專利名稱：一種提取畢赤酵母各生長時期總rna的改良方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學研究領(lǐng)域，為一種提取畢赤酵母各生長時期總RNA的改良方法。
背景技術(shù)：
巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的較為完善的，被廣泛用來表達外源蛋白的甲醇營養(yǎng)型酵母表達系統(tǒng)，外源蛋白在畢赤酵母中的過量表達，經(jīng)常伴隨著其他基因表達水平的改變，通過分析相關(guān)基因表達水平的差異，便于找到影響外源蛋白表達量的關(guān)鍵問題，而基因表達水平的分析常常涉及到總RNA的提取。與其他細胞相比，畢赤酵母由于具有較堅固的細胞壁，尤其是處于穩(wěn)定期的畢赤 酵母細胞，其細胞壁更厚、通透性差，這些因素都增加了總RNA的提取難度，而總RNA提取質(zhì)量直接會影響后續(xù)基因表達水平測定的準確性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提取畢赤酵母各生長時期總RNA的改良方法，用以解決分子研究中遇到的畢赤酵母細胞總RNA提取(尤其是穩(wěn)定期總RNA的提取)困難的問題。畢赤酵母總RNA的提取，關(guān)鍵問題是細胞壁的去除，酵母生長的不同時期，其細胞壁的厚度會發(fā)生變化，一般穩(wěn)定期較對數(shù)期的細胞壁要厚，這樣就使穩(wěn)定期總RNA的提取更加困難，但與基因組的提取不同，酵母總RNA提取之前的去壁處理不能用酶解法，因為此法需在37°C進行，該溫度會使酵母中某些基因的轉(zhuǎn)錄情況發(fā)生改變。針對以上問題，本發(fā)明研究出了一種較為快速且適用于畢赤酵母各生長時期總RNA提取的改良方法，此法在總RNA提取的純度與質(zhì)量上都滿足QRT-PCR的要求。本發(fā)明是在上海生工UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒的基礎(chǔ)上進行改良，即在抽提前，對畢赤酵母細胞的破碎進行改良通過畢赤酵母細胞和酸洗玻璃珠在液氮條件下共研磨，使畢赤酵母細胞充分破碎，此破碎方法適合各生長時期的畢赤酵母細胞。然后再利用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒中的的Trizol試劑，進行抽提及后續(xù)操作，經(jīng)過改良，提取的畢赤酵母總RNA，有清晰整齊的28SrRNA和18SrRNA條帶，并且成2倍關(guān)系，表明此法提取的總RNA完整，再通過核酸濃度測定儀測定，0D26(i/0D28(i = I. 9 2. 0，表明純度也滿足要求，綜上說明此法提取的總RNA質(zhì)量滿足QRT-PCR要求。本發(fā)明具體包括以下材料(I)畢赤酵母細胞破碎所需材料瓷研缽、液氮、酸洗玻璃珠(400nm)、Trizol試劑。(2)上海生工UNIQ-IO柱式Trizol總RNA抽提試劑盒組成為Trizol Reagent、RPE Solution、DEPC-treated ddH20、吸附柱和收集管。(3)其余試劑及耗材無水乙醇、氯仿、I. 5mL EP管、用O. 1% DEPC預處理的槍頭和EP管。本發(fā)明具體實驗步驟為
(I)取約I X IO7個待測畢赤酵母細胞(任何生長時期的細胞)于滅菌的I. 5mL EP管中，利用液氮法快速冷凍后凍存于_70°C冰箱。(2)先將瓷研缽用液氮預冷，然后倒入O. 3g酸洗玻璃珠。(3)向凍存的畢赤酵母細胞中加入50 μ L DEPC-treated ddH20，重懸菌體后轉(zhuǎn)入加有酸洗玻璃珠的預冷瓷研缽中。(4)倒入適量液氮，使細胞和酸洗玻璃珠共研磨，直至酸洗玻璃珠磨至粉末(約5min)，此研磨過程液氮揮發(fā)盡后，需及時補加液氮，整個過程要一直保持低溫狀態(tài)。(5)研磨完畢后，向其中加入O. 5mL Trizol試劑,室溫放置5min。(6)將研缽中所有物質(zhì)轉(zhuǎn)入1.5mLEP管中，用槍頭吹打2min后，室溫靜置 5_10mino(7)后續(xù)實驗步驟按上海生工UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒操作進行。本發(fā)明的主要優(yōu)點(I)與hot acid phenol方法相比,此法適用于畢赤酵母各生長時期總RNA的提取，即使對于細胞壁很厚的穩(wěn)定期細胞，此法仍然可以成功地提取出總RNA,提取結(jié)果穩(wěn)定。(2)此法提取的總RNA質(zhì)量好，有清晰整齊的28SrRNA和18SrRNA條帶，并且成2倍關(guān)系，且滿足OD26tZOD28tl在I. 8-2. I之間的純度要求，較少出現(xiàn)降解情況。


圖I :X-33和GSl 15畢赤酵母在72h和96h總RNA的提取結(jié)果。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。實施例1X-33和GSl 15畢赤酵母細胞在72h和96h總RNA的提取總RNA提取所需材料(I)畢赤酵母細胞破碎所需材料瓷研缽、液氮、酸洗玻璃珠(400nm)、Trizol試劑。(2)上海生工UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒組成為Trizol Reagent、RPE Solution、DEPC-treated ddH20、吸附柱和收集管。(3)其余試劑及耗材無水乙醇、氯仿、I. 5mL EP管、用O. 1% DEPC預處理的槍頭和EP管?？俁NA提取具體步驟為(I)分別取約1父107個乂-33(7211和9611)或GS115 (72h和96h)細胞于滅菌的
I.5mL EP管中，利用液氮法快速冷凍后凍存于_70°C冰箱。(2)先將瓷研缽用液氮預冷，然后倒入O. 3g酸洗玻璃珠。(3)向凍存的畢赤酵母細胞中加入50 μ L DEPC-treated ddH20，重懸菌體后轉(zhuǎn)入加有酸洗玻璃珠的預冷瓷研缽中。(4)倒入適量液氮，使細胞和酸洗玻璃珠共研磨，直至酸洗玻璃珠磨至粉末(約5min)，此研磨過程液氮揮發(fā)盡后，需及時補加液氮，整個過程要一直保持低溫狀態(tài)。(5)研磨完畢后，向其中加入O. 5mL Trizol試劑,室溫放置5min。(6)將研缽中所有物質(zhì)轉(zhuǎn)入I. 5mL EP管中，用槍頭吹打2min后，室溫靜置5_10mino
(7)后續(xù)實驗步驟按上海生工UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒操作進行。結(jié)果如圖I 所示。其中 1-4 孔道分別為X-33-72h、X_33_96h、GS115_72h、GS115-96h的RNA提取結(jié)果。操作中還應(yīng)注意I.在RNA提取的整個過程中，要防止RNase的污染(I)提取RNA所需的槍頭和EP管和水，都需要O. I % DEPC進行預處理。(2)提取RNA的整個過程，需要佩戴手套和口罩，并且要常換，操作需要避免交叉 污染。(3)提取好的RNA要保存于_70°C冰箱中，并且避免反復凍融，以避免影響RNA的降解。(4)所有離心步驟均使用臺式離心機，在4°C下進行離心。
權(quán)利要求
1.一種可以提取畢赤酵母各生長時期總RNA的改良方法，其特征在于包括以下材料 (1)畢赤酵母細胞破碎所需材料瓷研缽、液氮、酸洗玻璃珠(400nm)、Trizol試劑。
(2)上海生工UNIQ-IO柱式Trizol總RNA抽提試劑盒組成為TrizolReagent、RPESolution、DEPC-treated ddH20、吸附柱和收集管。(3)其余試劑及耗材無水乙醇、氯仿、I.5mL EP管、0. I % DEPC預處理的槍頭和EP管。
2.權(quán)利要求I所述的提取畢赤酵母各生長時期總RNA改良方法，其特征在于按如下步驟操作 (1)取約IX IO7個待測畢赤酵母細胞(任何生長時期的細胞)于滅菌的I. 5mL EP管中，利用液氮法快速冷凍后凍存于_70°C冰箱。
(2)先將瓷研缽用液氮預冷，然后倒入0.3g酸洗玻璃珠。(3)向凍存的畢赤酵母細胞中加入50ii L DEPC-treated ddH20，重懸菌體后轉(zhuǎn)入加有酸洗玻璃珠的預冷瓷研缽中。
(4)倒入適量液氮，使細胞和酸洗玻璃珠共研磨，直至酸洗玻璃珠磨至粉末(約5min)，此研磨過程液氮揮發(fā)盡后，需及時補加液氮，確保整個過程一直保持低溫狀態(tài)。
(5)研磨完畢后，向其中加入0.5mLTrizol試劑,室溫放置5min。(6)將研缽中所有物質(zhì)轉(zhuǎn)入I.5mLEP管中，用槍頭吹打2min后，室溫靜置5_10min。
(7)后續(xù)實驗步驟按上海生工UNIQ-IO柱式Trizol總RNA抽提試劑盒操作進行。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域，為一種提取畢赤酵母各生長時期總RNA的改良方法，用以解決分子研究中遇到的畢赤酵母細胞總RNA提取困難的問題。本發(fā)明是在上海生工UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒的基礎(chǔ)上進行改良，與hot acid phenol提取總RNA的方法相比，此法適用于畢赤酵母各生長時期總RNA的提取，即使對于細胞壁很厚的穩(wěn)定期細胞，此法仍然可以成功地提取出總RNA，提取結(jié)果穩(wěn)定；再有此法提取的總RNA質(zhì)量好，有清晰整齊的28SrRNA和18SrRNA條帶，并且成2倍關(guān)系，還有滿足OD260/OD280在1.8-2.1之間的純度要求，較少出現(xiàn)降解情況，滿足QRT-PCR測定的要求。
文檔編號C12N15/10GK102965366SQ20121048775
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月27日
發(fā)明者劉立明, 龔香藝, 馬冬玲, 王蒙, 馮斌 申請人:江南大學