專(zhuān)利名稱(chēng)：：兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白基因重組腺病毒及疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白基因重組腺病毒及疫苗，屬于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：兔病毒性出血癥，又稱(chēng)兔瘟，是由兔病毒性出血癥病毒(RHDV)引起的一種以急性、高度傳染性、大面積死亡為特征的兔傳染病，感染兔通常4872h死亡，主要特征為傳染性極強(qiáng)、呼吸系統(tǒng)出血、肝壞死、臟器水腫、淤血和出血等變化，給全世界養(yǎng)兔業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)際獸醫(yī)局將該病列為B類(lèi)傳染病，我國(guó)農(nóng)業(yè)部96號(hào)令頒布為二類(lèi)疫病。RHD出現(xiàn)比較突然且流行速度極快，現(xiàn)有研究結(jié)果表明世界范圍內(nèi)的所有RHDV分離株均為同一血清型，無(wú)論是遺傳特性還是抗原性都很穩(wěn)定。目前用兔病毒性出血癥組織滅活疫苗免疫是預(yù)防該病的主要措施，疫苗的制備過(guò)程中必須以RHDV感染致死的兔內(nèi)臟組織為原料。近年來(lái)，隨著兔產(chǎn)品等行業(yè)的興起以及其他動(dòng)物疫苗等對(duì)家兔的需求的增加，市場(chǎng)對(duì)兔病毒性出血癥疫苗的需求量增加了許多，但是用于制備組織滅活疫苗的非免疫兔的供應(yīng)量卻很不穩(wěn)定，造成傳統(tǒng)的組織滅活苗的成本不斷增加，加之組織滅活苗存在散播強(qiáng)毒的潛在危險(xiǎn)等種種缺點(diǎn)，而RHDV至今沒(méi)有在細(xì)胞上傳代成功，嚴(yán)重制約了更加安全、穩(wěn)定的兔病毒性出血癥疫苗的研制與生產(chǎn)，使人們對(duì)兔病毒性出血癥疫苗的研究轉(zhuǎn)向了既能起到保護(hù)作用，又能解決生物安全問(wèn)題的基因工程疫苗的研制。近年來(lái)的研究認(rèn)為，RHDV屬杯狀病毒，含有一條單股正鏈RNA，由7437個(gè)核苷酸組成，與一般的杯狀病毒不同，RHDV只有2個(gè)開(kāi)放閱讀框架(ORF)，并由0RFI的3'端部分序列編碼RHDV衣殼蛋白VP60，其基因片段長(zhǎng)度為1740bp，共編碼580個(gè)氨基酸，VP60是RHDV唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，與誘導(dǎo)抗病毒感染的免疫反應(yīng)直接相關(guān)。腺病毒表達(dá)載體系統(tǒng)是一種表達(dá)、遞呈外源抗原的有效系統(tǒng)，重組病毒可激發(fā)人和多種動(dòng)物特異性體液和細(xì)胞免疫。病毒表達(dá)載體具有許多優(yōu)點(diǎn)，表達(dá)的蛋白經(jīng)折疊和修飾后活性良好，目前腺病毒活疫苗已在美國(guó)批準(zhǔn)使用，證明是安全、有效的，不易發(fā)生基因整合。因此，利用該系統(tǒng)表達(dá)的VP60蛋白制備成基因工程苗具有廣闊的前景。另外，腺病毒可在腸道復(fù)制也可在呼吸道復(fù)制，還具有口服疫苗的發(fā)展前景。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建腺病毒重組載體，轉(zhuǎn)染HEK293-A細(xì)胞，使VP60基因獲得表達(dá)，提供一種免疫效果好、工藝簡(jiǎn)便的兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白基因工程疫苗及其制備方法。技術(shù)方案本發(fā)明是通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白VP60全基因，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建腺病毒重組載體，轉(zhuǎn)染HEK293-A細(xì)胞，使VP60基因獲得表達(dá)，然后以重組腺病毒表達(dá)的兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白VP60作為抗原，加上相應(yīng)的佐劑制成預(yù)防兔病毒性出血癥的基因工程疫苗。本發(fā)明采用的具體技術(shù)路線(xiàn)包括以下三個(gè)方面一、表達(dá)兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白VP60的重組腺病毒的獲得1)兔病毒性出血癥病毒總RNA的提取用DEPC處理過(guò)的水按體積比1:10加入發(fā)生兔病毒性出血癥的兔肝臟組織中，研磨成懸液，裝入用DEPC處理過(guò)的1.5mLEP管中，于-2(TC反復(fù)凍融3次，在高速冷凍離心機(jī)上，以7200r/min，離心20min，取上清200叱，加入Trizol800叱，振蕩混勻后，室溫放置10min，加入氯仿210^L，劇烈振蕩后，室溫放置1min，4°C，10000r/min離心15min，取上層水相750叱，加入O.5mL異丙醇，混勻，-20。C放置15min，4°C10000r/min離心10min，去上清，緩緩加入75%乙醇1mL洗滌，4°C8000r/min離心5min，去上清，室溫干燥20min，加入DEPC水IOPL，使充分溶解；2)設(shè)計(jì)合成以下引物P3:5，-CTAGGTACCATGGAGGGCAAA-3，KpnlP4:5，-GCACTCGAGTCAGACATAAGAAA—3'XhoI3)擴(kuò)增衣殼蛋白VP60基因反轉(zhuǎn)錄體系為lOXBuffer2p1、10mMdNTPs2ii1、下游引物lul、RNA酶抑制劑0.5u1、RNA模板12u1，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5y1，DEPC7_K2u1，總體積為20u1，瞬間離心混勻，65。C反應(yīng)15min，42。C孵育lh，95。C5min，-20。C保存?zhèn)溆茫籔CR反應(yīng)體系為10XReactionbuffer2.5ul、25mMMgCl2l,5ul、2.5mMdNTPS0.5ul、50mMPI0.5ul、50mMP20.5ul、模板RNA4.0ul、ddH2015yl、EXTaqTMpolymerase0.5ul，總體積25ul，瞬間離心混勻，采用熱蓋進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)94。C變性3min，94。C變性lmin，57。C退火lmin，72。C延伸2min，30個(gè)循環(huán)后，72°C延伸10min，結(jié)束反應(yīng)；對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得的衣殼蛋白VP60基因擴(kuò)增片斷大小為1740bp;4)重組腺病毒質(zhì)粒pAd-VP60的構(gòu)建將擴(kuò)增的VP60基因先克隆入腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV，獲得重組質(zhì)粒pShuttle-CMV-VP60，把重組質(zhì)粒pShuttle-CMV-VP60用PmeI線(xiàn)性化，并與腺病毒骨架載體pAd共同電轉(zhuǎn)化BJ5183細(xì)胞，經(jīng)PacI酶切鑒定，獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒pAd-VP60;5)轉(zhuǎn)染將重組腺病毒質(zhì)粒pAd-VP60轉(zhuǎn)染HEK293-A細(xì)胞，經(jīng)鑒定純化獲得重組病毒，并凍存于4。C、-20。C和液氮中；6)重組病毒的鑒定(1)RT-PCR鑒定收集感染重組病毒的細(xì)胞，以目的基因上下游引物進(jìn)行RT-PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示電泳條帶為1740bp，與目的基因大小一致，說(shuō)明目的基因已經(jīng)隨病毒基因組整合入細(xì)胞中。(2)表達(dá)產(chǎn)物的鑒定間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA)將重組病毒接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，培養(yǎng)至發(fā)生病變時(shí)用間接免疫熒光法(IFA)檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，重組感染的細(xì)胞具有很強(qiáng)的特異性熒光，而對(duì)照組細(xì)胞無(wú)特異的熒光，說(shuō)明VP60蛋白得到表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物存在于細(xì)胞內(nèi)。血凝試驗(yàn)(HA)和血凝抑制試驗(yàn)重組病毒感染細(xì)胞裂解上清和細(xì)胞培養(yǎng)上清均能凝集1%人"0"型紅細(xì)胞懸液。同時(shí)表達(dá)的VP60蛋白的血凝特性可被RHDV高免血清所抑制，表明表達(dá)的VP60蛋白具有與RHDV相似的血凝活性。重組病毒真核表達(dá)的病毒性出血癥病毒衣殼蛋白可用作兔病毒性出血癥的診斷抗原方面。二、表達(dá)重組兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白的動(dòng)物免疫保護(hù)效果測(cè)定重組兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白的HA效價(jià)，用滅菌生理鹽水稀釋至HA效價(jià)在26-28之間，按比例加入氫氧化鋁膠佐劑，按不同劑量分組免疫非免疫家兔，并設(shè)對(duì)照組，于免疫后第22天以HA效價(jià)大于10的RHDV強(qiáng)毒肝臟懸液lmL攻擊，觀(guān)察14天，并記錄結(jié)果，結(jié)果顯示，免疫HA效價(jià)26重組蛋白l毫升的家兔就能抵抗兔病毒性出血癥強(qiáng)毒的攻擊。三、疫苗制備培養(yǎng)HEK293-A細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種相應(yīng)重組病毒，等細(xì)胞有病變后5天收毒，測(cè)血凝HA效價(jià)，用滅菌磷酸鹽緩沖溶液PBSPH7.2調(diào)整抗原溶液，以2%。甲醛溶液滅活后按抗原鋁膠佐劑為9:1比例加入佐劑，混勻，即為獲得的兔病毒性出血癥基因工程疫苗。有益效果本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)如下本發(fā)明選取兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白VP60全基因作為目的基因進(jìn)行表達(dá)，原因是此蛋白能誘導(dǎo)抗病毒性出血癥病毒感染免疫反應(yīng)，而且此蛋白是病毒性出血癥病毒的唯一結(jié)構(gòu)蛋白，具有良好的免疫原性；真核表達(dá)系統(tǒng)具有類(lèi)似于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的翻譯后修飾功能，使重組衣殼蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白，試驗(yàn)的結(jié)果顯示，表達(dá)的蛋白具有與病毒性出血癥病毒相同的生物活性，同時(shí)真核表達(dá)載體系統(tǒng)是一種表達(dá)、遞呈外源抗原的有效系統(tǒng)，重組病毒可激發(fā)人和多種動(dòng)物特異性體液和細(xì)胞免疫。目前腺病毒活疫苗己在美國(guó)批準(zhǔn)使用，證明是安全、有效的，不易發(fā)生基因整合。因此，利用此系統(tǒng)表達(dá)的VP60蛋白制備成基因工程疫苗具有很好的生物安全性；表達(dá)的重組蛋白無(wú)需特殊處理純化就可用于疫苗配制，操作簡(jiǎn)便。事實(shí)證明，本發(fā)明表達(dá)的重組蛋白具有良好的抗原性和與兔病毒性出血癥病毒相似的血凝活性，因此是很好的兔病毒性出血癥疫苗抗原。動(dòng)物免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示，用重組兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白制成的疫苗免疫非免疫家兔，免疫后以RHD強(qiáng)毒攻擊，免疫家兔獲得100%的保護(hù)作用，說(shuō)明本發(fā)明在實(shí)際應(yīng)用中具有良好的免疫效力，在兔病毒性出血癥預(yù)防控制方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)具備良好的生物安全性。圖1腺病毒表達(dá)系統(tǒng)RHDVVP60基因RT-PCR結(jié)果1.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL-2000);2.RT-PCR產(chǎn)物圖2腺病毒表達(dá)系統(tǒng)pShuttle-CMV-VP60的酶切鑒定l.DL15000Marker;2.DL2000Marker;3.pShuttle-CMV-VP60(KpnI/XhoI)圖3腺病毒表達(dá)系統(tǒng)重組pAd-VP60酶切鑒定結(jié)果1.pAd-VP60(Pac1);2.DL15000Marker圖4腺病毒表達(dá)系統(tǒng)中重組腺病毒感染HEK293-A細(xì)胞的間接免疫熒光結(jié)果具體實(shí)施例方式一、兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白VP60基因的擴(kuò)增和T/A克隆1、兔病毒性出血癥病毒(RHDV)總RNA的提取用DEPC(diethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯)處理過(guò)的水按體積比1:10加入發(fā)生兔病毒性出血癥的兔肝臟組織中，研磨成懸液，裝入用DEPC處理過(guò)的1.5mLEP管中，于-20。C反復(fù)凍融3次，在高速冷凍離心機(jī)上，以7200r/min，離心20min，取上清200叱，加入Trizol(TaKaRa公司)800叱，振蕩混勻后，室溫放置10min，加入氯仿210叱，劇烈振蕩后，室溫放置1min，4'C，10000r/min離心15min，取上層水相750l^L，加入O.5mL異丙醇，混勻，-20。C放置15min，4°C10000r/min離心IOmin，去上清，緩緩加入75%乙醇1mL洗滌，4°C8000r/min離心5min,去上清，室溫干燥20min，加入DEPC水IO^L，使充分溶解。2、設(shè)計(jì)合成引物根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的RHDV基因組序列VP60序列(M67473),利用Primer5.0軟件自行設(shè)計(jì)，由大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)合成引物.-P3:5，-CTAGGTACCATGGAGGGCAAA-3，(Kpnl)P4:5，-GCACTCGAGTCAGACATAAGAAA_3，(XhoI)下劃線(xiàn)部分為酶切位點(diǎn)3、擴(kuò)增衣殼蛋白VP60基因反轉(zhuǎn)錄體系為lOXBuffer2ul、lOraMdNTPs2u1、下游引物lul、RNA酶抑制劑0.5U1、RNA模板12u1，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5u1，H20(DEPC處理)2y1，總體積為20u1,瞬間離心混勻，65。C反應(yīng)15min，42。C孵育lh，95。C5min，-20。C保存?zhèn)溆谩CR反應(yīng)體系為:lOXReactionbuffer2.5pl、25mMMgCl21.5ul、2.5mMdNTPS0.5ul、50mMPl0.5ul、50mMP20.5ul、模板RNA4.0ul、ddH2015ul、EXTaqTMpolymerase0.5ul，總體積25ul，瞬間離心混勻，采用熱蓋進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)94。C變性3min，94。C變性lmin，57。C退火lmin，72。C延伸2min，30個(gè)循環(huán)后，72°C延伸10min，結(jié)束反應(yīng)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得的衣殼蛋白VP60基因擴(kuò)增片斷大小為1740bp;4、T/A克隆與鑒定電泳后將目的片段切下，采用核酸凝膠回收試劑盒GelExtractionKit(TaKaRa公司)進(jìn)行純化PCR產(chǎn)物，然后按照pMD-19T-Vector試劑盒說(shuō)明，將目的片段克隆入pMD-19T-Vector(TaKaRa公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(^sc力en'c/w'aDH5a感受態(tài)細(xì)胞。挑選單菌落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，經(jīng)相應(yīng)限制性酶切及電泳鑒定，獲得重組質(zhì)粒pMD-19T-VP60，陽(yáng)性克隆送至TaKaRa(大連市)進(jìn)行測(cè)序。5、擴(kuò)增的VP60基因的序列比較與分析利用DNAstar5.0序列分析軟件對(duì)VP60的測(cè)序結(jié)果與GenBank上發(fā)表的VP60基因進(jìn)行核苷酸序列的同源性分析。二、重組腺病毒質(zhì)粒pAd-VP60的構(gòu)建將含有目的片斷的pMD-19T-VP60質(zhì)粒與腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV(購(gòu)自Stratagene公司)同時(shí)進(jìn)行KpnI和XhoI雙酶切后，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，雙酶切鑒定后獲得重組質(zhì)粒pShuttle-CMV-VP60。把重組質(zhì)粒pShuttle-CMV-VP60用PmeI線(xiàn)性化，并與腺病毒骨架載體pAdEasy-l共同電轉(zhuǎn)化BJ5183細(xì)胞(購(gòu)自Stratagene公司)經(jīng)PacI酶切鑒定，獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒，構(gòu)建出腺病毒重組質(zhì)粒pAd-VP60。三、轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得重組病毒1轉(zhuǎn)染細(xì)胞和純化轉(zhuǎn)染前一天鋪HEK293-A細(xì)胞到24孔板里過(guò)夜培養(yǎng),第二天換無(wú)血清的DMEM，37°C5%C02溫箱中培養(yǎng)2h,每一孔取PacI酶切線(xiàn)性化的重組質(zhì)粒pAd-VP605"L，脂質(zhì)體2uL，各用轉(zhuǎn)染稀釋液稀釋至50uL，輕輕混勻，放置20min，加入對(duì)應(yīng)的細(xì)胞孔中，37。C孵育。46小時(shí)后換2X血清的DMEMlml，每天觀(guān)察細(xì)胞病變。將第一代病毒液凍融兩次后以1%體積比接種HEK293-A細(xì)胞傳代，得到第2代重組病毒。以第2代重組病毒為毒種進(jìn)行一次蝕斑純化。2鑒定(1)RT-PCR檢測(cè)mRNA將接種重組腺病毒細(xì)胞和未接種重組腺病毒細(xì)胞各一瓶，反復(fù)凍融2次，取200微升提取RNA，以目的基因上下游引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示從接種重組腺病毒細(xì)胞中擴(kuò)增出VP60基因條帶，大小為1740bp;而未接種重組腺病毒細(xì)胞則沒(méi)有，說(shuō)明目的基因已經(jīng)隨腺病毒基因組整合入HEK293-A細(xì)胞中。(2)表達(dá)產(chǎn)物的鑒定間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，將純化的重組病毒接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞HEK293-A24小時(shí)后，與一瓶正常HEK293-A同時(shí)以l:40稀釋度的兔免疫血清為一抗，1:100稀釋度的熒光標(biāo)記羊抗兔IgG為二抗，進(jìn)行間接免疫熒光染色檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，重組腺病毒感染的細(xì)胞HEK293-A具有很強(qiáng)的特異性熒光，而對(duì)照組細(xì)胞無(wú)特異的熒光，說(shuō)明VP60蛋白得到表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物存在于HEK293-A細(xì)胞內(nèi)。血凝試驗(yàn)(HA)和血凝抑制(HI)試驗(yàn)分別取感染重組病毒的細(xì)胞裂解上清和細(xì)胞培養(yǎng)上清50u1于圓底大孔血凝板以生理鹽水作2X倍比稀釋后，加入等體積1%人"0"型紅細(xì)胞懸液，振蕩均勻后，置于4。C作用45分鐘，觀(guān)察結(jié)果(HA)，同時(shí)以其他重組桿狀病毒作為陰性對(duì)照，以RHD病兔肝臟1:5勻漿上清作為陽(yáng)性對(duì)照。另外，于圓底大孔血凝板加入50"LRHDV血清，然后以生理鹽水作2X倍比稀釋后，加入4個(gè)血凝單位的表達(dá)蛋白于每孔，將血凝板置37"C作用30分鐘，每孔加1%人"0"型紅細(xì)胞懸液50u1，立即搖勻，置4。C作用45分鐘，觀(guān)察結(jié)果(HI)。結(jié)果顯示，重組病毒感染細(xì)胞裂解上清和細(xì)胞培養(yǎng)上清均能凝集1%人"0"型紅細(xì)胞懸液，RHD病兔肝臟1:5勻漿上清能凝集紅細(xì)胞懸液，表明表達(dá)的VP60蛋白具有與RHDV—樣的血凝特性。當(dāng)接種重組病毒后4天收毒，發(fā)現(xiàn)感染細(xì)胞裂解上清和細(xì)胞培養(yǎng)上清血凝效價(jià)均可達(dá)26以上。同時(shí)表達(dá)的VP60蛋白的血凝特性可被RHDV高免血清所抑制，表明表達(dá)的VP60蛋白具有與RHDV相似的生物學(xué)活性。四免疫保護(hù)試驗(yàn)1免疫抗原的制備將重組腺病毒接種于HEK293-A細(xì)胞，4天后收毒，測(cè)表達(dá)蛋白的HA效價(jià)，用無(wú)菌滅菌生理鹽水將重組腺病毒表達(dá)產(chǎn)物稀釋至HA效價(jià)26。2試驗(yàn)動(dòng)物分組、接種及攻毒將15只非免疫家兔于免疫前采血測(cè)HA效價(jià)，并分成3組，每組5只，第一組注射lmL上述抗原，第二組注射2mL上述抗原，第三組注射3mL上述抗原，第四組作為對(duì)照組，注射生理鹽水，免疫期間每隔7天采一次血并測(cè)HI效價(jià)，于免疫后第22天以HA效價(jià)大于10的RHD強(qiáng)毒肝臟懸液(肝組織滅菌生理鹽水=1:9)lmL攻擊，觀(guān)察14天，并記錄結(jié)果。3試驗(yàn)結(jié)果15只非免疫家兔于免疫前采血測(cè)HI效價(jià)在2。23，第一組、第二組、第三組于攻毒后14天內(nèi)全部健活，保護(hù)率為100%,這三組家兔在攻毒前血清HI效價(jià)在2527之間，第四組攻毒后三天內(nèi)全部死亡，癥狀為典型的兔病毒性出血癥(表2)。表2不同劑量免疫后對(duì)RHDV的保護(hù)性<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>五、疫苗制備培養(yǎng)HEK293-A細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種相應(yīng)重組病毒，等細(xì)胞有病變后5天收毒，測(cè)血凝HA效價(jià)，用滅菌磷酸鹽緩沖溶液PBSPH7.2調(diào)整抗原溶液，以2%。甲醛溶液滅活后按抗原鋁膠佐劑為9:1比例加入佐劑，混勻，即為獲得的兔病毒性出血癥基因工程疫苗。動(dòng)物免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示，用重組兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白制成的疫苗免疫非免疫家兔，免疫后以RHD強(qiáng)毒攻擊，免疫家兔獲得100%的保護(hù)作用，說(shuō)明本發(fā)明在實(shí)際應(yīng)用中具有良好的免疫效力，在兔病毒性出血癥預(yù)防控制方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)具備良好的生物安全性。序列表<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120>兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白基因重組腺病毒及疫苗<130>說(shuō)明書(shū)<140>00<141>2008-01-12<160>2<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工合成<220><221>引物<222>(1)..(21)<223><400>1ctaggtaccatggagggcaaa21<210>2<211>23<212>DNA<213>人工合成<220><221>引物<222>(1)..(23)<223><400>2gcactcgagtcagacataagaaa2權(quán)利要求1.兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白基因重組腺病毒，其特征是，由以下步驟構(gòu)建而成1)兔病毒性出血癥病毒總RNA的提取用DEPC處理過(guò)的水按體積比1∶10加入發(fā)生兔病毒性出血癥的兔肝臟組織中，研磨成懸液，裝入用DEPC處理過(guò)的1.5mLEP管中，于-20℃反復(fù)凍融3次，在高速冷凍離心機(jī)上，以7200r/min，離心20min，取上清200μL，加入Trizol800μL，振蕩混勻后，室溫放置10min，加入氯仿210μL，劇烈振蕩后，室溫放置1min，4℃，10000r/min離心15min，取上層水相750μL，加入0.5mL異丙醇，混勻，-20℃放置15min，4℃10000r/min離心10min，去上清，緩緩加入75％乙醇1mL洗滌，4℃8000r/min離心5min，去上清，室溫干燥20min，加入DEPC水10μL，使充分溶解；2)設(shè)計(jì)合成以下引物P35’-CTAGGTACCATGGAGGGCAAA-3’KpnIP45’-GCACTCGAGTCAGACATAAGAAA-3’XhoI3)擴(kuò)增衣殼蛋白VP60基因反轉(zhuǎn)錄體系為10×Buffer2μl、10mMdNTPs2μl、下游引物1μl、RNA酶抑制劑0.5μl、RNA模板12μl，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，DEPC水2μl，總體積為20μl，瞬間離心混勻，65℃反應(yīng)15min，42℃孵育1h，95℃5min，-20℃保存?zhèn)溆?；PCR反應(yīng)體系為10×Reactionbuffer2.5μl、25mMMgCl21.5μl、2.5mMdNTPS0.5μl、50mMP10.5μl、50mMP20.5μl、模板RNA4.0μl、ddH2O15μl、EXTaqTMpolymerase0.5μl，總體積25μl，瞬間離心混勻，采用熱蓋進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)94℃變性3min，94℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min，結(jié)束反應(yīng)；對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得的衣殼蛋白VP60基因擴(kuò)增片斷大小為1740bp；4)重組腺病毒質(zhì)粒pAd-VP60的構(gòu)建將擴(kuò)增的VP60基因先克隆入腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV，獲得重組質(zhì)粒pShuttle-CMV-VP60，把重組質(zhì)粒pShuttle-CMV-VP60用PmeI線(xiàn)性化，并與腺病毒骨架載體pAd共同電轉(zhuǎn)化BJ5183細(xì)胞，經(jīng)PacI酶切鑒定，獲得陽(yáng)性重組腺病毒質(zhì)粒pAd-VP60。5)轉(zhuǎn)染將重組腺病毒質(zhì)粒pAd-VP60轉(zhuǎn)染HEK293-A細(xì)胞，經(jīng)鑒定純化獲得重組病毒，并凍存于4℃、-20℃和液氮中。2、用權(quán)利要求1所述兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白基因重組腺病毒制備的疫苗。3、權(quán)利要求2所述疫苗的制備方法，包括培養(yǎng)服K293-A細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種相應(yīng)重組病毒，等細(xì)胞有病變后5天收毒，測(cè)血凝HA效價(jià)，用滅菌磷酸鹽緩沖溶液PBSPH7.2調(diào)整抗原溶液，以2%。甲醛溶液滅活后按抗原鋁膠佐劑為9:1比例加入佐劑，混勻，即為獲得的兔病毒性出血癥基因工程疫苗。4、權(quán)利要求1所述重兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白基因重組腺病毒真核表達(dá)的病毒性出血癥病毒衣殼蛋白在制備兔病毒性出血癥診斷抗原方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白基因重組腺病毒及疫苗，屬于生物制藥領(lǐng)域。通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白VP60全基因，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建腺病毒重組載體，轉(zhuǎn)染HEK293-A細(xì)胞，使VP60基因獲得表達(dá)，然后以重組腺病毒表達(dá)的兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白VP60作為抗原，加上相應(yīng)的佐劑制成兔病毒性出血癥的基因工程疫苗。本發(fā)明可以提供一種免疫效果好、工藝簡(jiǎn)便的兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白基因工程疫苗，用于預(yù)防控制兔病毒性出血癥。文檔編號(hào)C12N15/861GK101215575SQ200810019268公開(kāi)日2008年7月9日申請(qǐng)日期2008年1月18日優(yōu)先權(quán)日2008年1月18日發(fā)明者何孔旺,張則斌,徐為中,芳王,波胡,范志宇,薛家兵申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院