結(jié)果，這些方法不能用于區(qū)別不同事件之間的差別，具體是那些使用相同的DNA構(gòu)建體的產(chǎn)物，除非已知基因組染色體DNA臨近于所插入的DNA("側(cè)翼基因組DNA")。用于草甘膦耐受的棉花事件1445的事件特異性DNA檢測方法已經(jīng)得以闡述(US20020120964，此處全部引用作為參考)。本發(fā)明涉及到草甘膦耐受的棉花事件M0N88913、其所含有的組合物、以及涉及用于在棉花事件M0N88913及其后代中檢測轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)域的方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及到被命名為M0N88913的轉(zhuǎn)基因棉花事件，其具有保藏號為PTA-4854的存放于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的種子。本發(fā)明的另一方面包括棉花事件M0N88913的后代植物或種子，或植物和種子的可再生部分。本發(fā)明也包括棉花事件M0N88913的植物部分，包括但不局限于花粉、胚珠、花、棉桃、棉絨、芽、根和葉。本發(fā)明涉及具有草甘膦耐受性表型和M0N88913的新的遺傳組合物的棉花植物。本發(fā)明的一個方面提供了 DNA組合物和用于檢測來自棉花事件M0N88913的轉(zhuǎn)基因/基因組連接區(qū)域存在的方法。提供了分離的DNA分子，它包含至少一個選自SEQ ID NO:I和SEQ ID NO:2的轉(zhuǎn)基因/基因組連接DNA分子及其互補序列，其中連接分子跨越了插入位點，所述插入位點包含插入到棉花基因組和基因組DNA的異源DNA，所述棉花基因組和基團組DNA來自棉花事件M0N88913中插入位點兩側(cè)的棉花細胞。含有這些分子的棉籽及其植物材料也是本發(fā)明的一個方面。提供了作為5'轉(zhuǎn)基因/基因組區(qū)域SEQ ID NO:3或其互補物的分離的新DNA分子，其中這個DNA分子在棉花事件M0N88913中是新的。在其基因組中含有SEQ ID NO:3的棉花植物和種子是本發(fā)明的一個方面。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了作為3'轉(zhuǎn)基因/基因組區(qū)域SEQ IDNO:4或其互補序列的分離的新DNA分子，其中這個DNA分子在棉花事件M0N88913中新的。在其基因組中含有SEQ ID NO:4的棉花植物和種子是本發(fā)明的一個方面。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于DNA擴增方法的兩條DNA分子，其中第一個DNA分子包含SEQ ID NO:3的DNA分子的轉(zhuǎn)基因區(qū)域上的任意部分的至少長11個或更多個連續(xù)的多核苷酸，以及SEQ IDNO:3的棉花基因組5'側(cè)翼區(qū)域的任意部分的相似長度的DNA分子，其中一起應用時，這些DNA分子可用作生產(chǎn)擴增子的DNA擴增方法中的DNA引物組。在DNA擴增方法中使用DNA引物組所產(chǎn)生的擴增子，可用于診斷棉花事件M0N88913。通過同源于或互補于SEQ ID NO:3的任意部分的DNA引物，從M0N88913DNA生產(chǎn)的任何擴增子，是本發(fā)明的一方面。根據(jù)本發(fā)明的另一方面 ，提供兩條用于DNA擴增方法的DNA分子，其中第一個DNA分子包含SEQ ID NO:4的DNA分子的轉(zhuǎn)基因區(qū)域上的任意部分的至少長11個或更多個連續(xù)的多核苷酸，以及SEQ ID NO:4的棉花基因組3'側(cè)翼區(qū)域的任意部分的相似長度的DNA分子，其中這些DNA分子可用作生產(chǎn)擴增子的DNA擴增方法中的DNA引物組。在DNA擴增方法中使用DNA引物組所產(chǎn)生的擴增子，可用于診斷棉花事件M0N88913。通過同源于或互補于SEQ ID NO:4的任意部分的DNA引物，從M0N88913DNA生產(chǎn)的任何擴增子，是本發(fā)明的一個方面。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供在樣品中檢測特異性地對應于棉花事件M0N88913DNA的DNA存在的方法。所述方法包括:(a)將包含DNA的樣品與引物組進行接觸，當該引物組與來自棉花事件M0N88913的基因組DNA —起被用于核酸擴增反應時，產(chǎn)生用于診斷棉花事件M0N88913的擴增子；(b)進行核酸擴增反應，由此產(chǎn)生擴增子；和(c)檢測擴增子。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供在樣品中檢測特異性地對應于棉花事件M0N88913DNA的DNA存在的方法。所述方法包括:(a)將含有DNA的樣品同含有SEQ ID NO:I或SEQ ID NO:2的DNA探針相接觸，該探針在嚴謹?shù)碾s交條件下與來自棉花事件M0N88913的基因組DNA雜交，而在嚴謹?shù)碾s交條件下不與對照棉花植物DNA雜交；(b)將樣品和探針置于嚴謹?shù)碾s交條件下；和(c)檢測探針與棉花事件M0N88913DNA的雜交。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供生產(chǎn)耐受草甘膦施用的棉花植物的方法，該方法包括:(a)將包含本發(fā)明的可賦予對草甘膦施用的耐受性的表達盒的第一親本棉花事件M0N88913，與缺乏草甘膦耐受性的第二親本進行有性雜交，由此產(chǎn)生的大量的后代植物；和
(b)選擇耐受草甘膦施用的后代。該方法可任擇地包括使后代植物同第二親本棉花植物的回交和選擇草甘膦耐受性的后代以產(chǎn)生耐受草甘膦施用的純育的棉花變種的步驟。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供用于確定棉花事件M0N88913后代的接合性的方法，包括:(a)將包含棉花 DNA 的樣品與包含 SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQID N0:24、和SEQ ID NO:25的引物組進行接觸，當所述引物組與來自棉花事件M0N88913的基因組DNA—起被用于核酸擴增反應時，產(chǎn)生用于診斷棉花事件M0N88913的第一擴增子；和(b)進行核酸擴增反應，由此產(chǎn)生第一個擴增子；和(c)檢測第一個擴增子；和(d)將包含棉花DNA的樣品與引物組進行接觸，當所述引物組與來自棉花的基因組DNA—起被用于核酸擴增反應時，產(chǎn)生包含天然棉花基因組DNA的第二擴增子，所述天然棉花基因組DNA同源于被鑒定為棉花事件M0N88913的轉(zhuǎn)基因插入的棉花基因組區(qū)；和(e)進行核酸擴增反應，由此產(chǎn)生第二擴增子；和(f)檢測第二擴增子；和(g)比較樣品中的第一和第二擴增子，其中兩個擴增子的存在表明該樣品對轉(zhuǎn)基因插入是雜合的。檢測接合性的方法包括將棉花DNA樣品與包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQid NO:23, seq id NO:24和seq ID NO:25的引物和探針進行接觸；使用終點Taqman PCR條件；和檢測擴增子產(chǎn)物?？刂泼藁ㄊ录﨧0N88913的作物或田地中雜草的方法，包括向M0N88913棉田中施用含有有效量草甘膦的除草劑的步驟。因此，本發(fā)明具體地涉及:1.被命名為M0N88913并 具有保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)并具有保藏號PTA-4854的代表性種子的棉花事件的種子。2.通過使第I項的種子生長所得到的棉花植物或其部分。3.第2項的棉花植物或其部分，包括花粉、胚珠、花、棉桃、棉絨、芽、根或葉。4.第2項的棉花植物的草甘膦耐受性后代。5.第4項的后代棉花植物，其中所述棉花植物的基因組含有一個或更多個選自SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 的 DNA 分子。6.第4項的后代棉花植物或種子或其部分，其基因組在DNA擴增方法中產(chǎn)生包含SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO:2 的擴增子。7.分離的DNA多核苷酸引物分子，包含可用于DNA擴增方法中以生產(chǎn)擴增子的SEQ ID NO:3或其互補序列的至少11個連續(xù)的核苷酸，所述擴增子包含用于診斷棉花事件M0N88913 的 SEQ ID NO:1。8.分離的DNA多核苷酸引物分子，包含可用于DNA擴增方法中來生產(chǎn)擴增子的SEQ ID NO:4或其互補序列的至少11個連續(xù)的核苷酸，所述擴增子包含用于診斷棉花事件M0N88913 的 SEQ ID NO:2。9.DNA檢測試劑盒，包括至少一個由與SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4同源或互補的11個或更多個連續(xù)的核苷酸組成的分子，當該試劑盒被用于DNA擴增方法中時，產(chǎn)生包含用于診斷棉花事件M0N88913的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的擴增子。10.生產(chǎn)耐受草甘膦除草劑施用的棉花植物的方法，包括:
(a)將第一草甘膦耐受棉花事件M0N88913的親本植物與缺乏草甘膦除草劑耐受性的第二親本棉花植物進行有性雜交，由此產(chǎn)生大量的第一后代植物；和(b)選擇耐受草甘膦的第一后代植物；和(c)自交所述的第一后代植物，由此產(chǎn)生大量的第二后代植物；和(d)從所述的第二后代植物中選擇草甘膦耐受性植物。11.第10項的方法 ，進一步包括將耐受草甘膦的第一后代植物或耐受草甘膦的第二后代植物，與第二親本植物或第三親本植物進行回交，由此產(chǎn)生耐受草甘膦施用的植物的步驟。12.檢測樣品中對應于棉花事件M0N88913的DNA存在的方法，該方法包括:(a)將包含DNA的樣品與DNA引物組進行接觸，當該引物組與來自棉花事件M0N88913的基因組DNA —起用于核酸擴增反應時，產(chǎn)生包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的診斷性擴增子；(b)進行核酸擴增反應，由此產(chǎn)生診斷性擴增子；和(C)檢測該診斷性擴增子。13.在第12項的方法中，其中所述的引物組包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:24o14.在第12項的方法中，所述的引物組包含SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27和SEQID NO:28ο15.檢測樣品中對應于棉花事件Μ0Ν88913的DNA存在的方法，該方法包括:(a)將含有DNA的樣品與探針進行接觸，該探針在嚴謹?shù)碾s交條件下與來自棉花事件M0N88913的基因組DNA雜交，并且在嚴謹?shù)碾s交條件下不與對照棉花植物DNA雜交，其中該探針同源于或互補于SEQID NO:1或SEQ ID NO:2 ;和(b)將樣品和探針置于嚴謹?shù)碾s交條件下；和(C)檢測探針與DNA的雜交。16.包含與標記多核酸的互補序列遺傳性連鎖的草甘膦耐受性狀的棉花植物，其中所述的標記多核酸分子同源于或互補于選自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的DNA分子。17.確定棉花事件M0N88913的后代的接合性的方法，包括:(a)將包含棉花 DNA 的樣品與包含 SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22 和 SEQ ID NO:23的引物組進行接觸，當該引物組與來自棉花事件M0N88913的基因組DNA —起被用于核酸擴增反應時，產(chǎn)生用于診斷棉花事件M0N88913的第一擴增子；和(b)進行核酸擴增反應，由此產(chǎn)生第一擴增子；和(C)檢測第一擴增子；和(d)將包含棉花DNA的樣品與所述引物組進行接觸，當該引物組與來自棉花事件的基因組DNA —起被用于核酸擴增反應時，產(chǎn)生包含天然棉花基因組DNA的第二擴增子，所述天然棉花基因組DNA同源于被鑒定為棉花事件M0N88913的轉(zhuǎn)基因插入的棉花基因組區(qū)；和(e)進行核酸擴增反應，由此產(chǎn)生第二擴增子；和(f)檢測第二擴增子；和(g)比較樣品中的第一和第二擴增子，其中這兩個擴增子的存在表明該樣品對于轉(zhuǎn)基因插入是雜合的。18.確定棉花事件M0N88913的后代的接合性的方法，包括:(a)將包含棉花 DNA 的樣品與包含 SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的引物組進行接觸；和(b)進行核酸擴增反應；和(c)檢測該反應的產(chǎn)物。19.在棉花事件M0N88913的農(nóng)作物中控制雜草的方法，包括對該棉花事件M0N88913的農(nóng)作物施用有效劑量的含除草劑的草甘膦的步驟。本發(fā)明的前述和其它方面將在以下詳述和附圖中變得更加顯然。附圖簡述

圖1.pM0N51915的質(zhì)粒圖譜。圖2.在棉花事件M0N88913中插入物的基因組構(gòu)成。圖3.M0N88913 的 5' DNA 連接序列(SEQ ID NO:1)和 3' DNA 連接序列(SEQ IDNO:2)。圖4.M0N88913 的 5'轉(zhuǎn)基因 / 基因組 DNA 區(qū)域(SEQ ID NO:3)。圖5.M0N88913 的 3'轉(zhuǎn)基因 / 基因組 DNA 區(qū)域(SEQ ID NO:4)。優(yōu)選實施方案的詳述本發(fā)明涉及耐受草甘膦的棉花事件M0N88913、其中所包含的組合物和檢測棉花事件M0N88913及其后代中轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)域的方法。提供以下定義和方法以更好地詳細說明本發(fā)明，并指導本領(lǐng)域技術(shù)人員實施本發(fā)明。除非另外指出，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域中的常規(guī)用法來理解術(shù)語和縮略詞。分子生物學的普通術(shù)語的定義也可在Rieger等，Glossary of Genetics !Classical and Molecular,5th edition, Springer-Verlag:New York, 1991 ;和 Lewin, Genes V, Oxford University Press:New York, 1994 中找到。如37CFR § 1.822所列出的，使用于用于DNA堿基命名法。如此處所用的,術(shù)語“棉花”意指陸地棉(Gossypiumhirsutum)并且包含了所有的能夠同棉花事件M0N88913交配的植物品種。本發(fā)明的植物是棉花植物，更具體地說，是棉花植物M0N88913。如此處所用的，術(shù)語“包括”意指“包含但不限于”。如此處所用的，術(shù)語“農(nóng)作物”意指栽培植物或植物的部分，如種植于田地、小區(qū)、田壟(row)、溫室、平地、或容器中的植物。"草甘膦"是指N-膦酰甲基甘氨酸(N-phosphonomethylglycine)和其鹽。N-膦酰甲基甘氨酸是一個眾所周知的對廣譜的植物品種具有活性的除草劑。草甘膦是Roundup (Monsanto C0.)的活性成分，是一個在環(huán)境中具有理想的短半衰期的安全除草劑。草甘膦是Roundup 除草劑(Monsanto C0.)的活性成分。使用“草甘膦除草劑”進行的處理是指利用Roundup 、RoundupUltra 、Roundup Pro 除草劑或任何含草甘膦的其它除草劑配制劑進行的處理。商業(yè)化的草甘膦配制劑包括但不限于MonsantoCompany 出售的如ROUNDUP 、ROUNDUP ULTRA、ROUNDUP ULTRAMAX、ROUNDUP WEATHERMAX、R0UNDUPCT、ROUNDUP EXTRA、ROUNDUP BIACTIVE、ROUNDUP BIOFORCE、RODEO 、POLARIS 、SPARK 和ACCORD 除草劑，其含有草甘膦作為它的鹽；MonSanto Company出售的ROUNDUP DRY和RIVAL 其含有草甘膦作為它的銨鹽；M0nsant0 Company出售的ROUNDUP GE0F0RCE,其含有草甘膦作為它的銨鹽；Syngenta Crop Protection出售的TOUCHDCTWN 除草劑，其含有草甘膦作為它的三甲磺酰鹽。當施用到植物表面時，草甘膦可進入植物全身。由于它抑制可提供用于合成芳族氨基酸前體的莽草酸途徑，草甘膦具有植物毒性。草甘膦抑制了植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的磷酸烯醇式丙酮酰莽草酸合成酶(EPSPS)。草甘膦耐受性可以通過表達對草甘膦嚴謹性較低并因此在草甘膦存在下可以保留其催化活性的細菌EPSPS變體和植物EPSPS變體來實現(xiàn)(美國專利5，633，435、5，094，945、4，535，060、和 6，040，497)。轉(zhuǎn)基因“事件”通過異源DNA如含有目的基因的核苷酸構(gòu)建體(pM0N51915，圖1)轉(zhuǎn)化植物細胞，再生由轉(zhuǎn)基因插入植物細胞的基因組而產(chǎn)生的植物群體，并且挑選以插入到特殊基因組位點為特征的特殊植物而得以制備。術(shù)語“事件”指最初的轉(zhuǎn)化體植物和含有異源DNA的轉(zhuǎn)化體后代。術(shù)語“事件”也包括通過在事件和另一個植物之間進行有性異型雜交而生產(chǎn)的后代，其中該后代含有異源DNA。即使在與回歸親本進行重復回交后，來自于轉(zhuǎn)化的親本事件的插入的DNA和側(cè)翼基因組DNA也還存在于雜交后代中的同一染色體位點。術(shù)語“事件”也指來自于含有插入DNA和與插入DNA直接相鄰的側(cè)翼基因組序列的DNA的原始轉(zhuǎn)化體，可以預計這段DNA將被轉(zhuǎn)移到后代中，并且作為一個含有插入的DNA的親本系與不含有插入的DNA的親本系進行有性雜交的結(jié)果，所述后代接收了包含目的轉(zhuǎn)基因的插入DNA (如原始轉(zhuǎn)化體和由自交產(chǎn)生的后代)。已知在植物中外源基因的表達受到它們所在染色體上位置的影響，這可能是由于染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)(如異染色質(zhì))或靠近整合位點的轉(zhuǎn)錄調(diào)控組件(如增強子)(Weising等，Ann.Rev.Genet22:421-477,1988)。因此，常常需要篩選大量的轉(zhuǎn)基因植物來用于鑒定以所導入的目的基因的最佳表達為特征的事件。例如，在植物和其它生物體中觀察到導入的轉(zhuǎn)基因在不同事件中的表達水平有著廣泛的差異。表達的時間或空間模式也有不同，例如，在不同的轉(zhuǎn)基因植物組織內(nèi)轉(zhuǎn)基因相對表達的差異，這與根據(jù)導入基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控組件的推測的表達模式不符合。因此，通常生產(chǎn)成百上千個不同的事件并從這些事件中篩選具有期望的轉(zhuǎn)基因表達水平和用于商業(yè) 目的模式的單個事件。使用常規(guī)育種方法通過有性雜交，具有期望轉(zhuǎn)基因表達的水平或模式可用于將轉(zhuǎn)基因基因滲入其它遺傳背景中。所述雜交的后代保持了原始轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因表達特性。這個策略可用于在大量的品種中確?？煽康幕虮磉_，以使其更好地適應當?shù)厣L條件和市場要求。草甘膦耐受棉花植物可以通過將由通過PM0N51915中含有的植物表達盒轉(zhuǎn)化而衍生的轉(zhuǎn)基因棉花植物細胞發(fā)育而來的棉花植物組成的并且耐受草甘膦施用的第一親本棉花植物，與缺少對草甘膦除草劑的耐受性的第二親本植物進行有性雜交，由此產(chǎn)生大量的第一后代植物；隨后選擇耐受草甘膦的第一后代植物；自交第一代后代植物，由此產(chǎn)生大量的第二代后代植物；隨后從第二后代植物中選擇耐受草甘膦的植物。這些步驟中還包括使第一代草甘膦耐受性后代植物或第二代草甘膦耐受性植物后代與第二親本植物或第三親本棉花植物回交，因此產(chǎn)生耐受草甘膦除草劑施用的棉花植物。本發(fā)明中，這些轉(zhuǎn)基因棉花植物也被命名為棉花事件M0N88913并在此可以被稱為M0N88913。也可以理解的是也能夠?qū)蓚€不同的轉(zhuǎn)基因植物交配而產(chǎn)生含有兩個獨立地分離添加的外源基因的后代。適當?shù)暮蟠淖越荒軌虍a(chǎn)生對于兩個所添加的外源基因純合的植物。也可預期通過非轉(zhuǎn)基因植物對親本植物進行回交和異型雜交，其稱為無性繁殖。通常用于不同性狀和農(nóng)作物的其它育種方法的描述，可在幾篇參考文獻的一篇中找到，如Fehr，in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J.ed., American Society ofAgronomy, Madison WI(1987)0“探針”是一段分離的連接有常規(guī)可檢測的標記或報告分子，如放射性同位素、配體、化學發(fā)光試劑或酶的核酸。這樣的探針可以互補于目標核酸鏈，就本發(fā)明而言，互補于來自M0N88913的基因組DNA鏈，無論它來自M0N88913植物還是來自包含M0N88913DNA的樣品。根據(jù)本發(fā)明的探針不僅包括脫氧核糖核酸或核糖核酸，也包括特異性地結(jié)合目標DNA序列和用于檢測目的DNA序列存在的聚酰胺和其它探針材料。DNA引物是分離的多核酸，它們通過核酸雜交與互補的目標DNA鏈退火形成引物和目標DNA鏈的雜交子，隨后經(jīng)聚合酶如DNA聚合酶沿著目標DNA鏈延長。本發(fā)明中的DNA引物對或引物組是指至少兩個用于通過如聚合酶鏈式反應(PCR)或其它常規(guī)核酸擴增方法來擴增目標核酸序列的DNA引物分子。探針和引物一般是11個或更長的多核苷酸，通常是18個或更長的多核苷酸、24個或更長的多核苷酸、或30個或更長的多核苷酸。選擇具有足夠的長度在高嚴謹雜交條件下特異性地雜交目標序列的探針和引物。優(yōu)選地，盡管保持同目標序列雜交的能力并且不同于目標序列的探針可以通過傳統(tǒng)方法設(shè)計得到，然而根據(jù)本發(fā)明的探針和引物具有與目標序列完全的序列相似性。制備與使用探針和引物的方 法描述在，如Molecular Cloning:ALaboratoryManual,2nd ed., vol.1-3, ed.Sambrook 等，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY, 1989 (在下文，"Sambrook 等，1989 " ) ；Current Protocols inMolecular Biology, ed.Ausubel 等，Greene Publishing and Wiley-1nterscience, NewYork, 1992 (定期更新)(在下文，"Ausubel 等，1992 ");和 Innis 等，PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications, Academic Press:San Diego, 1990 中。PCR DNA 引物對能從已知序列衍生得到，例如，通過使用為此目的設(shè)計的計算機程序，如Primer (Version0.5, 1991 ,Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA)。根據(jù)此處公開的在基因組DNA和轉(zhuǎn)基因的插入序列側(cè)翼的引物和探針，通過常規(guī)方法，如通過分離來自M0N88913基因組的DNA、對轉(zhuǎn)基因/基因組區(qū)進行重新克隆和對所述的DNA分子進行測序，可用于確認(或者，如果需要，修正)所公開的DNA序列。本發(fā)明的核酸探針和引物在嚴謹條件下同目標DNA分子雜交。任何常規(guī)的核酸雜交或擴增的方法都可以用于在樣品中鑒定來自轉(zhuǎn)基因事件的DNA存在。在某些情況下，多核酸分子或其片段能特異性地雜交其它核酸分子。如此處所用的，如果兩個分子能形成反向雙鏈的核酸結(jié)構(gòu)，則兩個多核酸分子被稱為能彼此特異性地結(jié)合。如果兩個核酸分子顯示出完全互補，一個核酸分子被稱為另一個核酸分子的互補物。如此處所用的，當一個核酸分子的每個核苷酸互補于另一個核酸分子的核苷酸，這些分子被稱為表現(xiàn)出完全互補。當兩個分子相互雜交能保持足夠的穩(wěn)定以使它們在至少是常規(guī)的“低嚴謹”條件下互相退火，則這兩個分子被稱為“最低限度互補”。類似的，兩個分子相互雜交能保持足夠的穩(wěn)定以使它們在常規(guī)的“高嚴謹”條件下互相退火，這些分子被稱為“互補”。常規(guī)嚴謹條件如Sambrook 等，1989,和 Haymes 等，Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach,IRL Press, Washington, DC (1985)所述。因此允許相對于完全互補有偏離，只要所述偏離沒有完全排除分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力。為了使核酸分子用作引物或探針，僅僅需要核酸分子在序列上是充分互補的，以能夠在所用的特定溶劑和鹽濃度下形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。如此處所用的，基本上同源的DNA序列是指在高嚴謹條件下，可與跟它比較的目標DNA分子的互補序列特異地雜交的DNA分子序列。促進DNA雜交的合適的嚴謹條件，如在約45°C下的6.0X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，隨后在50°C以2.0 X SSC洗滌，是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的或者可以在 Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6查到。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可選自低嚴謹?shù)?0°C下的2.0XSSC到高嚴謹?shù)?0°C下的0.2X SSC0此外，洗滌步驟的溫度也可以從大約22°C的室溫的低嚴謹條件升高到大約65°C的高嚴謹條件。溫度和鹽濃度都是可以變化的，或溫度或鹽濃度保持恒定而改變另一個參數(shù)。在優(yōu)選的實施方案中，在中度嚴謹?shù)臈l件下例如約
2.0X SSC和約65°C下，本發(fā)明的多核酸分子特異地雜交如SEQ ID NO:3或4所列的一個或多個核酸分子或其互補序列或二者之一的片斷。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，在高嚴謹?shù)臈l件下，本發(fā)明的核酸特異地雜交如SEQ ID NO:3或4所列的一個或多個核酸分子或互補序列或二者之一的片斷。在本發(fā)明的一方面中，本發(fā)明優(yōu)選的標記核酸分子具有如SEQID NO:1或2所列的一個或多個核酸序列或其互補序列或二者之一的片斷。在本發(fā)明的另一方面中，本發(fā)明優(yōu)選的標記核酸分子共有與SEQ ID NO:1或2所列的核酸分子或其互補序列或二者之一的片斷具有序列同一'I"生的基本部分，其中序列同一'I"生介于80%和100%或90%和100%之間。在本發(fā)明的更進一方面中，本發(fā)明優(yōu)選的標記核酸分子共有與SEQ IDNO:1或2所列的核酸分子或其互補分子或二者之一的片斷95 %和100 %的序列同一性。SEQID NO:1或SEQ ID NO:2可以在植物育種方法中用作鑒定遺傳雜交的后代的標記，這類似于簡單序列重復DNA標記分析所描述的方法，"DNA markers !Protocols, applications,and overviews: (1997) 173-185, Cregan,等,eds.，Wiley-Liss NY ;在此全部引用作為參考。探針對目標DNA分子 的雜交可通過本領(lǐng)域技術(shù)員已知的任一方法得以檢測，這些方法包括但不限于熒光標簽法、放射性標簽法、基于抗體的標簽法和化學發(fā)光標簽法。關(guān)于利用特定的擴增 引物對進行的目標核苷酸序列的擴增(如，通過PCR)，“嚴謹條件”指的是允許引物對僅與目標核酸序列雜交的條件，其中具有相應野生型序列(或其互補序列)的引物在DNA熱擴增反應中將結(jié)合并優(yōu)選產(chǎn)生一個獨特的擴增產(chǎn)物-擴增子。術(shù)語“特異于(目標序列)”是指在嚴謹雜交條件下探針或引物僅同包含有目標序列的樣品中的目標序列雜交。正如在此所用的，"擴增的DNA"或"擴增子"是指針對多核酸模板一部分的目標多核酸分子的多核酸擴增方法的產(chǎn)物。例如，為了確定棉花植物是否是含有來自本發(fā)明的棉花事件M0N88913植物的轉(zhuǎn)基因事件基因組DNA進行有性雜交的結(jié)果，將從棉花植物組織樣品提取的DNA經(jīng)過多核酸擴增方法，使用包含來源于緊鄰插入異源DNA的插入位點的M0N88913基因組的DNA序列的一條引物和來源于插入的異源DNA (轉(zhuǎn)基因DNA)的第二條引物的引物對，以生產(chǎn)用于診斷MON88913事件DNA的存在的增強子。診斷性擴增子具有一定的長度并具有用于診斷事件的DNA序列。擴增子的長度范圍可在引物對加一個核苷酸堿基對、優(yōu)選地加大約五十個核苷酸堿基對(bps)、更優(yōu)選地加大約二百五十個核苷酸堿基對、并且更加優(yōu)選的大約二四百五十個或更多個核苷酸堿基對之間變化?；蛘?，引物對可來源于插入的異源DNA兩邊的基因組序列，由此產(chǎn)生包含全部插入物多核酸序列的擴增子(如，分離自SEQ ID NO:3的基因組部分的正向引物，分離自SEQ ID NO:4的基因組部分的反向引物，后者擴增包含了兩個PM0N5191OTNA片斷的表達盒的DNA分子所述片斷被插入M0N88913基因組中，該插入物包含8512bp的插入物，圖2)。來自植物基因組序列的引物對的成員可以與插入的DNA序列相距一定的距離，該距離的范圍可以在從一個核苷酸堿基對到最高大約兩萬個核苷酸堿基對的范圍內(nèi)變化。使用術(shù)語"擴增子"特別排除了在DNA熱擴增反應中形成的引物二聚體。多核酸擴增可以通過本領(lǐng)域已知的各種多核酸擴增方法來實現(xiàn)，包括聚合酶鏈式反應(PCR)。擴增方法是本領(lǐng)域已知的，并在尤其是在美國專利04，683，195和4，683，202和PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications, ed.1nnis 等Academic Press,San Diego，7990得以描述。PCR擴增方法已發(fā)展成可擴增最多22kb (千堿基)的基因組DNA 和最多 42kb 的噬菌體 DNA (Cheng 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:5695-5699,1994)。這些方法以及本領(lǐng)域已知的其它方法可用于實施本發(fā)明。使用源于本文中提供的序列的引物，通過擴增來自M0N88913種子或由保存于ATCC并具有保藏號PTA-4854的種子發(fā)育的植物的DNA分子，隨后對PCR擴增子或其克隆的DNA片斷進行標準DNA測序，可檢驗異源DNA插入序列或來自M0N8891的側(cè)翼基因組DNA序列(且如果需要得以校正)?；贒NA擴增方法的DNA檢測試劑盒含有特異性地擴增診斷性擴增子的DNA引物。該試劑盒提供基于檢測方法的、終點Taqman 的、或任何本領(lǐng)域已知的檢測診斷性擴增子的方法的瓊脂糖。包含與SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的任何一部分同源或互補的DNA引物的試劑盒是本發(fā)明的一個目的?？梢酝ㄟ^多種技術(shù)來檢測通過這些方法產(chǎn)生的擴增子。一個所述的方法是遺傳彼特分析(Nikiforov，等.Nucleic Acid Res.22:4167_4175，1994)，其中設(shè)計可重疊基因組序列和插入的DNA序列的相鄰側(cè)翼的DNA寡核苷酸。將寡核苷酸固定在微量滴定板的孔中。在對目的區(qū)域進行PCR后(使用插入序列中的一個引物和基因組序列的相鄰側(cè)翼的一個引物)，可以將單鏈PCR產(chǎn)物同固定的寡核苷酸雜交并作為模板用于利用DNA聚合酶和特異于下一個期望堿基的標記雙脫氧核苷酸三磷酸鹽(ddNTPs)所進行的單堿基延伸反應。讀數(shù)器可以是熒光的或基于ELISA的。信號表明轉(zhuǎn)基因/基因組序列的存在歸因于成功的擴增、雜交和單堿基延伸。另一個方法是Winge (Innov.Pharma.Tech.00: 18-24, 2000)描述的高溫測序(pyrosequencing)技術(shù)。在這個方法中，設(shè)計重疊相鄰的基因組DNA和插入DNA連接區(qū)的寡核苷酸。使寡核苷酸與來自目的區(qū)域的單鏈PCR產(chǎn)物(一引物位于插入序列，另一引物位于側(cè)翼基因組序列)雜交，并和DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶、酰苷5'磷酰硫酸鹽以及熒光素一起溫育。單獨加入脫氧核苷三磷酸(dNTPs)并且摻入導致了被測定的光信號。光信號表明轉(zhuǎn)基因/基因組序列的存在歸因于成功的擴增、雜交和單堿基或多堿基延伸。 如Chen等描述的突光偏振(Genome Res.9:492-498,1999)是一種可用于檢測本發(fā)明的擴增子的方法。在使用此方法時，涉及重疊基因組側(cè)翼和插入DNA的連接區(qū)的寡核苷酸。將寡核苷酸與來自目的區(qū)域的單鏈PCR產(chǎn)物(一個引物位于插入序列，另一個引物位于側(cè)翼基因組序列)雜交，并和DNA聚合酶以及熒光標記的ddNTP —起溫育。單堿基延伸導致ddNTP的摻入。使用熒光計根據(jù)偏振的變化可以測量摻入。偏振的變化表明轉(zhuǎn)基因/基因組序列的存在歸因于成功的擴增、雜交和單堿基延伸。Taqman (PE Applied Biosystems, Foster City, CA)作為檢測并定量 DNA 存在的方法得以描述，并可以通過生產(chǎn)商所提供的說明書得以充分了解。簡要地，設(shè)計重疊基因組側(cè)翼和插入DNA連接區(qū)的FRET寡核苷酸探針。使FRET探針和PCR引物(一個引物位于插入序列，另一引物位于側(cè)翼 基因組序列)在熱穩(wěn)定聚合酶和dNTPs存在下循環(huán)。FRET探針的雜交導致FRET探針的猝滅部分斷裂并釋放出熒光部分。熒光信號表明轉(zhuǎn)基因/基因組序列的存在，歸因于成功的擴增和雜交。Tyangi 等(Nature Biotech.14:303-308,1996)描述了分子信標(molecularBeacon)可用于序列檢測。簡要地，設(shè)計重疊側(cè)翼基因組和插入DNA連接區(qū)的FRET寡核苷酸探針。FRET探針的獨特結(jié)構(gòu)使其含有在很接近時保持熒光和淬滅部分的二級結(jié)構(gòu)。將FRET探針和PCR引物(一個引物位于插入序列中，另一引物位于側(cè)翼基因組序列中)在熱穩(wěn)定聚合酶和dNTPs存在下循環(huán)。伴隨著成功的PCR擴增，F(xiàn)RET探針與目標序列的雜交導致探針二級結(jié)構(gòu)的去除以及熒光和猝滅部分的空間分離。產(chǎn)生了熒光信號。熒光信號表明轉(zhuǎn)基因/基因組序列的存在，歸因于成功的擴增和雜交。使用此處公開的組合物和在DNA檢測領(lǐng)域中熟知的方法可以研制出DNA檢測試劑盒。該試劑盒可用于鑒定樣品中棉花事件M0N88913DNA，并能應用于培育含有M0N88913DNA的棉花植物的方法。試劑盒含有可用作引物和探針的DNA序列，并且該序列同源于或互補于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的任何部分、或同源于或互補于pM0N51915的任一轉(zhuǎn)基因遺傳組件中包含的DNA，所述pM0N51915已經(jīng)被插入M0N88913DNA中(圖2)。這些DNA序列可用于DNA擴增方法(PCR),或用作多核酸雜交方法中的探針,如Southern分析、northern分析的探針。含有M0N88913DNA(圖2)的轉(zhuǎn)基因遺傳組件包括第一個表達盒，該表達盒包含以擬南芥(Arabidopsis)延伸因子I a (At.Efl α )啟動子作為嵌合組件構(gòu)建的玄參嵌合體啟動子(FMV35S/Eflα，美國專利6，462，258，SEQ ID NO:28，在此全部引入作為參考)，并且其有效連接擬南芥延伸因子1-a的翻譯前導序列(leader)和內(nèi)含子(如Axelos等描述的 Genbank 登錄號 X16430, Mol.Gen.Genet.219:106-112，1989)、有效連接擬南芥 EPSPS的葉綠體轉(zhuǎn)運肽(TS-At.EPSPS:CTP2,Klee 等，Mol.Gen.Genet.210:47-442,1987)、有效連接來自土壤桿菌屬菌株CP4的耐受草甘膦的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(aroA:CP4，美國專利5，633，435)、有效連接來自豌豆的核酮糖l，5-二磷酸羧化酶E9的3'終止區(qū)域(T-Ps.RbcS2:E9，Coruzzi，等，EMBO J.3:1671-1679，1984)，而第二個表達盒含有包括Act8基因(SEQID NO:29，美國專利6，462，258)的第一個內(nèi)含子的CaMV35S_Act8啟動子，并且其有效連接擬南芥EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運肽(TS-At.EPSPS:CTP2)、有效連接來自土壤桿菌屬菌株CP4的耐受草甘膦的EPSPS (aroA:CP4，美國專利5，633，435，在此全部引用作為參考)、有效連接來自豌豆的核酮糖l，5-二磷酸羧化酶E9的3'終止區(qū)域。下列實施例包括了用于證明本發(fā)明的某些優(yōu)選的實施方案的實施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理解，實施例中公開的技術(shù)代表發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明實施中有效的技術(shù)，因此可認為其組成了用于實施本發(fā)明的優(yōu)選模式。然而，根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應當理解，可在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，在公開的具體實施方案中進行多種改變，而仍可獲得相同或相似的結(jié)果。
實施例實施例1使用于源于pM0N51915(圖1)的DNA片段，通過農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化棉花細胞來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因棉花事件M0N88913。使用三親本交配方法將植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建體pM0N51915交配到農(nóng)桿菌(Ditta等，Proc.Natl.Acad.Sc1.77:7347-7351，1980)中。根據(jù)下述的方法利用轉(zhuǎn)基因?qū)嵤┟藁毎霓D(zhuǎn)化:美國專利5，004, 863、美國專利5，159，135、美國專利5，518，908，在此全部引入作為參考。棉花轉(zhuǎn)化基本上按W0/0036911或U.S.Patent5, 846，797中所述的方法進行實施，在此全部引入作為參考。對這些方法的改良包括但不局限于下列實施例。Cokerl30種子經(jīng)表面消毒并黑暗發(fā)芽。從發(fā)芽的籽苗上切下長約1_1.5厘米的胚軸外植體。將經(jīng)轉(zhuǎn)化含有pM0N51915的根癌農(nóng)桿菌菌株ABI (Agrobacterium tumefaciens strainABI)在不含抗生素的LB培養(yǎng)基(Luria broth)中在28°C生長16小時，然后稀釋成約2 X IO8細菌/毫升(ml)。將胚軸外植體浸入農(nóng)桿菌接種體中2-5分鐘，然后在MS+1.9mg/1ΚΝ03+3%葡萄糖(TRM)上以每平板30外植體于24°C在暗處共培養(yǎng)約45小時。將外植體轉(zhuǎn)移到含有150mg/l頭孢霉素和300EM草甘膦的TRM上培養(yǎng)四個培養(yǎng)周期，每個培養(yǎng)周期大約為6周。在第三或第四培養(yǎng)周期結(jié)束時，從原始外植體上分離胚胎發(fā)生愈傷組織(embryogenic calli)并放置到同樣的培養(yǎng)基上。通過簡單地在液體TRM+3%葡萄糖中懸浮胚胎發(fā)生愈傷組織進行一次亞培養(yǎng)， 然后把懸浮液倒在‘TRM’ +150mg/l頭孢霉素+300 μ M草甘膦平板上。在液體亞培養(yǎng)后3-8周收集體細胞胚，然后在含0.5%葡萄糖的Stewart和Hsu培養(yǎng)基上生長。讓來源于體細胞胚的小苗在含有以40mM N03/10mMNH4+2%蔗糖改良的Stewart&Hsu培養(yǎng)基的Magenta盒中成熟到約4-7cm(3_6片葉)。隨后將這些植物移植到盆栽土中，以4"盆、100%濕度、每天光照16小時處理4-6天，隨后以50%濕度處理5-10天。pM0N51915的DNA片段含有兩個插入到M0N88913基因組(圖2)中的轉(zhuǎn)基因表達盒，該表達盒總體上賦予了 M0N88913和其后代以草甘膦耐受性。M0N88913植物和種子具有可再生部分。種子的可再生部分包括但不限于胚芽、子葉和芽或根的分生組織。植物的可再生部分包括但不限于葉片、葉柄、胚軸、莖部分和頂點以及根分生組織。本發(fā)明也包括棉花事件M0N88913的植物部分，其包括但不限于花粉、胚珠、花、園莢、纖維、芽、根和葉。本發(fā)明也包括M0N88913種子中的可提取組分，其包括但不限于蛋白質(zhì)、粗粉、面粉、果殼、油和棉絨纖維。實施例2草甘膦耐受性棉花事件M0N88913選自很多耐受草甘膦營養(yǎng)性和生殖性傷害的轉(zhuǎn)基因棉花事件。商品級品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因事件的成功生產(chǎn)目前需要生產(chǎn)大量的事件。在本發(fā)明中，M0N88913是通過大量不同的包括pM0N51915的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的約1000R0事件中的一個事件。通過一系列的分子分析和草甘膦耐受性篩選從許多事件中選擇M0N88913事件。在溫室草甘膦耐受性測試中，對植物的營養(yǎng)性和生殖性耐受性進行評分，從而篩選事件。將來自每個事件的十五到二十五個Rl種子種植于含有MetrO-Mix350培養(yǎng)基的15個槽盤(cell tray)中，該盤含有泥炭、蛭石、營養(yǎng)物、潤濕劑和加工過的樹皮和灰燼的混和物。培養(yǎng)基中含有的追肥是 0smocotel4-14_14、Osmocote Plusl5_9_12 和 MicroMax 微量元素。所有植物都在溫室內(nèi)生長。生長季節(jié)期間白天平均溫度是32攝氏度(°C)，而夜晚平均溫度是24°C。光周期設(shè)定為具有最大光強度的16小時光照和8小時黑暗。生長循環(huán)期間的平均相對濕度是45 %。隨后，植物在4葉期和8葉期連續(xù)以48oz/A (oz =盎司，A =英畝)噴灑Roundup Ultra (含草甘膦的除草劑)。在四葉期施用草甘膦七天后，評價植物受到的植物性傷害且收集分離草甘膦耐受表型的。使用這些數(shù)據(jù)來確證事件轉(zhuǎn)基因插入物是遵循孟德爾遺傳模式的單顯性基因的模式。具有良好的營養(yǎng)性耐性的事件隨后被移植到含有上述相同的Metro-Mix350培養(yǎng)基的10英寸盤中并長至成熟。由于需要調(diào)節(jié)植物高度，以Pix Plus (BASF, Research Triangle Park, NC)處理植物。在移植后三個月，在最初的五個結(jié)果枝的最初結(jié)果位置對植物的棉桃保持力(retention)進行繪圖。該植物繪圖的保持力的最大值是5 (五個棉桃保留下來)。這提供了一個迅速、間接的植物生育力的測定方法。經(jīng)過溫室篩選，目前的商業(yè)化事件(RR棉花1445)的平均保持力少于1.0。采集平均棉桃保持力值高于或等于三的事件，并用于進一步的篩選。具有棉桃保持力高于或等于二的事件具有作為新的草甘膦耐受性植物篩選的值。通過DNA印跡來分析符合Roundup Ultra營養(yǎng)性和生殖性的耐受標準的事件的拷貝數(shù)目。對在最初的溫室實驗中表現(xiàn)良好的耐受性的單拷貝事件進一步在:1)以高草甘膦率進行的額外溫室耐受實驗、2)重復的田間實驗中和通過3)額外的分子篩選進行表征。使用純合體植物實施溫室耐受性測試。在所有的實驗中含有作為對照的目前商業(yè)化Roundup Ready 棉花事件的1445事件(商品標準)。將種子種植于15個槽盤并在四葉期用64oz/A Roundup Ultra 處理而在八葉期用96oz/A Roundup Ultra 處理。隨后將植物移植到10英寸的盆中，而在中季對四株植物在首次五個結(jié)果枝的首次結(jié)果位置進行繪圖。收集所有事件的季節(jié)末期的數(shù)據(jù)，包括重量、棉桃數(shù)、棉桃尺寸和棉桃保持力。使用田間測試來篩選顯示最好的生長率、果實保持力和產(chǎn)量的事件。按隨機分區(qū)方案安排田間實驗，進行三次重復和三次處理。將事件種植在兩排、30英尺的小塊土地里。處理由不噴灑的、在4、6、10、 14節(jié)點期噴灑64oz/A(l.51b ae/A)Roundup Ultra 和在4、
6、10、14節(jié)點期噴灑96oz/A(L 51b ae/A) Roundup Ultra 組成。每塊地在十株植物上完成中季繪圖。收集在首次五個結(jié)果節(jié)點的第一和第二結(jié)果位置的棉桃保持力數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)給出0-10的數(shù)值范圍。在0-10分值上，棉桃保持力值等于或大于3的植物被評定為新的草甘膦耐受性的植物篩選。比較M0N88913和RR棉花1445的棉絨產(chǎn)量(磅/畝、I磅/畝)的田間測試(10個位置)顯示M0N88913基本上提供了防止草甘膦(酸當量磅/畝、Ib ae/A)對產(chǎn)量的影響(表I)。產(chǎn)量是棉桃保持力的衡量標準，為了獲得草甘膦耐受性而工程化的棉花植物，其在第一和第二結(jié)果位置保留了基本數(shù)量的棉桃，這將保持相對于非草甘膦耐受性棉花植物在產(chǎn)量上的優(yōu)勢。根據(jù)要被控制的雜草種類和雜草發(fā)育時期的不同，含有有效劑量的草甘膦的除草劑，其用于控制M0N88913田間中的對照雜草，大約包含4oz/A，并可大于128oz/A。草甘膦可以與其它除草劑混合以增強除草劑對某些雜草種類的活性。表1.在草甘膦處理后M0N88913和1445的棉絨產(chǎn)量的比較。10小區(qū)域的產(chǎn)量(lb/A)草甘膦處理 O Ib ae/A1.5 Ib ae/A 2.25 Ib ae/A 14452421.841044.19831.47
MON 88913 2551.582587.612412.3實施例3通過使用CTAB 方法(Rogers 等，Plant Mol.Biol.5:69-76,1985)或根據(jù)生產(chǎn)商的說明書的Dneasy 96植物試劑盒(目錄號69181, Qiagen Inc., Valencia, CA)對用于所有PCR反應和Southernblot分析的棉花基因組DNA進行分離。收集2_4葉期的葉片組織。從各株植物收集最小的真葉并立即干冰冷凍。使用例如以下方法提取DNA。使用塑料珠在液氮中磨碎組織，向0.75克(g)組織中加入5ml提取緩沖液并在55°C溫育45分鐘。CTAB提取緩沖液由IOOmM Tris ρΗ8.0、1.4Μ NaCl、20mMEDTA、添加了 5 μ I (微升)β -巰基乙醇的2% CTAB、5 μ IRNA酶和1% PVPP組成。隨后用等體積的氯仿(5ml)抽提樣品，然后在室溫以3700轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。將水相轉(zhuǎn)移到新離心管，并用等體積的異丙醇沉淀DNA。以3700轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘后，用70%的乙醇洗滌沉淀、空氣干燥并重懸于250 μ I水中。使用TAIL-PCR(Liu 等，Plant Journal 8:457-463,1995)獲得用于 M0N88913事件的鄰近于轉(zhuǎn)基因插入的棉花基因組DNA。使用GenomeWalker試劑盒(CloneTechLaboratories, Palo Alto, CA)按生產(chǎn)方法實施基因組DNA的延伸。簡單地,將使用前述CTAB方法所分離的DNA( 5μ g)通過多種限制性內(nèi)切酶(EcoPV，Scal)在100 μ I的總體積中于37°C消化過夜。使用QLAquick PCR純化柱(cat#28104，Qiagen，Inc.)除去限制性內(nèi)切酶。接頭(adaptor)分子連接法是已在生產(chǎn)方法中描述的方法。使用用于初級反應的FMV-1 引物(SEQ ID NO:5)和 APl 引物(CloneTech Laboratories)，以及用于次級反應的巢式 FMV-2 引物(SEQ IDNO:6)和 AP2 引物(CloneTech Laboratories)來擴增 DNA。使用反向PCR來分離M 0N88913的3'轉(zhuǎn)基因/基因組DNA。使用三個限制性酶Bell、NcoI和HindIII消化總基因組DNA( 10 μ g)。在37°C消化過夜后，經(jīng)QIAquickPCR純化柱對DNA進行純化。用50 μ I水從柱子上洗脫DNA并稀釋到lml。將稀釋的洗脫液(85 μ I)與10 μ I緩沖液(IOX)和5μ I Τ4連接酶混合以環(huán)化片段。在16°C溫育過夜后，將連接酶在70°C下熱失活。使用一系列巢式引物通過PCR擴增樣品。PCR的引物組合包括:用于BclI 和NcoI 樣品的引物對8099-E9-l/E9-2(SEQID NO:7/SEQ ID NO:8)和用于HindIII 樣品的引物對 8099-E9-l/Act8 反向(SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:9);用于 BclI 和NcoI 樣品的引物對8099-E9-2/E9-1 (SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:11)和用于HindIII 樣品的引物對 8099-E9-2/Act8(SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:12);用于 BclI 和 NcoI 樣品的引物對8099-E9-3/E9-1 (SEQ ID NO:13/SEQ ID NO:11)和用于HindIII樣品的引物對8099-E9-3/Act8 (SEQ ID NO:13/SEQ ID NO:12)。PCR 條件包括:初級 PCR = 7 個循環(huán)的 94°C 2 秒鐘、720C 10分鐘；37個循環(huán)的94°C 2秒鐘、67°C 10分鐘；1個循環(huán)的67°C 10分鐘；第二級和第三級PCR = 5個循環(huán)的94°C 2秒鐘、72°C 10分鐘；24個循環(huán)的94°C 2秒鐘、67°C 10分鐘；1個循環(huán)67 V 10分鐘?；蛘?，可以通過M0N88913事件的Y末端的PCR進行DNA擴增，其條件包括:7個循環(huán)的94°C 25秒鐘、72°C 3分鐘；37個循環(huán)的94°C 25秒鐘、67°C 3分鐘；1個循環(huán)的67 V 7分鐘。所有后續(xù)的擴增按下列條件操作:7個循環(huán)的94°C 2秒鐘、72°C 4分鐘；37個循環(huán)的94°C 2秒鐘、67°C 4分鐘；1個循環(huán)的67V I分鐘。所有的擴增子在0.8%瓊脂糖膠上通過溴化乙錠染色得以顯現(xiàn)。通過直接使用QIAquick PCR純化試劑盒(cat&num ；28104, QiagenInc.)純化 PCR樣品，或使用 QIAquick Gel Extraction 試劑盒(cat#28704, Qiagen Inc.)通過從凝膠上提取合適的片斷來制備DNA，用于測序。設(shè)計了一系列的DNA引物，對M0N88913的轉(zhuǎn)基因插入物和鄰近的側(cè)翼基因組區(qū)域進行測序。通過五個重疊片斷，設(shè)計可允許擴增全部的轉(zhuǎn)基因和基因組側(cè)翼序列的DNA引物。設(shè)計可允許單獨擴增各個EPSPS-CTP2/aroA-CP4/RbcS2:E9區(qū)域的專一性引物(uniqueprimer)。對于所有用于測序的片斷，重復擴增了三次。DNA引物對組合被用作5'轉(zhuǎn)基因/基因組區(qū)域(SEQ ID N0:14和SEQ ID NO:15),3/轉(zhuǎn)基因/基因組區(qū)域((SEQ ID NO:16和 SEQ ID NO:17)和插入遺傳組件(SEQ ID NO: 18 和 SEQ ID NO:11 ；SEQ ID NO:19 和 SEQID NO:15 ；SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:11)的測序引物?？偦蚪MDNA被用于所有的PCR反應。所有的擴增子在0.8%的瓊脂糖膠上經(jīng)溴化乙錠染色得以顯示。通過直接使用QIAquick PCR Purification 試劑盒(cat&num ;28104, QiagenInc.)純化 PCR樣品，或使用 QIAquick Gel Extraction 試劑盒(cat#28704, Qiagen Inc.)從膠上提取合適的片斷，來制備DNA，用以測序。使用DNA序列分析儀(ABI Prism 377, PEBiosystems, Foster City, CA)和 DNASTAR 序列分析軟件(DNASTAR Inc.，Madison, WI)來生產(chǎn)DNA序列。使用TOPO TA Cloning 試劑盒(Invitrogen)，將來自 M0N88913 轉(zhuǎn)基因 / 基因組插入物的側(cè)翼區(qū)域的DNA片段進行亞克隆。圖4顯示5'轉(zhuǎn)基因/基因組區(qū)域的DNA序列，圖5顯示3'轉(zhuǎn)基因/基因組區(qū)域。在圖4和5顯示的DNA序列中，轉(zhuǎn)基因插入序列以斜體子表示。 實施例4使用DNA事件引物對來生產(chǎn)診斷棉花事件M0N88913基因組的擴增子。診斷M0N88913基因組的擴增子包含至少一個連接序列、SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2。可產(chǎn)生診斷M0N88913的擴增子的引物對，當用于表2中列出的方法時，引物對包括但不限于Y擴增子序列的SEQID NO:14和SEQ ID NO:15，以及3'擴增子序列的SEQ ID NO:16和SEQ IDNO:17o除了這些引物外，同源于或互補于SEQ ID NO:3或SEQID NO:4的任何引物對，其可在DNA擴增反應中產(chǎn)生用于診斷Μ0Ν88913的擴增子，也是本發(fā)明的一個方面。含有可用于DNA擴增反應中產(chǎn)生用于診斷Μ0Ν88913的擴增子的SEQ ID NO:3或其互補序列上至少11個連續(xù)核苷酸的任何單個的分離的DNA多核酸引物分子也是本發(fā)明的一個方面。含有可用于DNA擴增反應中產(chǎn)生用于診斷Μ0Ν88913的擴增子的SEQ ID NO:4或其互補序列上至少11個連續(xù)核苷酸的任何一個分離的DNA多核酸引物分子也是本發(fā)明的一方面。表2和表3顯示用于分析的擴增條件的實例。然而，使用DNA引物的方法的任何改良都在本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)范圍內(nèi)，所述DNA引物同源于或互補于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或Μ0Ν88913的轉(zhuǎn)基因插入物中包含的遺傳組件的DNA序列，并可生產(chǎn)用于診斷Μ0Ν88913的擴增子。診斷性擴增子包含同源于或互補于至少一個轉(zhuǎn)基因/基因組連接DNA(SEQID NO:1或SEQ IDNO:2)或其基本部分的DNA分子。對事件Μ0Ν88913植物組織樣品的分析應包括來自事件Μ0Ν88913的陽性組織對照、來自非事件Μ0Ν88913的棉花植物的陰性對照和不含棉花基因組DNA的陰性對照。通過DNA擴增方法領(lǐng)域的技術(shù)人員，可從SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中選擇額外的引物序列，以及通過表2和表3中所示的方法，所選擇的用于生產(chǎn)擴增子的條件可以不同，但產(chǎn)生用于診斷事件M0N88913的擴增子。根據(jù)對表2和3的方法作出修改的這些DNA引物序列的用途被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的一方面是通過來源于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的至少一條DNA引物序列所生產(chǎn)的擴增子，所述擴增子用于診斷M0N88913。本發(fā)明的一個方面是含有至少一個源于SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4的DNA引物的DNA檢測試劑盒，當所述引物被用于DNA擴增反應中時，可生產(chǎn)用于診斷M0N88913的擴增子。本發(fā)明的一方面是通過至少一條來源于PM0N51915的任何遺傳組件的引物序列所生產(chǎn)的擴增子，所述擴增子用于診斷M0N88913。棉花植物或種子是本發(fā)明的一個方面，其中當其基因組在DNA擴增方法中進行測試時，產(chǎn)生包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的擴增子。對M0N88913擴增子的分析可以通過使用Stratagene Robocycler、MJ Engine、Perkin_Elmer9700 或如表 3 中所不的 Eppendorf Mastercycler Gradient thermocycler或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和設(shè)備進行。表2.用于鑒定M0N88913的Y轉(zhuǎn)基因插入/基因組連接區(qū)域的PCR程序和反應混合物條件。
權(quán)利要求
1.包含選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 和 SEQID NO:4 的序列的核酸分子，其中所述核酸分子還包含編碼草甘膦耐受性EPSPS的序列。
2.權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述序列為SEQID NO:1。
3.權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述序列為SEQID NO:2。
4.權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述序列為SEQID NO:3。
5.權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述序列為SEQID NO:4。
6.定包含事件M0N88913的棉花植物的接合性的方法，包括: (a)將來自所述植物的包含DNA的樣品與包含SEQID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ IDNO:23的引物組進行接觸； (b)進行核酸擴增反應；和 (c)檢測該反應的產(chǎn)物， 其中包含事件M0N88913的棉花種子樣品以保藏號PTA-4854保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述棉花植物是棉花事件M0N88913的后代，且其中所述方法包括: (a)將包含棉花DNA 的樣品與包含 SEQ ID NO:2USEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQID NO:24和SEQ ID NO:25的引物組進行接觸； (b)進行核酸擴增反應；和 (C)檢測該反應的產(chǎn)物。
8.NA分子對，包含至少第一 DNA分子和不同于該第一 DNA分子的第二 DNA分子，其中所述DNA分子具有SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4或其互補序列的足夠長度的連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其可用于DNA擴增方法中以產(chǎn)生診斷棉花事件M0N88913的包含SEQ ID N0:1或SEQ ID NO:2的擴增子。
9.NA檢測試劑盒，包括至少一個由與SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4同源或互補的11個或更多個連續(xù)核苷酸組成的分子，當該分子被用于DNA擴增方法時，產(chǎn)生用于診斷棉花事件M0N88913的包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的擴增子。
10.測樣品中對應于棉花事件M0N88913的DNA存在的方法，該方法包括: (a)將包含DNA的樣品與權(quán)利要求8的DNA分子對進行接觸； (b)進行核酸擴增反應，由此產(chǎn)生包含SEQID NO:1或SEQ IDNO:2的診斷性擴增子；和 (C)檢測該診斷性擴增子。
全文摘要
本發(fā)明提供棉花植物事件MON 88913的組合物和種子。也提供了基于DNA序列測定棉花植物事件MON 88913的存在的分析方法以及該DNA序列作為分子標記在DNA檢測方法中的用途。
文檔編號C12N15/82GK103088017SQ20121048841
公開日2013年5月8日 申請日期2004年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月12日
發(fā)明者R·E·切爾尼, C·杜翁, J·L·哈特, S·A·胡伯, R·L·克里布, J·J·利斯特洛, A·B·馬滕斯, B·薩蒙斯 申請人:孟山都技術(shù)有限公司